融合至Fc結(jié)構(gòu)域的抗VEGF單可變結(jié)構(gòu)域的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗原結(jié)合構(gòu)建體，其包含通過抗體的單鏈Fc區(qū)域分隔的一個(gè)或兩個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合至VEGF；涉及包含兩個(gè)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的二聚體，包含所述二聚體的藥物組合物及其在治療與VEGF信號轉(zhuǎn)遞相關(guān)的疾病中的用途，所述疾病例如糖尿病性黃斑水腫(DME)、濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(濕性AMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)和角膜新生血管形成，以及編碼所述抗原結(jié)合構(gòu)建體的多核苷酸序列。
【專利說明】融合至Fe結(jié)構(gòu)域的抗VEGF單可變結(jié)構(gòu)域
[0001]背景
生長因子的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族及其受體是血管發(fā)生和血管通透性的基本調(diào)節(jié)劑。VEGF家族包括VEGF-A、PIGF (胎盤生長因子)、VEGF-B、VEGF-C, VEGF-E和蛇毒VEGF,并且認(rèn)為每一種在血管形成模式(vascular patterning)和血管發(fā)育中具有不同的作用。由于從8個(gè)外顯子的單基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的可變剪接，VEGF-A具有至少9個(gè)亞型(同種型)，其通過在信號肽剪切后剩余的氨基酸數(shù)量而確定。例如，在人中，最主要的同種型是VEGF165，其以可溶型和細(xì)胞結(jié)合型之間的平衡態(tài)存在。較長的同種型(VEGF183、VEGF189和VEGF206)具有高度帶正電并介導(dǎo)與細(xì)胞表面的多糖以及調(diào)節(jié)其生物利用度的肝素結(jié)合的C-末端區(qū)域。所有的VEGF-A同種型都形成同二聚體，并且具有通過構(gòu)成受體結(jié)合VEGF片段的大約110個(gè)N-末端殘基的核心發(fā)生的結(jié)合。在正常條件下，并且在實(shí)體瘤的中心，VEGF的表達(dá)主要通過低氧條件介導(dǎo)，表示血管供應(yīng)的短缺。低氧導(dǎo)致低氧誘導(dǎo)因子HIF-Ια與組成型表達(dá)的HIF-1 α的二聚化，形成結(jié)合至VEGF基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的低氧響應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄因子。在正常含氧量下，由于多個(gè)脯氨酸羥基化事件的結(jié)果，HIF-Ια蛋白經(jīng)歷泛素介導(dǎo)的降解。其他腫瘤相關(guān)的VEGF上調(diào)由于經(jīng)由通過炎性細(xì)胞因子和生長因子以及通過機(jī)械力的癌基因通路(即ras)的活化而發(fā)生。
[0002]活性VEGF同二聚體通過VEGFR家族的受體結(jié)合至細(xì)胞表面。VEGF-A的主要血管內(nèi)皮相關(guān)受體是VEGFRl (Fltl)和VEGFR2 (Flk_2 ;KDR)。這兩種受體都是酪氨酸激酶家族的成員，并且需要配體介導(dǎo)的二聚化用于活化。在二聚化后，激酶結(jié)構(gòu)域經(jīng)歷自身磷酸化，盡管VEGFR2中的激酶活性的程度大于在VEGFRl中的激酶活性的程度。已經(jīng)證實(shí)，盡管VEGF對VEGFRl的親和 力高大約3倍(KD~30pM，相比之下對VEGFR2為IOOpM)，但VEGF的血管生成信號傳遞主要通過VEGFR2介導(dǎo)。這導(dǎo)致下述提議，即VEGFRl主要充當(dāng)誘餌受體以隔離VEGF并減緩VEGFR2活化的程度。盡管VEGFRl表達(dá)與一些腫瘤相關(guān)，但其主要作用看起來是在胚胎發(fā)育和器官發(fā)生期間。VEGF-A165也通過神經(jīng)纖毛蛋白受體NRPl和NRP2結(jié)合。盡管這些受體缺少TK結(jié)構(gòu)域，但認(rèn)為它們充當(dāng)VEGFR2的共同受體，并且通過將VEGF轉(zhuǎn)移至VEGFR2而增強(qiáng)信號轉(zhuǎn)遞。
[0003]很多研究已幫助確認(rèn)VEGF-A作為腫瘤血管發(fā)生中的關(guān)鍵因子。例如，VEGF-A表達(dá)在大多數(shù)腫瘤中和腫瘤相關(guān)的基質(zhì)中。在缺少充分發(fā)育且擴(kuò)張的血管系統(tǒng)以支持生長的條件下，腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，從而對可由持續(xù)細(xì)胞增殖導(dǎo)致的腫瘤體積(I _3的級另Ij)的增大施加限制。VEGF-A的表達(dá)在鄰近壞死區(qū)域的低氧腫瘤細(xì)胞中最高，表明在生長的腫瘤中通過低氧誘導(dǎo)VEGF-A能夠改變血管發(fā)生的活化劑和抑制劑的平衡，導(dǎo)致在腫瘤中的新血管的生長。與這個(gè)假說一致，已開發(fā)出作為治療劑的多種方法，包括小分子量酪氨酸激酶抑制劑、單克隆抗體、反義寡核苷酸等，其抑制或捕獲VEGF-A或阻斷其信號轉(zhuǎn)遞受體 VEGFR-2。
[0004]VEGF-A已參與多種眼部疾病，例如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、濕性AMD、地圖樣萎縮、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞疾病、糖尿病性黃斑水腫和角膜血管形成。VEGF-A由多種眼部細(xì)胞類型響應(yīng)低氧而產(chǎn)生，并且具有多種功能，包括促進(jìn)血管通透性和刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長。
[0005]AMD定義為視網(wǎng)膜色素上皮的異常，其導(dǎo)致黃斑中的上覆感光細(xì)胞退化，并且導(dǎo)致中央視覺損失。AMD代表了主要的公共健康負(fù)擔(dān)，并且估計(jì)在美國，超過9百萬人具有中期或晚期形式的AMD。早期AMD表征為玻璃疣和視網(wǎng)膜色素上皮的色素沉著或色素減退，而沒有視覺損失。其中發(fā)生視覺損失的晚期AMD，可表現(xiàn)為地圖樣萎縮或脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)。CNV，也稱作濕性AMD，是血管異常生長的結(jié)果。
[0006]雷珠單抗(Lucentis)、貝伐單抗(Avastin)和阿柏西普(Eylea)是抗VEGF療法的實(shí)例，它們通常施用以用于新生血管性AMD。盡管存在這樣的治療，但仍需要用于治療AMD和其他眼部疾病的進(jìn)一步的療法。
[0007]發(fā)明概述
本發(fā)明涉及抗原結(jié)合構(gòu)建體，其包含通過抗體的單鏈Fe區(qū)域分隔的一個(gè)或兩個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域都能夠結(jié)合至VEGF。
[0008]一方面，本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的每個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域是域抗體，也稱作dAb。
[0009]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及以下抗原結(jié)合構(gòu)建體:
a)DOM 15-26-597 - AS - Fe (SEQ ID N0.110)-纖連蛋白 x 4 - DT02-K-044-085 ;或
b)DOM 15-26-597 -1gGl 鉸鏈-Fe (SEQ ID N0.110)-纖連蛋白 x4 - DT02-K-044-085 ;或
c)(a)或(b)的變體，其在整個(gè)序列上具有至少97%的氨基酸同一性；或
d)(a)或(b)的變體，其中每條dAb序列與特異的dAb的序列具有至少97%的序列同一性。`
[0010]本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含兩個(gè)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的二聚體，包含所述二聚體的藥物組合物，及其在治療與VEGF信號轉(zhuǎn)遞相關(guān)的疾病中的用途，所述疾病例如糖尿病性黃斑水腫(DME)、濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(濕性AMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)、和角膜新生血管形成，以及編碼所述抗原結(jié)合構(gòu)建體的多核苷酸序列。
[0011]附圖
圖1:ELISA，和EC50值，其顯示了結(jié)合至人VEGF165的DMS1529、DMS1576和貝伐單抗(Avastin)的比較。
[0012]圖2A:通過 MSD，在使用 3ug/mL Vk Fc-dAb DMS30000 預(yù)飽和后，Vh dAb-FcDMS1576與VEGF的結(jié)合。
[0013]圖2B:通過 MSD，在使用 3ug/mL Vh dAb-Fc DMS1576 預(yù)飽和后，Vk Fc-dAbDMS30000 與 VEGF 的結(jié)合。
[0014]圖3:對于來自與貝伐單抗(Avastin)相比的抗VEGF Vh dAb-Fc> Vk Fc-dAb和dAb-Fc-dAb分子的VEGF誘導(dǎo)的人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖測定的最大抑制的加權(quán)方差分析。
[0015]圖4:通過 MSD，DMS1529 和 DMS30000 對小鼠 VEGF164 的結(jié)合。
[0016]發(fā)明詳沭
本發(fā)明涉及抗原結(jié)合構(gòu)建體，其包含通過抗體的單鏈Fe區(qū)域分隔的兩個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合至VEGF。
[0017]一方面，本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的每個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域是域抗體，也稱作dAb。[0018]如本文使用的術(shù)語“表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指獨(dú)立于不同的可變區(qū)域或結(jié)構(gòu)域而特異性地結(jié)合抗原或表位的結(jié)構(gòu)域。這可以是域抗體(dAb)，或者它可以是作為支架的衍生物的結(jié)構(gòu)域，所述支架選自CTLA-4 (Evibody);脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；蛋白A衍生的分子,例如蛋白 A 的 Z-結(jié)構(gòu)域(Affibody, SpA)、A-結(jié)構(gòu)域(Avimer/Maxibody);熱激蛋白，例如 GroEl和GroES;轉(zhuǎn)鐵蛋白(trans-body);錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin);肽適體；C-型凝集素結(jié)構(gòu)域(四連接素(Tetranectin));人Y-晶體蛋白和人泛素(affilins) ;PDZ結(jié)構(gòu)域；蝎毒素(卡律蝎毒素(charybdotoxin));人蛋白酶抑制劑的kunitz型結(jié)構(gòu)域；Ras_結(jié)合蛋白AF-6的PDZ結(jié)構(gòu)域；和纖連蛋白(adnectin);其已經(jīng)過蛋白工程化以便獲得對天然配體之外的配體的結(jié)合。
[0019]如本文使用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”是具有獨(dú)立于蛋白其他部分的三級結(jié)構(gòu)的折疊的蛋白結(jié)構(gòu)。通常，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白的分立的功能性質(zhì)，并且在很多情況下，可添加、去除或轉(zhuǎn)移至其他蛋白，而不損失蛋白剩余部分和/或結(jié)構(gòu)域的功能。
[0020]如本文使用的術(shù)語“域抗體”是指包含抗體可變結(jié)構(gòu)域特征的序列的折疊的多肽結(jié)構(gòu)域。因此，它包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu)域，例如VH、VHH和VL，和修飾的抗體可變結(jié)構(gòu)域(例如，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)已替代為不是抗體可變結(jié)構(gòu)域特征的序列)，或者已經(jīng)被截短或包含N-或C-末端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及至少保留全長結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。單可變結(jié)構(gòu)域能夠獨(dú)立于不同的可變區(qū)域或結(jié)構(gòu)域而結(jié)合抗原或表位?！坝蚩贵w”或“dAb(?)”也可稱作“單可變結(jié)構(gòu)域”。域抗體可以是人域抗體，但也包括來其他物種的單域抗體，例如嚙齒動(dòng)物(例如，如在WO 00/29004中的公開)、鉸口鯊和駱駝科(Camel id) VHH dAb。駱駝科VHH是源自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駝和原駝的物種的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域多肽，其產(chǎn)生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體。這樣的VHH結(jié)構(gòu)域可以根據(jù)本領(lǐng)域中可用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行人源化，并且這樣的結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是“域抗體”。如本文使用的VH包括駱駝科VHH結(jié)構(gòu)域。NARV是另一種類型的免疫球蛋白域抗體，其在包括鉸口鯊在內(nèi)的軟骨魚類中被鑒定到(Mol.1mmunol.44，656-665 (2006)。這些結(jié)構(gòu)域還稱作新型的抗原 受 體可變區(qū)域(?？s寫為V(NAR)或NARV)。
[0021]如本文使用的術(shù)語“抗體的單鏈Fe區(qū)域”是指IgG例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE，或IgA抗體的單重鏈Fe區(qū)域。單重鏈Fe區(qū)域可包含一個(gè)或多個(gè)的CH1、CH2和CH3恒定區(qū)抗體結(jié)構(gòu)域，例如所有三個(gè)恒定區(qū)抗體結(jié)構(gòu)域，或僅CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。除了包含一個(gè)或多個(gè)的CH1、CH2和CH3恒定區(qū)抗體結(jié)構(gòu)域之外，抗體的單重鏈Fe區(qū)域可進(jìn)一步包含抗體的鉸鏈區(qū)(這樣的區(qū)域通常見于CHl和CH2結(jié)構(gòu)域之間)。
[0022]一方面，抗體的單鏈Fe區(qū)域是單IgGl重鏈，例如包含CH2和CH3抗體恒定結(jié)構(gòu)域的單IgGl重鏈。
[0023]在進(jìn)一步的方面，抗體的單鏈Fe區(qū)域是SEQ ID N0.110的IgGl序列。
[0024]在進(jìn)一步的方面，抗體的單鏈Fe區(qū)域是以下序列:
【權(quán)利要求】
1.抗原結(jié)合構(gòu)建體，其包含通過抗體的單鏈Fe區(qū)域分隔的兩個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合至VEGF。
2.權(quán)利要求1的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中每個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域是域抗體(dAb)。
3.權(quán)利要求2的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中一個(gè)dAb連接至所述單鏈Fe區(qū)域的N-末端,且另一個(gè)dAb連接至所述單鏈Fe區(qū)域的C-末端。
4.權(quán)利要求3的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的N-末端的所述dAb是重鏈dAb。
5.權(quán)利要求3的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的N-末端的所述dAb是輕鏈dAb。
6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的C-末端的所述dAb是輕鏈dAb。
7.權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中所述輕鏈dAb是K或λ輕鏈dAb ο
8.權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中每個(gè)dAb獨(dú)立地選擇且包含與DOM 15-26-593、DOM 15-26-597、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少90%相同的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中每個(gè)dAb獨(dú)立地選擇且包含與DOM 15-26-593、DOM 15-26-597、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少97%相同的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中每個(gè)dAb獨(dú)立地選自:D0M15-26-593、DOM 15-26-597、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236 和 DT02-K-044-255。
11.權(quán)利要求3-10中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的N-末端的所述dAb包含與DOM 15-26-597或DT02-K-044-085的序列至少90%相同的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求3-11中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的N-末端的所述dAb包含與DOM 15-26-597或DT02-K-044-085的序列至少97%相同的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的N-末端的所述 dAb 是 DOM 15-26-597 或 DT02-K-044-085。
14.權(quán)利要求3-13中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的C-末端的所述 dAb 包含與 DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少90%相同的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求3-14中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的C-末端的所述 dAb 包含與 DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255 的序列至少97%相同的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的C-末端的所述 dAb 是 DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255。
17.權(quán)利要求16的抗原結(jié)合構(gòu)建體,其中連接至所述單鏈Fe區(qū)域的C-末端的所述dAb是DT02-K-044-085。
18.權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中每個(gè)dAb獨(dú)立地選擇并且包含: viii)CDR 序列 SEQ ID N0.111、112 和 113 中的一個(gè)或多個(gè)； ix)CDR序列SEQ ID N0.114、115和116中的一個(gè)或多個(gè); X) CDR序列SEQ ID N0.117、118和119中的一個(gè)或多個(gè); xi)CDR序列SEQ ID N0.120、121和122中的一個(gè)或多個(gè)； xii)CDR序列SEQ ID N0.123、124和125中的一個(gè)或多個(gè)； xiii)CDR序列SEQ ID N0.126、127和128中的一個(gè)或多個(gè)；或 xiv)CDR序列SEQ ID N0.129、130和131中的一個(gè)或多個(gè)。
19.權(quán)利要求18的抗原結(jié)合蛋白，其中連接至抗體的Fe區(qū)域的N-末端的所述dAb包含一個(gè)或多個(gè)⑶R序列SEQ ID N0.114、115和116，且連接至抗體的Fe區(qū)域的C-末端的所述dAb包含一個(gè)或多個(gè)CDR序列SEQ ID N0.117、118和119。
20.抗原結(jié)合構(gòu)建體,其包含連接至抗體的單鏈Fe區(qū)域的一個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中所述表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包含與 DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少90%相同的氨基酸序列的dAb，并且進(jìn)一步地其中所述表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合至VEGF。
21.抗原結(jié)合構(gòu)建體，其包含連接至抗體的單鏈Fe區(qū)域的一個(gè)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包含與 DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少97%相同的氨基酸序列的dAb，并且進(jìn)一步地其中所述表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合至VEGF。
22.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中所述dAb是DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236 或 DT02-K-044-255。
23.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中所述dAb包含: vi)CDR序列SEQ ID N0.117、118和119中的一個(gè)或多個(gè); vii)CDR序列SEQ ID N0.120、121和122中的一個(gè)或多個(gè)； viii)CDR 序列 SEQ ID N0.123、124 和 125 中的一個(gè)或多個(gè); ix)CDR序列SEQ ID N0.126、127和128中的一個(gè)或多個(gè)；或 X) CDR序列SEQ ID N0.129、130和131中的一個(gè)或多個(gè)。
24.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中所述Fe區(qū)域是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG4PE ;或其片段或變體。
25.權(quán)利要求24的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中所述Fe區(qū)域包含CHl、CH2和CH3恒定區(qū)抗體結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)，和任選包含鉸鏈區(qū)(即在CHl和CH2之間)。
26.權(quán)利要求25的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中所述Fe區(qū)域包含CH2和CH3恒定區(qū)抗體結(jié)構(gòu)域。
27.權(quán)利要求24的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中所述Fe區(qū)域是SEQID N0.110的IgGl序列。
28.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中所述表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或兩個(gè)通過接頭連接至Fe區(qū)域。
29.權(quán)利要求28的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中每個(gè)接頭獨(dú)立地選擇且包含1-150個(gè)氨基酸。
30.權(quán)利要求29的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中每個(gè)接頭獨(dú)立地選擇且包含多于7個(gè)氨基酸。
31.權(quán)利要求28的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中每個(gè)接頭獨(dú)立地選自IgGl鉸鏈、AS、纖連蛋白X 3、纖連蛋白X 4、和螺旋狀接頭。
32.權(quán)利要求31的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中經(jīng)其將表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述Fe區(qū)域的N-末端的所述接頭是IgGl鉸鏈、AS或Fib-3。
33.權(quán)利要求32的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中經(jīng)其將表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述Fe區(qū)域的N-末端的所述接頭是IgGl鉸鏈或AS。
34.權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中經(jīng)其將表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述Fe區(qū)域的C-末端的所述接頭是Fib-4或螺旋狀接頭。
35.權(quán)利要求34的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中經(jīng)其將表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述Fe區(qū)域的C-末端的所述接頭是Fib-4。
36.權(quán)利要求1的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其為:(a)DOM 15-26-597 - AS - Fe (SEQ ID N0.110)-纖連蛋白 x 4 - DT02-K-044-085 ；或
(b)DOM 15-26-597 -1gGl 鉸鏈-Fe (SEQ ID N0.110)-纖連蛋白 x4 - DT02-K-044-085 ;或 h)(c) (a)或b)的變體，其在整個(gè)序列上具有至少97%的氨基酸同一性；或 i)(d) (a)或b)的變體，其中每個(gè)dAb序列與特定的dAb的序列具有至少97%的序列同一I"生。
37.權(quán)利要求2-36中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)dAb包含: a)由序列VTVS(S) nX [對于VH dAb]或VEIKpRqX [對于VL dAb]組成的C-末端序列；和還任選地 b)與人種系框架序列相比，在位置14、41、108、110或112處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代； 其中: η代表獨(dú)立地選自O(shè)或I的整數(shù)； P和q各自代表O或1，從而當(dāng)P代表1時(shí)，q可以是O或1，并且從而當(dāng)p代表O時(shí)，q也代表O ; X可以存在或不存在，并且如果存在，則代表1-8個(gè)氨基酸殘基的氨基酸延伸； 另外的條件是如果X不存在。
38.權(quán)利要求37的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中對于VLdAb,所述C-末端序列是VEIKpRqX且P是l，q是O且X不存在。
39.權(quán)利要求37的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其中對于VLdAb，所述C-末端序列是VEIKpRqX且P是I，(!是I且X是A、AAA或T。
40.二聚體，其包含兩個(gè)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體。
41.權(quán)利要求40的二聚體，其為異二聚體或同二聚體。
42.藥物組合物，其包含權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的二聚體，和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
43.權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的二聚體，其用于藥物。
44.權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的二聚體，其用于治療與VEGF信號轉(zhuǎn)遞相關(guān)的疾病，例如癌癥和/或眼部疾病，例如糖尿病性黃斑水腫(DME)、濕性AMD、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、RVO、和角膜新生血管形成。
45.權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的二聚體的用途，其用于制造治療與VEGF信號轉(zhuǎn)遞相關(guān)的疾病的藥物，所述疾病例如癌癥和/或眼部疾病，例如糖尿病性黃斑水腫(DME)、濕性AMD、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、RVO、和角膜新生血管形成。
46.用于治療患有與VEGF信號轉(zhuǎn)遞相關(guān)的疾病的患者的方法，所述疾病例如癌癥和眼部疾病，例如糖尿病性黃斑水腫(DME)、濕性AMD、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、RVO和角膜新生血管形成，所述方法包括施用治療量的權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的二聚體。
47.權(quán)利要求44-46中任一項(xiàng)的二聚體，其用于人患者的治療和預(yù)防。
48.多核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體。
49.重組的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其包含一個(gè)或多個(gè)編碼權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合構(gòu)建體的多核苷酸序列。
50.生產(chǎn)權(quán)利要求1-39的抗原結(jié)合構(gòu)建體的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求39的宿主細(xì)胞和分離所述抗原結(jié)合構(gòu)建體的步驟。
51.抗原結(jié)合構(gòu)建體，其通過權(quán)利要求50的方法生產(chǎn)。`
【文檔編號】A61P27/02GK103842380SQ201280047197
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月27日
【發(fā)明者】C.阿什曼, I.R.卡奇波爾, Z.休格斯-托馬斯, A.P.路易斯, M.斯蒂沃德 申請人:葛蘭素集團(tuán)有限公司