形成金黃色葡萄球菌表位結合位點的肽或肽的組合的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明關注形成金黃色葡萄球菌表位結合位點的肽或肽的組合，所述結合位點包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中，所述第一氨基酸序列與序列SEQ?ID?NO:1至少88%一致；并且其中，所述第二氨基酸序列與序列SEQ?ID?NO:2至少88%一致。
【專利說明】形成金黃色葡萄球菌表位結合位點的肽或肽的組合
【技術領域】
[0001]本發(fā)明關注形成金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus=S.aureus)表位結合位點的肽或肽的組合(arrangement of peptides)、含有該肽或肽的組合的試劑盒、該肽或肽的組合的用途、生產(chǎn)包含該肽或肽的組合的抗體的細胞系、以及治療方法。
【背景技術】
[0002]從W02010/133600A1中知曉了針對金黃色葡萄球菌IsaA表位的抗體或其片段。這些抗體具有由具有第一可變區(qū)的重鏈和具有第二可變區(qū)的輕鏈所形成的結合位點，其中，所述第一可變區(qū)的序列可為SEQ ID NO: 13，所述第二可變區(qū)的序列可為SEQ IDNO: 14。在哺乳動物中針對(vis-0-vis)金黃色葡萄球菌的抗體的效力取決于由吞噬血細胞(phagocytizing blood cells)通過吞曬對金黃色葡萄球菌的殺滅。由W02010/133600A1中已知的抗體促進了吞噬過程。相比非特異性的對照抗體，在有IsaA表位特異性抗體存在的情況下孵育30分鐘后，由人中性粒細胞造成的金黃色葡萄球菌的殺滅增強了約25%-30%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供金黃色葡萄球菌表位結合位點，所述金黃色葡萄球菌表位結合位點在關于由吞噬血細胞殺滅金黃色葡萄球菌的抗體或抗體片段中非常有效，因此非常適于由金黃色葡萄球菌所引起的感染的治療。此外，所述結合位點應該非常適于金黃色葡萄球菌的檢測。本發(fā)明的另一目的為提供含有所述結合位點的試劑盒，所述結合位點的用途,分泌包含所述結合位點的抗體、抗體片段、ScFv或ScFvFc的細胞系，以及治療方法。
·[0004]該目的由權利要求1、9、16、17、18和19的主題解決。本發(fā)明的實施方式公開于權利要求2-8、10-15和20-24中。
[0005]根據(jù)本發(fā)明，提供了形成金黃色葡萄球菌表位結合位點的肽或肽的組合，所述結合位點包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列。所述第一氨基酸序列與序列SEQ ID NO:1至少88% —致；所述第二氨基酸序列與序列SEQ ID NO:2至少88% —致。
[0006]在實施方式中，所述第一氨基酸序列與序列SEQ ID NO:1至少90%—致，特別是至少92.5% 一致、特別是至少95% —致、特別是至少97.5% 一致、特別是100% —致。所述第二氨基酸序列與序列SEQ ID NO: 2至少90% —致，特別是至少92.5% 一致、特別是至少95% —致、特別是至少97.5% 一致、特別是100% —致。
[0007]所述第一氨基酸序列可為抗體或抗體片段的重鏈的一部分；和/或所述第二氨基酸序列可為抗體或抗體片段的輕鏈的一部分。在這種情況下，所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列形成所述抗體或抗體片段的可變區(qū)。所述結合位點也可由單鏈可變片段(single chain variable fragment)形成。在這種情況下,所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列由單鏈可變片段(scFv)構成，或由含有抗體的Fe片段的單鏈可變片段(scFvFc)構成。Fe片段增強了 scFvFc所結合的金黃色葡萄球菌的吞噬。
[0008]本發(fā)明人改進了出自W02010/133600A1的抗體之一的結合區(qū)域，由此開發(fā)出了相比該已知抗體而言在肝素化人全血中更有效支持由吞噬血細胞通過吞噬來殺滅金黃色葡萄球菌的結合位點。從下述比對可以看出，序列SEQ ID NO:1與出自W02010/133600A1的相應序列SEQ ID NO: 13在118個氨基酸中有17個氨基酸不同；序列SEQ ID NO:2與出自W02010/133600A1的相應序列SEQ ID NO: 14在113個氨基酸中有8個氨基酸不同:
[0009]SEQ ID NO:I EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLENVSDINGNGGSTYY 60
[0010]V L ESGGGLV GGSL LSC ASGFTFSNYYMSffVRQ P K LE V DINGNGGSTYY
[0011]SEQ ID NO: 13 MADV^VESGGGLVKLGGSLKLSCSASGFTFSNYYMSWVRQTPEKRLELVADINGNGGSTYY 62
[0012]SEQ ID NO:I PDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRRGGYYALDYWGQGTTVTVSS 118
[0013]PDTVKGRFTISRDN KNTLYLQM SL EDTA YYCVRRGGYYALDYffGQGTTVTVSS
[0014]SEQ ID NO: 13 PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCVRRGGYYALDYWGQGTTVTVSS 120
[0015]SEQ ID NO:2 DWMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRF 60
[0016]DVVMTQTPLSL V G ASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSP LLIYRVSNRF
[0017]SEQ ID NO:14 DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRF
[0018]iEQ ID NO:2 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKLELKR 113
[0019]SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISFVEAED GVY CSQSTHVPffTFGGGTKLELKR·[0020]SEQ ID NO:14 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLELKR 113[0021 ] 一致的氨基酸在序列間的空隙中顯示出。
[0022]含有包含所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列的可變區(qū)的抗體對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌中的免疫顯性(immunodominant)結構IsaA表現(xiàn)出高親和力，并對于與這一結構的結合顯示出高特異性。
[0023]所述抗體可為單克隆抗體,特別是IgG型的抗體,特別是IgGl型、IgG2型或IgG4型的抗體。所述片段可為Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab’片段、或F(ab’)2片段。這些片段對金黃色葡萄球菌的檢測尤其有用，因為金黃色葡萄球菌的細胞壁含有蛋白A，該蛋白A經(jīng)由免疫球蛋白的Fe部分非特異性地結合免疫球蛋白。
[0024]在本發(fā)明的實施方式中，所述抗體是在細胞系、特別是昆蟲細胞系或哺乳動物細胞系、特別是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系或雜交瘤細胞系的細胞中生產(chǎn)的重組抗體。所述抗體中不是由所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列形成的部分與人抗體的相應部分至少85% —致，特別是至少90% —致、特別是至少92.5% 一致、特別是至少95% —致、特別是至少97.5%—致、特別是100%—致。所述抗體的輕鏈可包含序列SEQ ID NO:6、特別是序列SEQ ID NO:7 ;重鏈可包含序列SEQ ID NO:4、特別是序列SEQ ID N0:5，序列SEQ ID N0:9、特別是序列SEQ ID NO: 10，或序列SEQ ID NO: 11、特別是序列SEQ ID NO: 12。序列SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 12 包含前導序列(leader sequence) SEQID勵:8，所述前導序列來自皿^063 (KV3A9_小鼠的IgK鏈V-1II)。這一前導序列使得能夠在哺乳動物細胞中得以良好表達。序列SEQ ID N0:4包含序列SEQ ID NO:1和IgGl重鏈(人Y I同種異型Gml, 17)。序列SEQ ID N0:6包含序列SEQ ID N0:2和IgG輕鏈K。序列SEQ ID N0:9包含序列SEQ ID NO:1和IgG2重鏈(同種異型G2m(23))。序列SEQ IDNO: 11包含序列SEQ ID NO:1和IgG4重鏈。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合可用作藥物。特別是，它們可用作用于治療如下人類或動物的藥物:具有金黃色葡萄球菌感染、特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌或甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌感染的人類或動物；或處于受到此類感染的風險中的人類或動物。就本發(fā)明而言，所述治療包括預防(prophylaxis)。所述動物可為哺乳動物。所述人類或動物可具有乳腺炎(mastitis);金黃色葡萄球菌菌血癥(bacteremia)、特別是原發(fā)性菌血癥或繼發(fā)性菌血癥；血流感染(blood stream infection)、特別是原發(fā)性血流感染或繼發(fā)性血流感染；假體感染(prosthetic infection);移植物感染(graft infection);軟組織感染；手術相關的感染；嬰兒或新生兒感染；透析相關的感染；肺炎；骨感染；或由感染引起的膿毒癥(sepsis)。所述乳腺炎可為牛乳腺炎。如果奶牛具有牛乳腺炎，該奶牛生產(chǎn)不出可用的牛奶；而如果根據(jù)通常情況用抗生素對該奶牛進行治療，該奶牛所生產(chǎn)的牛奶必須被丟棄，直至在該奶牛的牛奶中不含有抗生素。常規(guī)治療的這一缺點可通過將根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合作為用于治療牛乳腺炎的藥物得以避免。
[0026]所述肽或肽的組合可以與針對金黃色葡萄球菌的至少一種另一表位的至少一種其它肽或肽的組合一起存在于混合物中。該另一表位可位于表位(即IsaA)所處的抗原上，或位于另一抗原上。相比使用僅含有根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合的藥物，使用此類混合物作為藥物可能更高效。這可歸因于金黃色葡萄球菌的高變異性引起不同菌株上抗原不同程度的表達，因此，相比僅由抗體或片段識別的細菌，更多細菌被抗體或片段的混合物識別出。
[0027]所述肽或肽的組合可以與至少一種抗生素一起存在于混合物中。在待用所述藥物治療的人類或動物中，除普通的金黃色葡萄球菌外，可能還存在突變的金黃色葡萄球菌。所述突變的金黃色葡萄球菌可能具有不能被根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合識別的突變IsaA。在這種情況下，所述抗生素可有效地對抗該突變的金黃色葡萄球菌。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合可以與哺乳動物、特別是人類的血漿或血液一起存在于混合物中。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相比包含于鹽溶液中的根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合，與血漿混合的根據(jù)本發(fā)明的肽或 肽的組合可有效得多。
[0029]所述藥物可以是被制備用于全身應用和/或局部應用的藥物。本發(fā)明人認識到，用根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合治療嚴重金黃色葡萄球菌感染使得死亡率和被治療的人類或動物器官中的金黃色葡萄球菌數(shù)顯著減少。
[0030]本發(fā)明還關注含有根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合的用于金黃色葡萄球菌的檢測、特別是高特異性檢測的試劑盒。
[0031]本發(fā)明進一步關注根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合在金黃色葡萄球菌的檢測、特別是高特異性檢測中的用途。
[0032]另外，本發(fā)明關注生產(chǎn)上面詳述的抗體、抗體片段、ScFv或ScFvFc的細胞系，特別是昆蟲細胞系或哺乳動物細胞系、特別是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系或雜交瘤細胞系。
[0033]本發(fā)明進一步關注治療人類或動物的方法，所述人類或動物具有金黃色葡萄球菌感染、特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌或甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌感染；或者處于受到此類感染的風險中，其中，將根據(jù)本發(fā)明的肽或肽的組合給予所述人類或動物。將所述肽或肽的組合以如下劑量給予:足以減少所述人類或動物中的金黃色葡萄球菌的量；或者足以清除所述人類或動物中的金黃色葡萄球菌?？蓪⑺鲭幕螂牡慕M合與合適的載體進行混合。
[0034]所述人類或動物可患有乳腺炎；金黃色葡萄球菌菌血癥、特別是原發(fā)性菌血癥或繼發(fā)性菌血癥；血流感染、特別是原發(fā)性血流感染或繼發(fā)性血流感染；假體感染；移植物感染；軟組織感染；手術相關的感染；嬰兒或新生兒感染；透析相關的感染；肺炎；骨感染；或由感染引起的膿毒癥。
[0035]所述肽或肽的組合可以與針對金黃色葡萄球菌的至少一種另一表位的至少一種其它肽或肽的組合一起存在于混合物中。在給予之前，所述肽或肽的組合可以與哺乳動物、特別是人類的血漿或血液混合。所述肽或肽的組合可局部給予或全身給予，特別是靜脈內(nèi)給予、肺內(nèi)給予、腹膜內(nèi)給予、經(jīng)鼻給予或舌下給予。它們也可與至少一種抗生素一起給予。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1示出測定不同抗IsaA抗體與IsaA抗原結合的競爭ELISA結果。
[0037]圖2示出測定不同抗IsaA抗體與不同金黃色葡萄球菌菌株結合的細菌細胞ELISA。
[0038]圖3示出對在肝素化人全血中由吞噬血細胞通過吞噬所殺滅的金黃色葡萄球菌菌株Newman的定量。
[0039]圖4示出對來自健康血液供體(n=15)的肝素化人全血中由吞噬血細胞通過吞噬所殺滅的金黃色葡萄球菌菌株Newman的定量。
[0040]圖5示出對來自透析患者的肝素化人全血中由吞噬血細胞通過吞噬所殺滅的金黃色葡萄球菌菌株Newman的定量。
[0041]圖6示出在HL-60細胞中，在有兩種濃度的抗IsaA抗體UK66-2以及同種型對照存在的情況下，對生物發(fā)光的金黃色葡萄球菌菌株Newman (Newlux)的調(diào)理吞卩遼殺滅。
【具體實施方式】
`[0042]在大腸桿菌(E.coli)中表達含有序列 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3以及其它序列的ScFv分子，并在ELISA和競爭ELISA中測試其結合和親和力。結果顯示，含有序列SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的ScFv分子的親和力比含有序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3的ScFv分子的親和力高約10倍。
[0043]將用于表達完整抗體的載體構建體轉染進CHO細胞。表達帶有Igk前導序列SEQID NO:8的根據(jù)序列SEQ ID NO:4 (包含序列SEQ ID NO:1)的IgGl重鏈(人Y I同種異型Gml, 17)(產(chǎn)生序列SEQ ID N0:5)以及帶有Igk前導序列SEQ ID NO:8的根據(jù)序列SEQ IDNO:6 (包含序列SEQ ID N0:2)的IgG輕鏈K (產(chǎn)生序列SEQ ID NO:7)來形成抗體UK66-2。為了研究同種型對功能活性的影響，合成IgG2和IgG4同種型。為此，將IgGl重鏈用帶有Igk前導序列SEQ ID NO:8的根據(jù)序列SEQ ID NO:9的IgG2重鏈(同種異型G2m(23))(產(chǎn)生SEQ ID NO: 10)替代；或者用帶有Igk前導序列SEQ ID NO:8的根據(jù)序列SEQ ID NO: 11的IgG4重鏈(產(chǎn)生SEQ ID NO: 12)替代。
[0044]在表達后，通過蛋白A柱將IgGl抗體從CHO細胞的上清液中純化出。在ELISA、競爭ELISA、蛋白印跡以及免疫熒光中測試純化抗體的結合動力學以及結合，并在吞噬分析中用人吞噬血細胞測試純化抗體的功能。在功能分析中，含有序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2的抗體(UK66-2)增強了氧化粹發(fā)(oxidative burst);并且,相比已知抗體UK66,其對金黃色葡萄球菌的殺滅顯著更強。[0045]使用麗ACOREi^OOO 系統(tǒng)(GE Healthcare Europe GmbH, MunzingerStrasse5, 79111Freiburg, Germany),借助于無標記的表面等離子體共振對IsaA與固定化抗體UK66-2的結合動力學進行測定。使用抗Fab抗體實施抗體UK66-2的可逆固定。相互作用分析使用 HBS-EP 緩沖液(IOmM HEPES pH7.4,150mM NaCl,3.4mM EDTA,0.005%Tween20)進行。記錄25°C流速為30 μ 1/min時的傳感圖(sensorgrams)。
[0046]使用BIAevaluation軟件4.0.1將獲得的傳感圖擬合為1:1Langmuir結合模型，計算締合(km)和解離(I^ff)的速率常數(shù)以及親和力。以這樣的方式，在兩個獨立測量中測定出解離常數(shù)Kd為4.8nM。測定出UK66-2和IsaA間相互作用的締合和解離速率常數(shù)分別為 3.7 X IO5MY1 (kQn)和 1.8Χ10? (koff)。
[0047]圖1顯示測定不同抗IsaA抗體與可溶性重組IsaA抗原結合的競爭ELISA結果。450nm處的光密度表示所述抗體與IsaA的結合。加入不同濃度的可溶性IsaA。三條線表示用下列抗IsaA抗體獲得的結果:
[0048]-0.01 μ M可溶性IsaA處上面的線:UK66 (出自W02010/133600A1的參比抗體)；
[0049]-0.01 μ M可溶性IsaA處中間的線:UK66_2(具有包含序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的結合位點的抗體)；
[0050]-0.01 μ M可溶性IsaA處下面的線:UK66_3(具有包含序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:3的結合位點的抗體)。
[0051]方法說明:
[0052]將Nunc-Maxisorp96 孔板用 50 μ I/ 孔的 IsaA (處于 I XPBS 中，0.5 μ g/ 孔)進行涂覆，并在4°C孵育過 夜。第二天，將板用含有0.05%Tween20的PBS pH7.4 (PBST)洗滌3次。洗滌后，通過添加200 μ 15%脫脂奶粉/PBS進行封閉，并在室溫孵育lh。將孔用PBST(0.05%)洗滌2次，以0.4 μ Μ-0.01 μ M的系列濃度添加抗IsaA —抗。將抗IsaA-1gGl —抗稀釋于2.5%脫脂奶粉/PBS中，并在37°C孵育lh。然后將孔用PBST (0.05%)洗滌3次，加入50 μ I以1:5000稀釋于2.5%脫脂奶粉/PBS中的連接辣根過氧化物酶的二抗，并在37°C孵育 lh。將孔用 PBST (0.05%)洗滌 4 次，加入 50 μ I TMB (Thermo Scientific PierceELISA底物)，并在37 °C孵育15min。用100 μ I的IN H2SO4終止反應，用ELISA讀板器對0D450nm處的底物反應的光密度進行分析。
[0053]圖2示出測定不同抗IsaA抗體與金黃色葡萄球菌菌株USA300、SH1000、RN4220、E、MA12以及MA12isaA-的結合的細菌細胞ELISA。在MA12isaA_中，免疫顯性結構IsaA被刪除。在450nm處的光密度表明抗體與細菌細胞的結合。3個柱表示用下列抗IsaA抗體得到的結果:
[0054]-左柱:抗體UK66(參比抗體)；
[0055]-中柱:抗體UK66-2 ；
[0056]-右柱:抗體UK66-3。
[0057]方法說明:
[0058]在LB培養(yǎng)基中將金黃色葡萄球菌菌株在37°C培養(yǎng)過夜。通過在13000rpm離心Imin使細菌沉淀，并用PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)進行洗滌。在離心步驟后，將沉淀重懸于Iml PBS中。制備含有5X IO7細菌/50 μ I的細菌懸浮液。用50 μ I/孔的細菌懸浮液涂覆Nunc-Maxisorp96孔板，并在4°C孵育過夜。第二天,用含有0.05%Tween20的PBS ρΗ7.4(PBST)將板洗滌3次。洗滌后，通過添加200 μ 15%脫脂奶粉/PBS進行封閉，并在室溫孵育lh。將孔用PBST (0.05%)洗滌2次，添加抗IsaA —抗。將抗IsaA-1gGl —抗以1:2000稀釋于2.5%脫脂奶粉/PBS中，以50 μ I/孔添加，并在37°C孵育lh。然后將孔用PBST(0.05%)洗滌3次，加入50 μ I以1:5000稀釋于2.5%脫脂奶粉/PBS中的連接辣根過氧化物酶的二抗，并在37°C孵育lh。將孔用PBST (0.05%)洗滌4次，加入50 μ I TMB (ThermoScientific Pierce ELISA 底物)，并在 37°C孵育 15min。用 100 μ I 的 IN H2SO4 終止反應，用ELISA讀板器對0D450nm處的底物反應的光密度進行分析。
[0059]圖3顯示對肝素化人全血中由吞噬血細胞通過吞噬所殺滅的金黃色葡萄球菌菌株Newman的定量。將細菌與肝素化人全血孵育30min。將在無抗體溶液的情況下孵育后所得的活細菌數(shù)設置為100% (左柱)。相比同種型對照抗體(中柱)，在有UK66-2存在(右柱)的情況下，殺滅顯著增強。
[0060]方法說明:
[0061]在LB培養(yǎng)基中將金黃色葡萄球菌菌株Newman在37 °C培養(yǎng)過夜。通過在13000rpm離心Imin使細菌沉淀，并用PBS進行洗滌。重復離心步驟，并將沉淀重懸于Iml PBS中。制備5X IO7細菌/20 μ I的細菌溶液。將100 μ I肝素化血液加入1.5ml管中，在冰上保存。除含有細菌但不含有抗體的陰性對照樣品外，加入20μ I細菌懸浮液和抗體溶液。將樣品在雜交爐中于37°C孵育30min，伴隨持續(xù)的旋轉混合。通過將樣品放置于冰上使吞噬停止。用0.1%新制備的Saponin裂解血細胞(在冰上20min)。制備兩系列的樣品稀釋液。分別將20 μ IlO-2UO-3和10_4稀釋液鋪于LB板上，每種2份，并在37°C孵育24h。對克隆進行計數(shù)并計算殺滅，將無抗體溶液的血液中的活細菌數(shù)設置為100%。
[0062]圖4示出對來自健康血液供體(n=15)的肝素化人全血中由吞噬血細胞通過吞噬所殺滅的金黃色葡萄球菌菌株Newman的定量。圖5示出對來自透析患者(n=7)的肝素化人全血中由吞曬血細胞通過吞卩遼·所殺滅的金黃色葡萄球菌菌株Newman的定量。在兩種情況下，將細菌與肝素化血液孵育60min。將在無抗體溶液的情況下孵育后所得到的活細菌數(shù)設置為100% (左散點“空白對照(placebo)”)。相比同種型對照抗體(第二散點“同種型對照[90(^8/!111]”)，在有皿66-2存在的情況下，殺滅顯著增強(第三散點和第四散點“UK66-2[75y g/ml] ”和 “UK66-2 [900 μ g/ml])。
[0063]方法說明:
[0064]在LB培養(yǎng)基中將金黃色葡萄球菌菌株Newman在37 °C培養(yǎng)過夜。通過在13000rpm離心Imin使細菌沉淀，并用PBS進行洗滌。重復離心步驟，并將沉淀重懸于Iml PBS中。制備5X IO7細菌/20 μ I的細菌溶液。將100 μ I肝素化血液加入1.5ml管中，在冰上保存。除含有細菌但不含有抗體的陰性對照樣品外，加入20μ I細菌懸浮液和抗體溶液。將樣品在雜交爐中于37°C孵育60min，伴隨持續(xù)的旋轉混合。通過將樣品放置于冰上使吞噬停止。用0.1%新制備的Saponin裂解血細胞(在冰上20min)。制備兩系列的樣品稀釋液。分別將20 μ IlO-2UO-3和10_4稀釋液鋪于LB板上，每種2份，并在37°C孵育24h。對克隆進行計數(shù)并計算殺滅。將無抗體溶液的血液中的活細菌數(shù)設置為100%。
[0065]圖6顯示在HL-60細胞中，在有兩種濃度的抗IsaA抗體UK66-2 (20μg/ml和200 μ g/ml)以及同種型對照(200 μ g/ml)存在的情況下，對生物發(fā)光的金黃色葡萄球菌(S.a.)菌株Newman (Newlux)的殺滅。通過測量生物發(fā)光來對存活細菌的相對數(shù)量進行測定。存活細菌表示為發(fā)光(RLU=相對光單位)。細菌殺滅與UK66-2是濃度依賴的，并且在同種型匹配的人IgGl對照抗體中并未觀察到細菌殺滅。
[0066]方法說明:
[0067]使用懷有l(wèi)uxABCED操縱子的金黃色葡萄球菌菌株Newman的單個菌落，將其接種至5ml的LB培養(yǎng)基中。因為luxABCED操縱子在活細菌中引起發(fā)光，但在死細菌中不引起發(fā)光，因此發(fā)光與活細菌數(shù)相關。將細菌培養(yǎng)過夜，并將50 μ I該培養(yǎng)物用于接種至5ml補充有30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。將所述培養(yǎng)物在旋轉搖蕩器上以200rpm在37°C培養(yǎng) 4_6h。使用 Lumat LB9501 光度計(Berthold Technologies, Bad ffildbad, Germany)測定細菌的生物發(fā)光。當100 μ I的培養(yǎng)物所生成的生物發(fā)光信號在16000-24000相對光單位(RLU)之間時，所述培養(yǎng)物適于進行分析。培養(yǎng)后，將細菌在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中
洗滌2次，并將其以lX109/ml的終濃度重懸于Opt1-MEIVT培養(yǎng)基(Life Technologies,
Darmstadt，Germany)中。用0.8%DMF使吞噬性HL-60細胞分化5天，并在Opt1-MEM?中重懸至 I X IO8 細胞/ml,并在 96 孔組織培養(yǎng)板(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)中以50 μ I每孔進行接種。加入抗體溶液(50 μ 1)，隨后加入100 μ I金黃色葡萄球菌(lX109/ml)。將HL-60細胞、抗體和細菌在37°C進行孵育，并以15min的間隔對生物發(fā)光持續(xù)測量240min,以測定最佳的信噪比(signal-noise ratio)。所有分析一式三份進行,并重復至少 3 次。使用多模式讀板器 Infinite200Pro (TECAN，Mannedorf, Switzerland)測定生物發(fā)光。`
【權利要求】
1.形成金黃色葡萄球菌表位結合位點的肽或肽的組合，所述結合位點包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，其中，所述第一氨基酸序列與序列SEQ ID NO:1至少88%—致；并且其中，所述第二氨基酸序列與序列SEQ ID N0:2至少88%—致。
2.如權利要求1所述的肽或肽的組合，其中，所述第一氨基酸序列與序列SEQID NO:1至少90% —致，特別是至少92.5% 一致、特別是至少95% —致、特別是至少97.5% 一致、特別是100% —致；和/或其中，所述第二氨基酸序列與序列SEQ ID NO: 2至少90% —致，特別是至少92.5% 一致、特別是至少95% —致、特別是至少97.5% 一致、特別是100% —致。
3.如前述權利要求中任一項所述的肽或肽的組合，其中，所述第一氨基酸序列為抗體或抗體片段的重鏈的一部分，和/或所述第二氨基酸序列為抗體或抗體片段的輕鏈的一部分；或者其中，所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列由單鏈可變片段(scFv)構成，或由含有抗體的Fe片段的單鏈可變片段(scFvFc)構成。
4.如權利要求3所述的肽或肽的組合，其中，所述抗體為單克隆抗體，特別是IgG型的抗體，特別是IgGl型、IgG2型或IgG4型的抗體。
5.如權利要求3或4所述的肽或肽的組合，其中，所述片段為Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab’片段、或F(ab’)2片段。
6.如權利要求3-5中任一項所述的肽或肽的組合，其中，所述抗體是在細胞系、特別是昆蟲細胞系或哺乳動物細胞系、特別是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系或雜交瘤細胞系的細胞中生產(chǎn)的重組抗體。
7.如權利要求3-6中任一項所述的肽或肽的組合，其中，所述抗體中不是由所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列形成的部分與人抗體的相應部分至少85% —致，特別是至少90% —致、特別是至少·92.5% 一致、特別是至少95% —致、特別是至少97.5% 一致、特別是100%—致。
8.如權利要求3-7中任一項所述的肽或肽的組合，其中，所述輕鏈包含序列SEQIDN0:6、特別是序列SEQ ID NO: 7 ;以及所述重鏈包含序列SEQ ID NO:4、特別是序列SEQ IDN0:5，序列 SEQ ID N0:9、特別是序列 SEQ ID N0:10，或序列 SEQ ID N0:11、特別是 SEQ IDNO:12。
9.如前述權利要求中任一項所述的肽或肽的組合作為藥物的用途。
10.如權利要求9所述的肽或肽的組合，其中，所述藥物為治療如下人類或動物的藥物:具有金黃色葡萄球菌感染、特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌或甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌感染的人類或動物；或處于受到此類感染的風險中的人類或動物。
11.如權利要求10所述的肽或肽的組合，其中，所述人類或動物患有乳腺炎、金黃色葡萄球菌菌血癥、血流感染、假體感染、移植物感染、軟組織感染、手術相關的感染、嬰兒或新生兒感染、透析相關的感染、肺炎、骨感染、或由感染引起的膿毒癥。
12.如權利要求9-11中任一項所述的肽或肽的組合，其中，所述肽或肽的組合與針對金黃色葡萄球菌的至少一種另一表位的至少一種其它肽或肽的組合一起存在于混合物中。
13.如權利要求9-12中任一項所述的肽或肽的組合，其中，所述肽或肽的組合與至少一種抗生素一起存在于混合物中。
14.如權利要求9-13中任一項所述的肽或肽的組合，其中，所述肽或肽的組合與哺乳動物、特別是人類的血漿或血液一起存在于混合物中。
15.如權利要求9-14中任一項所述的肽或肽的組合，其中，所述藥物為用于全身應用和/或局部應用的藥物。
16.含有如權利要求1-8中任一項所述的肽或肽的組合的用于金黃色葡萄球菌的檢測的試劑盒。
17.如權利要求1-8中任一項所述的肽或肽的組合在金黃色葡萄球菌的檢測中的用途。
18.生產(chǎn)如權利要求3-8中任一項所述的抗體、抗體片段、ScFv或ScFvFc的細胞系。
19.治療人類或動物的方法，所述人類或動物具有金黃色葡萄球菌感染、特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌或甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌感染，或者處于受到此類感染的風險中，其中，將如權利要求1-8中任一項所述的肽或肽的組合給予所述人類或動物。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其中，所述人類或動物患有乳腺炎、金黃色葡萄球菌菌血癥、血流感染、假體感染、移植物感染、軟組織感染、手術相關的感染、嬰兒或新生兒感染、透析相關的感染、肺炎、骨感染、或由感染引起的膿毒癥。
21.如權利要求19或20所述的方法，其中，所述肽或肽的組合與針對金黃色葡萄球菌的至少一種另一表位的至少一種其它肽或肽的組合一起存在于混合物中。
22.如權利要求19-21中任一項所述的方法，其中，在給予之前，將所述肽或肽的組合與哺乳動物、特別是人類的血漿或血液混合。
23.如權利要求19-22中任一項所述的方法，其中，所述肽或肽的組合局部給予或全身給予，特別是靜脈內(nèi)給予、肺內(nèi)給予、腹膜內(nèi)給予、經(jīng)鼻給予或舌下給予。`
24.如權利要求19-23中任一項所述的方法，其中，所述肽或肽的組合與至少一種抗生素一起給予。
【文檔編號】A61P31/04GK103857697SQ201280046452
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年9月21日 優(yōu)先權日:2011年9月23日
【發(fā)明者】克努特·奧爾森, 尤多·洛倫茨, 羅蘭·E·孔特爾曼 申請人:伍茲堡尤利烏斯－馬克西米利安斯大學