來(lái)自蘋(píng)果的主要變應(yīng)原Mal d 1的低變應(yīng)原性變體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】公開(kāi)了蘋(píng)果主要變應(yīng)原Mal?d?1的低變應(yīng)原性變體，及其在治療變應(yīng)性疾病中的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】來(lái)自蘋(píng)果的主要變應(yīng)原Mal d 1的低變應(yīng)原性變體
[0001]本發(fā)明涉及Mal dl蛋白質(zhì)的低變應(yīng)原性序列變體、編碼其的核酸分子、包含其的藥物組合物以及它們?cè)谟商O(píng)果(Malus domestica)物種導(dǎo)致的變應(yīng)性疾病的免疫療法中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]變態(tài)反應(yīng)由免疫系統(tǒng)功能異常導(dǎo)致，所述免疫系統(tǒng)通過(guò)產(chǎn)生IgE-類(lèi)抗體與主要包含在花粉、螨、上皮和食品中的無(wú)害蛋白質(zhì)反應(yīng)。
[0003]最近的評(píng)估表明工業(yè)化國(guó)家中超過(guò)25%的人口患有該疾病，如果疾病持續(xù)不愈，則可以導(dǎo)致癥狀?lèi)夯?例如出現(xiàn)哮喘)或?qū)ζ渌儜?yīng)原致敏，由此造成更難以選擇最適當(dāng)?shù)闹委煛?br> [0004]在世界范圍內(nèi)，約三分之一的變應(yīng)性對(duì)象是對(duì)樹(shù)木花粉過(guò)敏。在溫帶地區(qū)，屬于山毛櫸目(Fagales)的樹(shù)(樺樹(shù)、榿木、榛樹(shù)、橡樹(shù)和角樹(shù))的花粉是變應(yīng)性哮喘和鼻炎的主要原因之一。對(duì)樺樹(shù)花粉變應(yīng)的患者約95%產(chǎn)生抗Bet vl的IgE抗體，60%的這類(lèi)患者僅與Bet vl(以登錄號(hào)X15877保存在GenBank的cDNA)反應(yīng)，這是樺樹(shù)花粉的主要變應(yīng)原(I )。
[0005]在食用某些食物(蘋(píng)果、胡蘿卜、榛子和芹菜)后，對(duì)樺樹(shù)花粉變應(yīng)的個(gè)體高百分比(50%-93%)出現(xiàn)變應(yīng)反應(yīng)。樺樹(shù)花粉變應(yīng)患者中的這類(lèi)超敏性被描述為“花粉-食物綜合征(PFS)”，其特征是對(duì)水果、堅(jiān)果和蔬菜的變應(yīng)性。癥狀范圍從上消化道粘膜的反應(yīng)(口服變態(tài)反應(yīng)綜合征)和胃腸道的反應(yīng)至蕁麻疹和哮喘，在某些情況下可以導(dǎo)致過(guò)敏性休克。對(duì)水果的負(fù)面反應(yīng)最常見(jiàn)于蘋(píng)果中。在由樺樹(shù)花粉導(dǎo)致的花粉熱的情況下，該綜合征主要是由Bet vl最初誘導(dǎo)的交叉反應(yīng)性IgE抗體介導(dǎo)(2)。
[0006]這類(lèi)患者的治療主要基于避免從膳食中攝入食物變應(yīng)原。對(duì)于治療對(duì)花粉、動(dòng)物和螨的變態(tài)反應(yīng)，已經(jīng)證實(shí)了脫敏特異性免疫療法(SIT)是有效的病原治療形式，與藥理治療不同，前者積極地影響著作為這類(lèi)疾病`的基礎(chǔ)的一些免疫學(xué)參數(shù)。SIT涉及施用增加劑量的獲自導(dǎo)致疾病的物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)提取物(疫苗)(3)。以這種方式，在患者中逐步誘導(dǎo)出對(duì)該物質(zhì)的一類(lèi)“免疫耐受”，同時(shí)伴隨著變態(tài)反應(yīng)癥狀的降低(如果不是消失的話(huà))。但是，考慮到引起嚴(yán)重副作用(包括過(guò)敏性休克)的高風(fēng)險(xiǎn)，特定的免疫療法通常不用于治療食物變態(tài)反應(yīng)。
[0007]雖然Bet vl和同源食物蛋白質(zhì)之間的交叉反應(yīng)性是PFS誘導(dǎo)的反應(yīng)的潛在原因，但已發(fā)現(xiàn)，使用樺樹(shù)花粉的SIT不導(dǎo)致食物變態(tài)反應(yīng)癥狀的任何改善。
[0008]在胡蘿卜變態(tài)反應(yīng)中已經(jīng)觀察到了該無(wú)效作用，胡蘿卜變態(tài)反應(yīng)主要是由Bet vl的同源物——變應(yīng)原Dau Cl導(dǎo)致的，其中初發(fā)敏化作用是對(duì)樺樹(shù)變應(yīng)原發(fā)生的，而在食用胡蘿卜后，后續(xù)的敏化作用則是針對(duì)不與Bet vl交叉反應(yīng)的Dau cl的新表位的(4)。
[0009]在治療蘋(píng)果變態(tài)反應(yīng)中，使用樺樹(shù)花粉提取物的SIT產(chǎn)生了有爭(zhēng)議的，有時(shí)是有利的結(jié)果，可能是由于Bet vl和Mal dl之間更高的序列同一性導(dǎo)致的(氨基酸序列為60%，與 Dau Cl 僅為 40%)ο
[0010]在1998年的一項(xiàng)研究中，用基于樺樹(shù)花粉提取物的SIT治療的對(duì)樺樹(shù)和蘋(píng)果過(guò)敏的患者中的84%的患者中，經(jīng)過(guò)第一年的治療后，出現(xiàn)食用蘋(píng)果后的OAS (口服變態(tài)反應(yīng)綜合征)癥狀的顯著降低(50%-95%)或完全消失(5)。在2004年公開(kāi)的一項(xiàng)更新的研究中，使用樺樹(shù)花粉提取物的SIT僅在3個(gè)月的治療后，就導(dǎo)致了對(duì)Bet vl和Mal dl的SPT反應(yīng)性的顯著降低。由Bet vl強(qiáng)烈誘導(dǎo)的IgG4抗體表現(xiàn)出與Mal dl的交叉反應(yīng)性，因此支持這樣的假設(shè)，即，抗樺樹(shù)花粉變態(tài)反應(yīng)的SIT也可以降低對(duì)含有Bet vl同源性變應(yīng)原的食物變態(tài)反應(yīng)(6)。同年公開(kāi)的另一項(xiàng)研究(2004)顯示，在對(duì)樺樹(shù)和蘋(píng)果過(guò)敏的患者中，基于樺樹(shù)花粉提取物的SIT顯著改善了由花粉導(dǎo)致的變應(yīng)性癥狀，但不降低蘋(píng)果變態(tài)反應(yīng)的嚴(yán)重程度(7)。
[0011]因此，基于現(xiàn)有知識(shí)，不能確定的認(rèn)為使用樺樹(shù)花粉變應(yīng)原的免疫療法為對(duì)含有Bet vl同源物的食物的變態(tài)反應(yīng)的情形提供顯著好處，所述情形因此應(yīng)該作為獨(dú)立的疾病進(jìn)行治療。
[0012]針對(duì)Bet vl的PFS交叉反應(yīng)性最常涉及的變應(yīng)原之一是Mal dl,這是屬于薔薇科
(Rosaceae)的水果-蘋(píng)果-的主要變應(yīng)原。Mal dl與Bet VI共享約60%的氨基酸序
列(同一性)，交叉反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了存在共同的IgE和T表位(8，9)。
[0013]Mal dl(登錄號(hào)Q9SYW3或AJ417551)是159個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為17.7kDa
(10)。該變應(yīng)原屬于“發(fā)病機(jī)制相關(guān)蛋白”的PR-10家族，即，由植物響應(yīng)環(huán)境脅迫或病理性脅迫時(shí)產(chǎn)生的遍在蛋白質(zhì)，其功能被認(rèn)為與類(lèi)固醇運(yùn)輸相關(guān)。Mal dl位于蘋(píng)果的果皮和果肉中。測(cè)量多種蘋(píng)果變種的蛋白質(zhì)提取物中的Mal dl含量證實(shí)該變應(yīng)原在不同變種中以相當(dāng)不同的濃度存在；在生長(zhǎng)于不同地區(qū)的同一變種中也發(fā)現(xiàn)了 Mal dl含量的變化。此外，即使是在具有低Mal dl含量的變種中，也觀察到變應(yīng)原濃度在果實(shí)的成熟和儲(chǔ)藏過(guò)程中顯著增加。
`[0014]Mal dl由具有至少18個(gè)成員的基因家族所表不,其特征是基因中存在或缺少內(nèi)含子。一些成員在不同的蘋(píng)果變種中是高度保守的(Mai dl.0UMal dl.02)，而其他成員則存在更大的變化(Mai dL04、Mal dl.05、Mal dl.06A、B、C) (11)。當(dāng)在花粉-食物綜合征的患者中進(jìn)行SPT分析時(shí)，觀察到了在由Mal dl.04和Mal dl.06A基因編碼的蛋白質(zhì)變體之間的關(guān)聯(lián)性，以及蘋(píng)果變種的更大的變應(yīng)原性。該類(lèi)研究的結(jié)果可應(yīng)用于鑒別和培育具有較低變應(yīng)原性的蘋(píng)果變種，用作食物或常規(guī)免疫療法的原材料。
[0015]出現(xiàn)用于特定免疫療法的低變應(yīng)原性食物變應(yīng)原可代表避免食物變應(yīng)原的良好替代方案，以及允許治療疾病，所述疾病涉及對(duì)患者健康的高風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)生活質(zhì)量具有顯著的負(fù)面影響，并可以導(dǎo)致不適的營(yíng)養(yǎng)失衡。
[0016]近年來(lái)，大量的注意力集中在研發(fā)更安全、更有效的疫苗，包括在對(duì)IgE結(jié)合重要的氨基酸水平誘變重組蛋白質(zhì)，即，在不導(dǎo)致副作用的條件下有利的影響疾病天然進(jìn)程的低變應(yīng)原性變體(12)。
[0017]文獻(xiàn)中可獲得關(guān)于Mal dl或?qū)儆谒N薇科的其他果實(shí)的同源蛋白質(zhì)的低變應(yīng)原性變體的一些研究。
[0018]基于Bet vl和Mal dl之間的交叉反應(yīng)性,通過(guò)定點(diǎn)誘變同種型Mal d 1.0108上的5個(gè)氨基酸殘基(T10P ;I30V、T57N、T112C和I113V)，生產(chǎn)主要的蘋(píng)果變應(yīng)原——Maldl——的突變體，所述突變體是通過(guò)與Bet vl變應(yīng)原的低變應(yīng)原性突變體類(lèi)似選定的
(9)。由SPT和DBPCFC (雙盲安慰劑-對(duì)照的食物刺激)分析證實(shí)，取代所述氨基酸降低了Mal dl的90%的變應(yīng)原活性。與Bet vl的類(lèi)似物突變體和相應(yīng)的野生型分子平行的測(cè)試了具有5個(gè)氨基酸取代的相同突變體(13)。雖然在免疫印跡測(cè)試中，對(duì)樺樹(shù)和蘋(píng)果過(guò)敏的患者的血清表現(xiàn)出對(duì)Bet vl更大的IgE反應(yīng)性，但也觀察到與兩種測(cè)試的突變體的結(jié)合降低。在ELISA測(cè)定中，在大部分測(cè)試血清(10/14)中，相比野生型變應(yīng)原，觀察到突變體Maldl的IgE結(jié)合降低30%至88%。然而，誘變選定的5個(gè)氨基酸似乎對(duì)Mal dl的主要表位沒(méi)有IgE反應(yīng)性的偏見(jiàn)，因?yàn)樵谝恍┓治鲅逯袥](méi)有觀察到特定IgE結(jié)合的改變(3/14)。
[0019]在Pru avl——與Mal dl同源的主要櫻桃變應(yīng)原中，證實(shí)了絲氨酸112的點(diǎn)狀取代對(duì)IgE識(shí)別分子是關(guān)鍵性的。在同源物Bet vl中的脯氨酸中的相同氨基酸誘變證實(shí)了絲氨酸112在保留交叉反應(yīng)性IgE的表位結(jié)構(gòu)中的重要性。將Pru avl的P環(huán)序列中的Glu45取代為色氨酸證實(shí)了該區(qū)域是與Bet vl交叉反應(yīng)的IgE表位(14)。通過(guò)誘變第28位(Asn28Lys)、第108位(Prol08Ala)或兩個(gè)位置上的氨基酸，獲得了 3個(gè)其他的Pru avl變體。在單突變體(Asn28Lys)和雙突變體(Asn28Lys、Prol08Ala)中觀察到了對(duì)樺樹(shù)和櫻桃過(guò)敏的患者血清中IgE結(jié)合降低多達(dá)80%，而在Prol08位的單突變體僅獲得12%的降低，提示Pru avl中的氨基酸Asn28參與IgE表位。該天冬酰胺暴露在溶劑中，并且是假設(shè)為同源蛋白質(zhì)Bet vl的主要抗原位點(diǎn)的區(qū)域之一的一部分(15)。
[0020]通過(guò)NMR分析和X射線(xiàn)衍射研究Bet vl的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致鑒別出可能涉及IgE結(jié)
合的具有大于600人I的面積的三個(gè)區(qū)域(16)。這3個(gè)區(qū)域暴露在同源變應(yīng)原的由高保守氨
基酸組成的表面上，所述變應(yīng)原是在屬于山毛 櫸目的物種中表達(dá)的，并被認(rèn)為是對(duì)Bet vl與植物花粉的同源蛋白質(zhì)之間的交叉反應(yīng)性負(fù)責(zé)的潛在IgE表位。定點(diǎn)誘變這些區(qū)域中的氨基酸驗(yàn)證了它們參與IgE結(jié)合。Bet vl中的突變例如修飾出多達(dá)5個(gè)分布在分子表面上的不同區(qū)域(包括上述3個(gè)區(qū)域)，且導(dǎo)致變應(yīng)原性降低(17)，所述突變表征出2個(gè)多重突變體(T28、Q32、S45、G108)和(V5、S42、S45、K78、V103、1123、E134、H156、N160)。構(gòu)成3個(gè)Gajhede假設(shè)的IgE表位的氨基酸序列在與Bet vl同源的食物變應(yīng)原中也是保守的。為了降低與Bet vl的表面相似性，位于一個(gè)上述區(qū)域中的Mal dl的保守性氨基酸Thr28、Gln32和Ser45被Bet vl中相應(yīng)位置上存在的氨基酸取代。相比wt對(duì)應(yīng)物，這些殘基的取代不改變突變體Mal dl抑制IgE-Bet vl結(jié)合的能力，同時(shí)在5個(gè)測(cè)試?yán)奈ㄒ灰焕?，消除了相同樺?shù)變態(tài)反應(yīng)患者的血液中的嗜堿性粒細(xì)胞中的組織胺釋放(24)。
[0021]為了鑒別參與花粉-食物綜合征的臨床癥狀的IgE表位，通過(guò)向Bet vl序列移植4個(gè)Mal dl的短肽片段，生成嵌合蛋白質(zhì)(18)。移植區(qū)域包括之前驗(yàn)證過(guò)對(duì)患者與兩種變應(yīng)原(Bet vl和Mal dl)的IgE結(jié)合關(guān)鍵性的氨基酸殘基:T10、F30、S57、S112、1113和D125。使用來(lái)自?xún)山M患者的血清，測(cè)試嵌合蛋白質(zhì)的IgE反應(yīng)性，兩組患者具有樺樹(shù)變態(tài)反應(yīng)，在攝入蘋(píng)果后無(wú)PFS或表現(xiàn)出PFS癥狀。兩組的IgE識(shí)別嵌合分子，但相比具有蘋(píng)果變態(tài)反應(yīng)的患者，無(wú)PFS的組的結(jié)合顯著更低,提示Bet vl上移植的序列參與Bet vl/MaldllgE交叉反應(yīng)性。
[0022]特征是PFS的樺樹(shù)花粉變態(tài)反應(yīng)代表了用于鑒別交叉反應(yīng)性IgE表位的優(yōu)秀的研究模型，所述模型允許生產(chǎn)具有降低的IgE結(jié)合能力的重組變應(yīng)原。
[0023]長(zhǎng)期以來(lái)，在特定的脫敏免疫療法中使用改造的多聚體分子的可能性都被認(rèn)為是有吸引力的，所述多聚體分子由來(lái)自相同生物或不同生物的不同變應(yīng)原組成。該方法允許在單個(gè)分子中裝配多個(gè)變應(yīng)原，其優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)含有精確摩爾比的變應(yīng)原的單一制品。在單個(gè)雜合分子中關(guān)聯(lián)Bet vl和Maldl應(yīng)該展示兩種分子的T表位庫(kù),可誘導(dǎo)針對(duì)兩種變應(yīng)原的強(qiáng)IgG保護(hù)性應(yīng)答(17)。誘導(dǎo)特異性針對(duì)敏化變應(yīng)原的IgG抗體是與由SIT導(dǎo)致的益處的相關(guān)因素之一。這類(lèi)(保護(hù)性)抗體可以抑制與抗原的IgE結(jié)合，改變分子的三維構(gòu)象。
[0024]已進(jìn)行一些研究探討使用變應(yīng)原Bet vl的三聚體衍生物的SIT對(duì)樺樹(shù)花粉變態(tài)反應(yīng)的臨床效果(19)。治療誘導(dǎo)強(qiáng)的IgGl和IgG4特異性變應(yīng)原抗體應(yīng)答，和降低鼻與皮膚的反應(yīng)性，但沒(méi)有產(chǎn)生臨床癥狀的顯著改善。
[0025]在用胡蘿卜變應(yīng)原Dau cl的二聚體wt或第112位的突變體形式治療的小鼠實(shí)驗(yàn)中，也觀察到了顯著的IgG抗體應(yīng)答，所述Dau Cl與Bet vl變應(yīng)原同源(20)。兩種二聚體變體都被證實(shí)比相應(yīng)單體形式的混合物抗原性更高。此外，針對(duì)Dau Cl生產(chǎn)的所有鼠血清(單體、二聚體、wt和突變體形式)都含有與人IgE識(shí)別的表位交叉反應(yīng)的特異性抗體，提示結(jié)構(gòu)上改變的抗原(如二聚體)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)構(gòu)象表位特異性的抗體。
[0026]使用低變應(yīng)原性雜交變體(如Bet vl-Mal dl)可消除由對(duì)食物變應(yīng)原的嚴(yán)重副反應(yīng)導(dǎo)致的難題，當(dāng)進(jìn)行使用樺樹(shù)花粉提取物的SIT時(shí)，改善了不僅對(duì)Bet vl的致耐原性應(yīng)答，而且也改善了對(duì)蘋(píng)果的主要變應(yīng)原的致耐原性應(yīng)答。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027]現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過(guò)取代特定的氨基酸殘基來(lái)修飾序列，可以降低Mal dl變應(yīng)原對(duì)IgE的結(jié)合。
[0028]根據(jù)其第一方面，本發(fā)明提供從蘋(píng)果的主要變應(yīng)原Mal dl(wt序列SEQ ID NO:1)或其與SEQ ID N0:1具有至少95%，優(yōu)選至少97%序列同一性的同種型，獲得的Mal dl序列變體，所述變體的特征在于:
[0029]a)與野生型Mal dlSEQ ID NO:1相比，對(duì)IgE的反應(yīng)性降低；
[0030]b)當(dāng)與SEQ ID NO:1比對(duì)時(shí)，氨基酸序列在SEQ ID NO:1的第25位和第78位的Asp和/或Asn殘基中，或在Mal dl的所述同種型的相應(yīng)位置中存在至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)取代。
[0031]Mal dl的同種型與SEQ ID NO:1具有至少95%序列同一性，包括以登錄號(hào)Maldl.0201 (Uniprot Q40280)和 Mal dl.0204 (Uniprot Q9SYV4)保藏的天然序列。
[0032]變應(yīng)原Mal dl的優(yōu)選變體是這樣的變體，所述變體的殘基Asp25被中性、極性或堿性的氨基酸取代，所述氨基酸優(yōu)選選自Ala、Thr> Gly、Pro、Leu、lie、Ser> Phe> Lys和Arg,更優(yōu)選Ala、Thr、Ser、Gly、Lys和Arg,而殘基Asn78被中性、酸性或堿性的氨基酸取代，所述氨基酸優(yōu)選選自 Ala、Gly、Pro、Leu、lie、Phe> Lys、Arg、Asp 和 Glu,更優(yōu)選 Ala、Gly、Lys、Arg、Asp 和 Glu。
[0033]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有2個(gè)取代的本發(fā)明的變體具有SEQ ID N0:2中確定的序列。
[0034]本發(fā)明的變應(yīng)原Mal dl的取代變體對(duì)垂枝樺花粉和蘋(píng)果過(guò)敏的患者血清表現(xiàn)出比野生型分子降低至少10%的IgE反應(yīng)性，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少80%。
[0035]在來(lái)自變應(yīng)性個(gè)體的血清庫(kù)中通過(guò)ELISA測(cè)定分析變體SEQ ID NO: 2的IgE反應(yīng)性(圖1)。相對(duì)于wt變應(yīng)原Mal dl (SEQ ID NO:1)，當(dāng)用來(lái)自對(duì)樺樹(shù)花粉和蘋(píng)果過(guò)敏的患者的血清庫(kù)孵育時(shí)，所述變體表現(xiàn)出IgE反應(yīng)性降低89% (至lyng/ml) (SEQ ID N0:2)。在相同條件下，Mal dl變應(yīng)原的變體的另一個(gè)例子(具有取代Asn78Ala) (SEQ ID N0:11)表現(xiàn)出IgE結(jié)合降低70.9% (圖1)。
[0036]這些結(jié)果由ELISA抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該實(shí)驗(yàn)可以評(píng)測(cè)來(lái)自不同蛋白質(zhì)的同源表位的反應(yīng)性。發(fā)現(xiàn)利用0.3125 μ g/ml抑制劑，wt Mal dl蛋白質(zhì)(SEQ ID N0:1)與來(lái)自血清庫(kù)的IgE的結(jié)合被抑制93.3% (當(dāng)血清用相同蛋白質(zhì)預(yù)處理時(shí))，而當(dāng)用變體SEQ ID NO: 2預(yù)溫育時(shí)，則被抑制25.4% (圖2)。在相同條件下，在Asn78具有單取代的變體抑制SEQ IDNO: 1-1gE 結(jié)合 19.7% (圖 2，SEQ ID NO: 11)。
[0037]這些結(jié)果明確提示取代SEQ ID NO:1的第25位和/或第78位的氨基酸干擾IgE對(duì)Mal dl變應(yīng)原的識(shí)別。
[0038]還觀察到以濃度0.625 μ g/ml使用的變應(yīng)原wt Mal dlSEQ ID N0:1和低變應(yīng)原性變體SEQ ID NO: 2以不同程度的效果抑制wt Bet vl與樺樹(shù)-和蘋(píng)果陽(yáng)性血清庫(kù)中的IgE結(jié)合。當(dāng)用相同蛋白質(zhì)wt Bet vl預(yù)處理血清時(shí),抑制的量高達(dá)94%,當(dāng)用蛋白質(zhì)SEQ IDNO:1預(yù)溫育時(shí)，抑制的量是46%，當(dāng)用蛋白質(zhì)SEQ ID NO: 2預(yù)溫育時(shí)，抑制的量是4.2%，并且當(dāng)用單取代變體SEQ ID NO: 11預(yù)處理血清時(shí)，抑制的量是32.1% (圖3)。
[0039]用于免疫Balb/c小鼠的wt Mal dl變應(yīng)原SEQ ID NO:1和低變應(yīng)原性變體SEQID N0:2誘導(dǎo)特異性IgG應(yīng)答(圖4)。特別是，針對(duì)SEQ ID NO:2生產(chǎn)的抗體也識(shí)別wt對(duì)應(yīng)物SEQ ID NO:1 (圖5)，表明修飾第25和78位的殘基不導(dǎo)致分子IgG表位的重大改變。此外，用變體SEQ ID NO: 2免疫接種誘導(dǎo)比用wt對(duì)應(yīng)物SEQ ID NO:1所獲得的免疫應(yīng)答更高和更快的免疫應(yīng)答。相反，用不相關(guān)抗原免疫的動(dòng)物血清中存在的抗體不能識(shí)別wt Maldl和 SEQ ID NO:2。
[0040]從第五周開(kāi)始，可 檢測(cè)到用SEQ ID N0:2免疫小鼠誘導(dǎo)的抗體與蘋(píng)果提取物的反應(yīng)性，峰值在第七周，此時(shí)用SEQ ID NO:1免疫產(chǎn)生的抗體僅觀察到非常弱的識(shí)別，盡管在7周時(shí)，對(duì)wt Mal dl的抗體滴度與用SEQ ID NO:2免疫小鼠獲得的抗體滴度是相當(dāng)?shù)?圖6)。
[0041]對(duì)于誘導(dǎo)能夠在變應(yīng)原和IgE結(jié)合中競(jìng)爭(zhēng)的保護(hù)性抗體，觀察到針對(duì)SEQ ID NO:2產(chǎn)生的IgG抗體比wt蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:1)更有效的(ρ〈(λ 001)抑制Mal dl (SEQ IDNO:1)與對(duì)樺樹(shù)和蘋(píng)果過(guò)敏的患者的IgE的結(jié)合(圖7)。ELISA抑制實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，來(lái)自用SEQID NO: 2免疫的小鼠的IgG抑制7位患者血清的IgE反應(yīng)性平均為66% (數(shù)值范圍從49.6至82.2%)，針對(duì)SEQ ID NO:1產(chǎn)生的IgG抑制平均為32.3% (11.5_53%)。作為對(duì)照使用的未免疫接種的動(dòng)物的血清對(duì)特異性IgE-Mal dl結(jié)合不產(chǎn)生任何抑制作用。
[0042]本發(fā)明的另一方面涉及與Mal dl片段相應(yīng)的免疫活性肽，所述免疫活性肽包含至少一種上述取代。所述肽優(yōu)選含有15-35個(gè)、更優(yōu)選15-20個(gè)氨基酸殘基。本文使用的表達(dá)方式“免疫活性的”意指肽必須能夠刺激不依賴(lài)IgE的免疫應(yīng)答。
[0043]本發(fā)明的另一方面涉及含有本文所述的蘋(píng)果主要變應(yīng)原的序列變體和垂枝樺花粉的Bet vl主要變應(yīng)原的低變應(yīng)原性變體的雜交蛋白質(zhì)，兩者可能由接頭分隔開(kāi)。
[0044]在本發(fā)明的雜交蛋白質(zhì)中，所述Mal dl和Bet vl的低變應(yīng)原性變體被按頭-尾方向放置在氨基末端或羧基末端均可；換言之，當(dāng)雜交蛋白質(zhì)的氨基末端與Bet vl或Maldl的氨基末端一致時(shí)，雜交蛋白質(zhì)的羧基末端則分別與蛋白質(zhì)Mal dl或Bet vl的羧基末端一致。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，雜交蛋白質(zhì)的氨基末端被Bet vl占據(jù),而羧基末端則被Maldl占據(jù)(圖8)。
[0045]分隔Bet vl和Mal dl的突變序列的接頭優(yōu)選由8個(gè)氨基酸的鏈組成,更優(yōu)選由2個(gè)氨基酸的鏈組成，甚至更優(yōu)選由二肽EF (Glu-Phe)組成。
[0046]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交蛋白質(zhì)含有描述在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W02007/073907和歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP2172215中的Bet vl的低變應(yīng)原性變體，兩篇專(zhuān)利申請(qǐng)是由相同 申請(qǐng)人:提交的，并通過(guò)引用全文整合到本文中。特別是，包含在本發(fā)明的雜交蛋白質(zhì)中的Bet vl的低變應(yīng)原性變體是從序列SEQ ID NO:5的蛋白質(zhì)或其同種型通過(guò)用選自Ala、Thr、Gly、Pro、Leu、lie、Phe和Ser的中性或極性氨基酸取代了第54、115和/或123位(SEQ ID NO: 5的情況下)或所述同種型的相應(yīng)位置的Lys殘基獲得的，所述同種型與所述序列SEQ ID NO:5至少94%，優(yōu)選至少97%相同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Bet vl的低變應(yīng)原性變體是SEQ ID N0:6。本文所述的Bet vl的低變應(yīng)原性變體描述在上述兩個(gè)專(zhuān)利申請(qǐng)中。
[0047]與SEQ ID NO: 5具有超過(guò)94%序列同一性的Bet vl的同種型包括以登錄號(hào)Betvl-a (Uniprot P15494)、Bet vl-j (Uniprot P43184)和 Bet vl-f (Uniprot P43179)保藏的天然分子。
[0048]序列SEQ ID N0:4的這樣的雜交蛋白質(zhì)是特別優(yōu)選的，其中Bet vl的低變應(yīng)原性變體(SEQ ID N0:6)通過(guò)二肽EF接頭，按頭-尾方向(Bet vl — Mal dl)結(jié)合Mal dl的低變應(yīng)原性變體(SEQ ID NO:2)。
[0049]與wt雜交體相 比，本發(fā)明的雜交變體表現(xiàn)出IgE結(jié)合降低至少10%，優(yōu)選50%，并且更優(yōu)選70%。
[0050]在對(duì)樺樹(shù)花粉和蘋(píng)果過(guò)敏的個(gè)體的血清庫(kù)中，通過(guò)ELISA測(cè)定分析變體SEQ IDN0:4的IgE反應(yīng)性(圖9)。當(dāng)與血清孵育時(shí)，與wt雜交體(SEQ ID N0:3)相比，所述變體表現(xiàn)出IgE反應(yīng)性平均降低55.1%。
[0051]這些結(jié)果是由ELISA抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)的。觀察到在等濃度(1.25 μ g/ml)的抑制劑條件下，當(dāng)血清用單wt變應(yīng)原的混合物預(yù)處理時(shí)，吸附在孔上的變應(yīng)原wt Bet vlCSEQ IDNO:5)與包含在7位患者血清中的特異性IgE之間的結(jié)合平均被抑制79.9%，當(dāng)血清用2種誘變組分的混合物預(yù)溫育時(shí)，平均抑制53.3%，而當(dāng)血清用SEQ ID NO:3預(yù)處理時(shí)，平均抑制為63.3%，并且當(dāng)血清用SEQ ID NO:4預(yù)溫育時(shí)，平均抑制32.1% (表2和圖10A)。突變的雜交體SEQ ID NO:4在Bet vl_IgE結(jié)合中競(jìng)爭(zhēng)的能力比SEQ ID NO: 3和兩種誘變變應(yīng)原(mut Bet vl-SEQ ID N0:6 和 mut Mal dl-SEQ ID NO:2)的混合物顯著減小(ρ〈0.05)。
[0052]在等量抑制劑的條件下(1.25μ g/ml),當(dāng)血清用單wt變應(yīng)原的混合物預(yù)處理時(shí)，吸附在孔上的wt Mal dl變應(yīng)原(SEQ ID NO:1)與包含在7位患者血清中的特異性IgE之間的結(jié)合平均被抑制82.8%，當(dāng)血清用2種誘變組分的混合物預(yù)溫育時(shí)，平均抑制51.6%，而當(dāng)血清用SEQ ID NO: 3預(yù)處理時(shí)，平均抑制為74.6%，并且當(dāng)血清用SEQ ID NO:4預(yù)溫育時(shí)，平均抑制63.6%(表3和圖10B)。針對(duì)Mal dl獲得的結(jié)果與針對(duì)Bet vl測(cè)量的結(jié)果相當(dāng)，SEQ ID NO:4是例外，它被證實(shí)更與Mal dl反應(yīng)。
[0053]還觀察到用于免疫接種Balb/c小鼠的低變應(yīng)原性變體SEQ ID N0:4誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠識(shí)別存在于垂枝樺提取物中的Bet vl變應(yīng)原的特異性IgG (圖11)。雜交分子SEQ IDNO: 4誘導(dǎo)的特異性IgG應(yīng)答與用樺樹(shù)提取物、SEQ ID NO: 3或各wt或誘變變應(yīng)原的混合物在小鼠中誘導(dǎo)的應(yīng)答相似。相反，在用不相關(guān)抗原免疫接種的動(dòng)物的血清中存在的抗體不能識(shí)別SEQ ID NO: 3和4，以及wt和突變變應(yīng)原的混合物。
[0054]低變應(yīng)原性雜交變體SEQ ID NO:4也能夠誘導(dǎo)對(duì)蘋(píng)果果肉提取物組分的特異性IgG應(yīng)答(圖12)。在初次免疫接種后5周，用SEQ ID NO:4免疫接種誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答比用等摩爾量的兩種單誘變變體的混合物(mut混合)免疫接種獲得的應(yīng)答大30倍，比wt雜交變應(yīng)原SEQ ID NO:3的應(yīng)答大3.2倍。從第5周起，用樺樹(shù)提取物免疫接種誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠識(shí)別包含在蘋(píng)果提取物中的Mal dl的IgG。
[0055]此外，當(dāng)其是雜交低變應(yīng)原性分子SEQ ID NO:4的一部分時(shí)，低變應(yīng)原性變體SEQID N0:2的免疫原性增加。在用雜交變體SEQ ID NO:4免疫接種的小鼠中，特異性針對(duì)wtMal dl (SEQ ID N0:1)和突變體Mal dl (SEQ ID NO: 2)的IgG抗體的誘導(dǎo)作用比用單變應(yīng)原SEQ ID N0:2免疫接種的小鼠高得多且早得多。在治療的第四周中，已經(jīng)觀察到SEQID N0:4誘導(dǎo)作用的實(shí)質(zhì)性增加，而用蛋白質(zhì)SEQ ID N0:2免疫接種的動(dòng)物花費(fèi)了至少七周時(shí)間來(lái)獲得相同的應(yīng)答(圖13-A，B)。
[0056]關(guān)于誘導(dǎo)能夠抑制變應(yīng)原和IgE之間結(jié)合的保護(hù)性抗體，已觀察到針對(duì)SEQ IDN0:4生產(chǎn)的IgG抗體比用兩種單突變變體的混合物(mut混合)誘導(dǎo)的抗體更有效的(ρ〈0.05)抑制Bet vl (SEQ ID NO:5)與對(duì)樺樹(shù)和蘋(píng)果過(guò)敏的患者的IgE的結(jié)合(圖14)。ELISA抑制實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了在用SEQ ID NO:4免疫接種的小鼠中生產(chǎn)的IgG抑制7名患者的血清的IgE反應(yīng)性，平均抑制87.7% (數(shù)值范圍從77.4至94.7%)，而針對(duì)兩種誘變的變體的混合物(mut混合)產(chǎn)生的抗體則平均抑制82% (63.5-92.3%);針對(duì)wt蛋白質(zhì)的混合物(wt混合)產(chǎn)生的IgG抗體平均抑制結(jié)合54.7% (32.4-68.6%)，而用wt雜交SEQ ID NO: 3免疫接種獲得的抗體則平均抑制82.2% (51.9-93.5%)。
[0057]用SEQ ID N0:4免疫接種的小鼠中誘導(dǎo)的IgG抗體還抑制在Mal dl(SEQ ID NO:1)和對(duì)樺樹(shù)和蘋(píng)果過(guò)敏的患者的血清中的IgE之間的結(jié)合，平均抑制47.5%，如果它們是用wt蛋白質(zhì)的混合物、突變變體的混合物或免疫原SEQ ID N0:3免疫接種的，則分別平均抑制
9.9%, 53.5% 和 59.4% (圖 15)。
[0058]用作對(duì)照的未免疫接種的動(dòng)物的血清不導(dǎo)致對(duì)特異性IgE與Bet vl和Mal dl的結(jié)合的任何抑制作用。
[0059]使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，通過(guò)誘變Mal dl (SEQ ID NO: 7)>Bet vI (SEQID N0:8)、其同種型或天然變體的cDNA序列，或wt雜交物的cDNA序列(SEQ ID NO:9),可容易地制備本發(fā)明的取代變體(21)。
[0060]編碼SEQ ID NO: 2和4所示的(單體)雙取代變體或雜交變體的cDNA序列分別報(bào)告于 SEQ ID NO: 10 和 19 中。
[0061]因此，本發(fā)明的其他方面涉及編碼本文所述的變應(yīng)原Mal dl變體的核酸分子、編碼來(lái)自其的肽的核酸分子或編碼雜交蛋白質(zhì)Mal dl-Bet vl的核酸分子,和包含所述分子與用于在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)控制的元件的表達(dá)載體，所述元件如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、信號(hào)序列、或其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。載體可以是質(zhì)粒、病毒、噬菌體或遺傳工程中通常使用的任何其他載體。
[0062]本發(fā)明還包括用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞。原核細(xì)胞例如大腸桿菌(Escherichia coli)或枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis),或真核細(xì)胞例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)通常用作克隆和cDNA表達(dá)的載體。
[0063]本發(fā)明的低變應(yīng)原性變體還可作為融合蛋白制備。
[0064]由于它們降低的IgE反應(yīng)性，本發(fā)明的Mal dl變體可方便地用于制備藥物組合物(例如片劑)，所述藥物組合物用于對(duì)蘋(píng)果和/或垂枝樺花粉的過(guò)敏的個(gè)體的免疫療法。
[0065]因此本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物，其包含有效量的Mal dl的低變應(yīng)原性變體，任選和其他垂枝樺的變應(yīng)原，和可藥用載體、賦形劑或佐劑組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物以適當(dāng)?shù)囊呙缧问接糜谧儜?yīng)性疾病的預(yù)防性或治療性治療，所述疾病如支氣管哮喘和鼻炎、結(jié)膜炎和口服變態(tài)反應(yīng)綜合征。舌下、皮下和透皮的施用形式是最優(yōu)選的。
[0066]接種的原理和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，描述在例如(22)中。
[0067]下列實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
實(shí)施例
[0068]除非另行指出，下列實(shí)施例中所用方法描述于Sambrook, Fritsch ETManiatis “Molecular cloning:A laboratory manual，，第二版,第 1-2-3 卷，CSH Lab 出版，1989。
[0069]實(shí)施例1 -編碼Mal dl奪應(yīng)原的cDNA的位點(diǎn)特異件誘奪
[0070]編碼Mal dl變應(yīng)原的cDNA(SEQ ID NO: 7，5’前是編碼6個(gè)組氨酸的序列)的位點(diǎn)特異性誘變通過(guò)原核載體(pBluescript，GenBank登錄號(hào)X52327)中的cDNA克隆，然后是PCR擴(kuò)增進(jìn)行。PCR反應(yīng)中用作引物的寡核苷酸(表1)具有合適的堿基取代。對(duì)于每個(gè)誘變，使用結(jié)合到DNA鏈相應(yīng)區(qū)域的互補(bǔ)寡核苷酸(21)。擴(kuò)增后，限制酶DpnI催化的酶促消化選擇性降解未改變的原模板。`然后用誘變的分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。根據(jù)Sanger(法)對(duì)獲自單細(xì)菌菌落的克隆進(jìn)行測(cè)序，以確定cDNA中正確的堿基修飾以及不存在非特定的突變。
[0071]在PCR擴(kuò)增后，在原核載體(pBluescript，GenBank登錄號(hào)X52327)中通過(guò)cDNA克隆進(jìn)行Mal dl變應(yīng)原(SEQ ID NO: 7，5’前端為編碼六組氨酸的序列)編碼cDNA的位點(diǎn)特異性誘變。在PCR反應(yīng)中用作引物的寡核苷酸(表1)具有恰當(dāng)?shù)膲A基取代。對(duì)于每種誘變，使用與DNA鏈的相應(yīng)區(qū)域結(jié)合的互補(bǔ)寡核苷酸(21)。在擴(kuò)增后，通過(guò)限制性酶Dpn I催化的酶促消化選擇性降解不變的原始模板。然后，用誘變分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。根據(jù)Sanger測(cè)序從單細(xì)菌集落獲得克隆，確定正確的堿基修飾和cDNA中缺少的非特定的突變。
[0072]表1.位點(diǎn)特異性誘變中用作引物的寡核苷酸序列。突變的堿基為黑體字符。
[0073]
亥苷酸I序列
MaldlD25 Gcc ttt gtc ctt get get gac aac ctc (SEQ ID NO:12)
MaldlN78 Gtt gac gag gca gcc tac tea tac gcc (SEQ ID NO:13)
[0074]實(shí)施例2 _構(gòu)建編碼里予生型Bet vl-Mal dl雜交分子的質(zhì)粒(wtHybrid)
[0075]通過(guò)融合編碼單變應(yīng)原的cDNA，獲得含有野生型Bet vl-Mal dl雜交物的遺傳信息的雜交分子。
[0076]對(duì)Betvl 使用 Bet vlDIM FWCggt gtt ttc aat tac gaa act g-SEQ ID NO: 14)和 Bet vlDIM Eco RV(Gc Raa ttc gtt gta ggc ate ggag-SEQ ID NO: 15)寡核苷酸引物，對(duì) Mal dl 使用 Mal dlDIM Eco FW (cgc gaa ttc ggt gtc tac aca ttt gag aac g-SEQID NO:16)和 Mal dlDIM Bam RV (Gcg gga tcc tta gtt gta tgc gtc ggg gtg-SEQ IDNO: 17)寡核苷酸引物，通過(guò)PCR分別獲得編碼成熟Bet vl和Mal dl蛋白質(zhì)的cDNA。使用Bet vlSEQ ID N0:8 和 Mal dlSEQ ID N0:7 克隆作為模板。
[0077]通過(guò)用Bet vlDIM Kpn FW (gcg ggt acc cat atg cat cac cat cac cat cacggt gtt ttc aat tac gaa act g-SEQ ID NO: 18)替換Bet vlDIM FW引物，重新擴(kuò)增從Betvl獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而在Bet vl序列的上游插入編碼六組氨酸的序列。在Bet vl擴(kuò)增產(chǎn)物的5’插入Kpn I位點(diǎn)和Nde I位點(diǎn)(含有ATG)，在其3’插入Eco R I位點(diǎn)替換終止密碼子。在Mal dl的5’插入Eco R I位點(diǎn)替換ATG，在其3’的終止密碼子之后插入BamH I位點(diǎn)。純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用Kpn I和Eco R I限制性酶(Bet vl)或Eco R I和Bam H I(Mai dl)(限制性位點(diǎn)是引物中下劃線(xiàn)的)消化,之后插入到pEt3c載體(Stratagene, LaJolla，CA)的Kpn I/Bam H I位點(diǎn)中，獲得能夠表達(dá)位于六組氨酸序列之前的Bet vl-Maldl融合蛋白的構(gòu)建體。導(dǎo)入Eco R I限制性位點(diǎn)是克隆片段必需的，這允許在兩個(gè)蛋白質(zhì)的連接處插入2個(gè)氨基酸(谷氨酸和苯丙氨酸)而不改變閱讀框(圖8)。
[0078]通過(guò)Sanger方法，測(cè)序從單個(gè)細(xì)菌菌落獲得的克隆，驗(yàn)證堿基改變是正確的，以及在cDNA中沒(méi)有非特定的突變。
[0079]實(shí)施例3-構(gòu)律編碼突奪體Bet vl~Mal dl雜奪分子的質(zhì)粒(MutHvbrid)
[0080]按照實(shí)施例2中描述的用于野生型雜交變體的方法，獲得編碼突變體Bet vl-Maldl雜交物的雜交分子。
[0081]用于PCR反應(yīng)中的寡核苷酸對(duì)是相同的，而用作模板的cDNA編碼兩種低變應(yīng)原性變體，其序列在本文中如SEQ ID NO:20 (對(duì)于Bet vl突變體)和SEQ ID NO: 10 (Mai dl突變體)所示。
[0082]通過(guò)Sanger方法，測(cè)`序從單個(gè)細(xì)菌菌落獲得的克隆，驗(yàn)證堿基改變是正確的，以及在cDNA中沒(méi)有非特定的突變。
[0083]實(shí)施侈!I 4 -牛.產(chǎn)Mal dl矛口 Bet vl蛋白質(zhì)、相應(yīng)的突變體、wtHybrid矛口 MutHybrid
[0084]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(23)，將前面是六組氨酸的編碼序列的野生型Bet vl (SEQ IDN0:8)和 Mal dl (SEQ ID NO:7) cDNA、誘變的 cDNA (SEQ ID N0:20 和 SEQ ID NO: 10)、和改造的wt和Mut雜交cDNA (SEQ ID NO:9el9)克隆到表達(dá)載體中，并在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)。離心收集細(xì)胞,重懸于IOOmM NaH2POj^沖液，pH8中并超聲裂解。離心分離重組蛋白。將含有不溶蛋白質(zhì)聚集體的沉淀重懸于變性緩沖液尿素6M、NaH2PO4IOOmM, TrislOmM pH8中，并在20°C下攪拌60分鐘。將溶解的重組蛋白從不溶性殘?jiān)须x心分離，并通過(guò)使用這樣的瓊脂糖柱的親和層析從上清液中純化，所述瓊脂糖柱結(jié)合了與變應(yīng)原融合的六組氨酸部分相互作用的氨三乙酸螯合型鎳離子。在(NH4) HC035mM溶液中4°C透析18小時(shí)來(lái)重折疊純化的蛋白質(zhì)。
[0085]實(shí)施例5 -變應(yīng)性受試者血 清的表征
[0086]血清收集自具有對(duì)垂枝樺花粉有季節(jié)性變態(tài)反應(yīng)臨床史，并具有對(duì)Bet vl和Maldl變應(yīng)原特異的RAST3+反應(yīng)性的個(gè)體，然后以單獨(dú)或混合的形式使用這些血清。使用來(lái)自非變應(yīng)性患者的血清庫(kù)作為陰性對(duì)照。
[0087]實(shí)施侈I丨6-MaI dl變體對(duì)血?青庫(kù)中IgE的反應(yīng)件的ELISA分析
[0088]通過(guò)在4°C下溫育16小時(shí)，將wt變應(yīng)原(SEQ ID NO:1)和誘變的變體(SEQ IDNO: 2，SEQ ID NO: 11)的在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中連續(xù)三倍稀釋的等分試樣吸附到ELISA分析用聚苯乙烯(polystirene)板的孔上。用洗漆溶液(60mM含有
0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH6.5)洗滌孔，并用稀釋溶液(150mM磷酸鹽緩沖液中含25% 山羊血清、ImM EDTA、0.05%Tween20、0.01% 鄰乙汞硫基苯酸鈉(Thiomersal)，ρΗ7.4)封閉。向每個(gè)樣品中加入60 μ I來(lái)自RAST3+或非變應(yīng)性對(duì)象的人血清庫(kù)的稀釋緩沖液中的等分試樣，在25°C溫育2小時(shí)。洗滌三次后，加入綴合過(guò)氧化物酶的抗人-1gE血清(稀釋緩沖液中1:4000)，再在25°C溫育1.5小時(shí)。洗滌三次后，加入100 μ I TMB試劑(BioFXLaboratories, Owings Mills, MD),并在 25°C 溫育 15 分鐘，進(jìn)行比色反應(yīng)。加入 100μΙΙΝHCl 終止反應(yīng)，并使用酶標(biāo)儀(microplate reader spectrophotometer)在 450nm 處讀數(shù)。通過(guò)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。應(yīng)用有一些修飾的相同操作規(guī)程，測(cè)試改造的wt和Mut雜交物的IgE反應(yīng)性。
[0089]在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中，按1:2的比例制備連續(xù)稀釋的雜交變應(yīng)原(SEQ ID NO: 3和4)，起始濃度為150nM，并吸附到聚苯乙烯(polystirene)板的孔上。在稀釋溶液中1:2.5稀釋對(duì)Bet vl和Mal dl陽(yáng)性或來(lái)自作為陰性對(duì)照的非變應(yīng)性對(duì)象的血清庫(kù)，加入每個(gè)孔(70 μ I )，并在25°C溫育3小時(shí)。[0090]實(shí)施例7-ELISA抑制測(cè)定-Mal dl的單體奪體抑制Mal dl與血清中的IgE結(jié)合
[0091]通過(guò)在4°C下預(yù)溫育16小時(shí)，將在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的等量(0.1yg)野生型Mal dl吸附到用于ELISA分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗滌溶液(60mM含有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH6.5)洗滌孔，并用稀釋溶液(150mM磷酸鹽緩沖液中含15%山羊血清、ImM EDTA、0.05%Tween20, pH7.4)封閉游離的位點(diǎn)。在25°C下，用4倍連續(xù)稀釋的wt或誘變的變應(yīng)原(起始濃度為5 μ g/ml)預(yù)溫育1:3稀釋的Bet vl和Mal dl陽(yáng)性的混合人血清等分試樣(100 μ 1)2小時(shí)。然后將混合物加入到每個(gè)孔中，并在4°C溫育16小時(shí)。在用0.06M磷酸，pH6.5,0.05% Tween-20緩沖液洗滌三次后，加入在稀釋緩沖液中1:4000稀釋的綴合了過(guò)氧化物酶的抗人IgE血清，并在25°C溫育1.5小時(shí)。洗滌三次后，通過(guò)加入 100 μ I TMB 試劑(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)獲得比色反應(yīng)顯色，在25°C溫育15分鐘。通過(guò)加入100 μ IlN HCl終止反應(yīng)，用分光光度儀在450nm處讀數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)反應(yīng)。使用下列公式計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù):100χ[(Α-Β)/Α]，其中A是無(wú)抑制劑時(shí)450nm處的吸光度，而B(niǎo)是存在抑制劑時(shí)的吸光度。數(shù)據(jù)是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所代表的。
[0092]實(shí)施例8-ELISA抑制測(cè)定-Mal dl的單體奪體抑制Bet vl與血清中的IgE結(jié)合
[0093]通過(guò)在4°C下預(yù)溫育16小時(shí)，將在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的等量(0.1 μ g)野生型Bet vl吸附到用于ELISA分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗滌溶液(60mM含有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH6.5)洗滌孔，并用稀釋溶液(150mM磷酸鹽緩沖液中含15%山羊血清、ImM EDTA、0.05%Tween20, pH7.4)封閉游離的位點(diǎn)。在25V下，用連續(xù)4倍稀釋的wt Bet vl、wt Mal Dl或誘變的變體(起始濃度為10μ g/ml)預(yù)溫育I: 3稀釋的Bet vl和Mal dl陽(yáng)性的混合人血清等分試樣(100 μ I) 2小時(shí)。然后將混合物加入到每個(gè)孔中，并在4°C溫育16小時(shí)。在用0.06M磷酸，pH6.5,0.05% Tween-20緩沖液洗滌三次后，加入在稀釋緩沖液中1:4000稀釋的綴合了過(guò)氧化物酶的抗人IgE血清，并在25°C溫育1.5小時(shí)。洗滌三次后，通過(guò)加入100 μ I TMB試劑(BioFX Laboratories, OwingsMills, MD)獲得比色反應(yīng)顯色，在25°C溫育15分鐘。通過(guò)加入100 μ IlN HCl終止反應(yīng)，用分光光度儀在450nm處讀數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)反應(yīng)。使用下列公式計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù):IOOx [ (A-B)/A]，其中A是無(wú)抑制劑時(shí)450nm處的吸光度，而B(niǎo)是存在抑制劑時(shí)的吸光度。數(shù)值是通過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所確定的。
[0094]實(shí)施例9-ELISA 抑制測(cè)定-SEQID N0:3 和 SEQ ID NO:4 抑制 Betvl 或 Mal dl 與血.清中的IgE結(jié)合
[0095]通過(guò)在4°C下預(yù)溫育16小時(shí)，將在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的等量(0.1 μ g)野生型Bet vl或Mal dl吸附到用于ELISA分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗滌溶液(60mM含有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH6.5)洗滌孔，并用稀釋溶液(150mM磷酸鹽緩沖液中含15%山羊血清、ImM EDTA、0.05%Tween20, pH7.4)封閉游離的位點(diǎn)。在25°C下，用等量(1.25 μ g/ml)的野生型變應(yīng)原、誘變或改造的變體(雜交物)預(yù)溫育1:3稀釋的Bet vl和Mal dl陽(yáng)性的混合人血清庫(kù)的等分試樣(70 μ 1)2小時(shí)。然后將混合物加入到每個(gè)孔中，并在4°C溫育16小時(shí)。在用0.06M磷酸，pH6.5,0.05% Tween-20緩沖液洗滌三次后，加入在稀釋緩沖液中1:4000稀釋的綴合了過(guò)氧化物酶的抗人IgE血清，并在25°C溫育1.5小時(shí)。洗滌三次后，通過(guò)加入100 μ I TMB試劑(BioFX Laboratories, OwingsMills, MD)獲得比色反應(yīng)顯色，在25°C溫育15分鐘。通過(guò)加入100 μ IlN HCl終止反應(yīng)，用分光光度儀在450nm處讀數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)反應(yīng)。使用下列公式計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù):IOOx [ (A-B) /A]，其中A是無(wú)抑制劑時(shí)450nm處的吸光度，而B(niǎo)是存在抑制劑時(shí)的吸光度。
[0096]表2.雜交野生型-和誘變的-分子抑制Bet vl-1gE結(jié)合
[0097]
【權(quán)利要求】
1.蘋(píng)果(Malusdomestic)主要變應(yīng)原 Mal dlwt (SEQ ID NO:1)或其與 SEQ ID NO:1至少95%，優(yōu)選至少97%相同的同種型的序列變體，所述變體的特征是: a)其表現(xiàn)出比所述Maldl變應(yīng)原(SEQ ID NO:1)降低的IgE反應(yīng)性； b)其具有這樣的氨基酸序列，當(dāng)與SEQID NO:1比對(duì)時(shí)，所述氨基酸序列在與SEQ IDNO:1的第25位和第78位對(duì)應(yīng)的Asp和/或Asn殘基上存在至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)取代。
2.權(quán)利要求1的序列變體，其中相比Maldl變應(yīng)原SEQ ID NO: 1，來(lái)自對(duì)蘋(píng)果和/或垂枝樺(Betula verrucosa)花粉過(guò)敏的患者的血清的IgE反應(yīng)性降低至少10%。
3.權(quán)利要求1-2的序列變體，其中所述Asp和Asn殘基都被取代。
4.權(quán)利要求1-3的序列變體，其中: -Asp25殘基被中性、極性或堿性的氨基酸取代，所述氨基酸優(yōu)選選自Ala、Thr, Gly,Pro、Leu、lie、Ser> Phe> Lys 和 Arg,更優(yōu)選 Ala、Thr> Ser> Gly、Lys 和 Arg ； -Asn78殘基被中性、酸性或堿性的氨基酸取代，所述氨基酸優(yōu)選選自Ala、Gly、Pro、Leu、lie、Phe> Lys、Arg、Asp 和 Glu,更優(yōu)選 Ala、Gly、Lys> Arg、Asp 和 Glu。
5.權(quán)利要求1-4的序列變體，由SEQID NO:2組成。
6.含有權(quán)利要求1-5定義的蘋(píng)果主要變應(yīng)原的序列變體和垂枝樺花粉的主要變應(yīng)原Bet vl的低變應(yīng)原性變體的雜交蛋白質(zhì),任選由接頭分隔開(kāi)。
7.權(quán)利要求6的雜交蛋白質(zhì)，其中所述Betvl低變應(yīng)原性變體是通過(guò)取代SEQ IDNO:5的第54、11 5和/或123位或其同種型的相應(yīng)位置上的一個(gè)或多個(gè)Lys殘基從蛋白質(zhì)SEQ ID N0:5或其同種型獲得的，所述同種型與SEQ ID NO:5具有至少94%，優(yōu)選至少97%序列同一性。
8.權(quán)利要求?的雜交蛋白質(zhì),其中所述Lys殘基被選自Ala、Thr>Gly、Pro、Leu、lie、Phe和Ser的中性或極性氨基酸取代。
9.權(quán)利要求6-8的雜交蛋白質(zhì)，其中所述Betvl低變應(yīng)原性變體由SEQ ID N0:6組成。
10.權(quán)利要求6-9的雜交蛋白質(zhì)，其中所述Maldl和Bet vl低變應(yīng)原性變體以頭-尾的方向位于氨基末端或羧基末端。
11.權(quán)利要求10的雜交蛋白質(zhì),其中Betvl和Mal dl分別位于氨基末端和羧基末端。
12.權(quán)利要求6-11的雜交蛋白質(zhì)，其中所述接頭由含有1-8個(gè)氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選EF 二肽，組成。
13.權(quán)利要求12的雜交蛋白質(zhì)，由SEQID N0:4組成。
14.編碼權(quán)利要求1-5的Maldl低變應(yīng)原性變體，或編碼權(quán)利要求6_13的雜交蛋白質(zhì)的核酸分子。
15.權(quán)利要求14的核酸分子，其序列選自SEQID NO: 10和19。
16.含有權(quán)利要求14-15的核酸分子的表達(dá)載體。
17.藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1-5的Maldl的低變應(yīng)原性變體或權(quán)利要求6-13的雜交蛋白質(zhì),和可藥用載體、賦形劑或佐劑。
18.權(quán)利要求17的組合物，其處于適合舌下、皮下或透皮施用的形式。
19.權(quán)利要求1-5的Maldl低變應(yīng)原性變體，或權(quán)利要求6_13的雜交蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求17-18的藥物組合物，用于對(duì)蘋(píng)果和/或垂枝樺花粉過(guò)敏的對(duì)象的免疫療法。
20.權(quán)利要求19的用于對(duì)蘋(píng)果和/或垂枝樺花粉過(guò)敏的對(duì)象的免疫療法的低變應(yīng)原性變體或雜交蛋白質(zhì)或藥物組合物，其中所述對(duì)象患支氣管哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎或口服變態(tài)反應(yīng)綜合征。`
【文檔編號(hào)】A61K39/36GK103874509SQ201280048686
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月3日
【發(fā)明者】G·米斯特雷洛, S·扎諾塔, D·隆卡羅洛 申請(qǐng)人:洛法瑪有限公司