特異性靶向癌細(xì)胞的輸送系統(tǒng)及其使用方法
【專利摘要】公開用于預(yù)防、治療或抑制受試者的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的多種方法。其中一種方法包括向受試者施用治療有效量的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合配體包覆的含有細(xì)胞毒性劑的行星球磨（PBM）納米顆粒的步驟。
【專利說(shuō)明】特異性靶向癌細(xì)胞的輸送系統(tǒng)及其使用方法
[〇〇〇1] 本申請(qǐng)要求2011年8月15日提交的第61/523,626號(hào)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。該臨 時(shí)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入到本發(fā)明中。 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本申請(qǐng)總體上涉及輸送系統(tǒng)和癌癥的治療。特別地，本申請(qǐng)涉及使用納米顆粒的 細(xì)胞毒性劑的運(yùn)輸。 【背景技術(shù)】
[0003] 全身性毒性是與破壞細(xì)胞的分裂和復(fù)制的能力的許多細(xì)胞毒性藥物相關(guān)聯(lián)的主 要問題。例如，盡管有一些益處，基于鉬的藥物(例如卡鉬、順鉬、奧沙利鉬、沙鉬、三鉬替群 妥英（triplatin tetranin)等)、天然酚類(例如小豆蘧、姜黃素、高良姜、生姜、內(nèi)亞胡椒、 姜黃等)，植物堿和紫杉烷類(例如喜樹堿、多西他賽、紫杉醇、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、 長(zhǎng)春新堿等)、其它的烷基化劑(例如六甲蜜胺、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、 達(dá)卡巴嗪、乙撐亞胺、六甲蜜胺、肼、異環(huán)磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法侖、亞硝基脲、胡椒 堿、丙卡巴肼、鏈佐星、替莫唑胺、塞替派、三嗪等)、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類抗生素(例如博萊 霉素、色霉素、更生霉素、道諾紅霉素、阿霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、絲裂霉素、米托蒽醌、普 卡霉素等)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如安吖啶、依托泊苷、伊立替康、替尼泊苷、托泊替康等)、 抗代謝物（5-氟尿嘧啶、6-硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、腺苷脫氨酶抑制劑、卡培他濱、克拉屈 濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、甲氨蝶呤、奈拉濱、噴司他丁有絲分裂抑制劑、 嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑等）以及各種抗腫瘤藥(例如天門冬酰胺酶、貝沙羅汀、雌莫司汀、 羥基脲、異維甲酸、米托坦、培加帕酶、類維生素 A、維生素 A酸等）在抑制癌細(xì)胞中是非常 有效的。然而，它們的效用仍不確定，存在復(fù)雜性和問題。例如，基于鉬的藥物不是治療癌 癥的首選，因?yàn)檫@些藥物容易被健康組織吸收，且只有少于1 %的施用藥物到達(dá)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo) (例如腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核/DNA)。結(jié)果，基于鉬的和其他癌癥藥物可能對(duì)健康組織毒性極高。 因此，需要一種輸送系統(tǒng)，專門針對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性劑的遞送。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本申請(qǐng)的一個(gè)方面涉及一種用于特異性地靶向癌細(xì)胞的系統(tǒng)，其包含用高親和力 和選擇性的腫瘤細(xì)胞配體涂覆并含有細(xì)胞毒性劑的行星球磨（PBM)納米顆粒。
[0005] 本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及一種用于在需要的受試者中治療癌癥的方法，包括對(duì)所 述受試者施用有效量的用于特異性地靶向癌細(xì)胞的系統(tǒng)，其包含用高親和力和選擇性的腫 瘤細(xì)胞配體涂覆并含有細(xì)胞毒性劑的行星球磨（PBM)納米顆粒。
[0006] 本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及在需要的受試者中抑制癌轉(zhuǎn)移，包括對(duì)所述受試者施用 有效量的用于特異性地靶向癌細(xì)胞的系統(tǒng)，其包含用高親和力和選擇性的腫瘤細(xì)胞配體涂 覆并含有細(xì)胞毒性劑的行星球磨（PBM)納米顆粒。
[0007] 本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及在需要的受試者中誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞的細(xì)胞凋 亡,包括對(duì)所述受試者施用有效量的用高親和力和選擇性的腫瘤細(xì)胞配體涂覆并含有對(duì) Treg細(xì)胞有細(xì)胞毒性的藥劑的行星球磨（PBM)納米顆粒。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1示出了用于制造可生物降解的行星球磨（PBM)納米顆粒的示例性方法。
[0009] 圖2是由姜黃素調(diào)節(jié)的分子靶標(biāo)的圖。
[〇〇1〇] 圖3示出了通過(guò)乳腺癌組織和細(xì)胞系的葉酸受體的表達(dá)。
[0011] 圖4示出了乳腺癌（BrCa)細(xì)胞的PBM納米顆粒介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
[0012] 圖5示出了在MDA-MB-231-Luc異種移植中PBM納米顆粒介導(dǎo)的腫瘤消退。
[0013] 圖6示出了 CD4+CD25*FoxP3+ (Treg)細(xì)胞的PBM納米顆粒介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
[0014] 圖7示出了葉酸受體（FRs)由PC3和PTEN-CaP2腫瘤表達(dá)，而不是由細(xì)胞系或正 常細(xì)胞表達(dá)。
[0015] 圖8示出了在體外順鉬負(fù)載的葉酸包覆的PBM納米顆粒介導(dǎo)的PC3細(xì)胞的破壞。
[0016] 圖9示出了接受順鉬溶液（8mg/kg/周）或包含順鉬的葉酸涂覆的XP包層納米顆 粒的移植有PC3-luc瘤的小鼠的腫瘤消退。
[0017] 圖10示出了涂覆和未涂覆的PBM納米顆粒的粒徑分布。
[0018] 圖11示出了涂覆有表面結(jié)合葉酸的聚己內(nèi)酯的PBM納米顆粒。
[0019] 圖12示出了前列腺腫瘤特異性PBM顆粒的ζ電勢(shì)。
[0020] 圖13示出了葉酸受體由前列腺細(xì)胞系和腫瘤的表達(dá)。
[0021] 圖14示出了負(fù)載ΡΒΜ納米顆粒的姜黃素孵育的PC3細(xì)胞的凋亡。
[0022] 圖15示出了制造 ΡΒΜ納米顆粒的示例性的圖。
[0023] 圖16示出了心室內(nèi)和骨內(nèi)（intratibialy)注入PC3腫瘤細(xì)胞的老鼠。
[0024] 圖17示出了前列腺腫瘤特異性PBM納米顆粒的粒度分布。
[0025] 圖18示出了前列腺腫瘤特異性PBM納米顆粒的ζ電勢(shì)。
[0026] 圖19示出了 ΡΒΜ納米顆粒處理過(guò)的前列腺癌細(xì)胞的TUNEL和DRAQ5染色。
[0027] 圖20顯示ΡΒΜ納米顆粒介導(dǎo)的癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的凋亡。
[0028] 圖21顯示ΡΒΜ納米顆粒運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核和TUNEL染色。 【具體實(shí)施方式】
[0029] 陳述以下的詳細(xì)描述以使所屬領(lǐng)域的任何技術(shù)人員能夠制造和使用本發(fā)明。為了 解釋的目的，闡述具體的術(shù)語(yǔ)以提供對(duì)于本發(fā)明的完全理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái) 講，顯而易見的是這些具體的描述不是實(shí)施本發(fā)明必需的。具體應(yīng)用的描述僅作為典型的 實(shí)例。本發(fā)明并不試圖限定于所示實(shí)施例，而是使與本發(fā)明所公開的原理和特征與盡可能 廣泛的范圍相一致。
[0030] 除非另有限定，否則所使用的與本發(fā)明相關(guān)的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)該具有由本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù) 術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。
[0031] 釋義
[0032] 當(dāng)在本發(fā)明中使用時(shí)，下列術(shù)語(yǔ)具有以下含義：
[0033] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"癌癥（cancer)"指的是惡性新生物或惡性贅生物，是一 組細(xì)胞顯示出不受控制的生長(zhǎng)，侵入和破壞鄰近組織，有時(shí)通過(guò)淋巴或血液轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散到 身體的其他部位的一類疾病。癌癥的這三種惡性與不侵入或轉(zhuǎn)移的良性腫瘤區(qū)分開來(lái)。術(shù) 語(yǔ)"癌癥"在此包括"癌"、"肉瘤"、"淋巴瘤"、"白血病"、"黑色素瘤"、"胚細(xì)胞瘤"和"母細(xì)胞 瘤"。
[〇〇34] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"腫瘤"指的是由細(xì)胞的異常生長(zhǎng)而形成的腫瘤或固體病 變。腫瘤可以是良性的、惡性前的或惡性的。
[0035] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"癌（carcinoma)"是指一種侵入性惡性腫瘤，包括轉(zhuǎn)化的 上皮細(xì)胞或未知組織來(lái)源的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，但它們具有與上皮細(xì)胞相關(guān)的特定的分子的或組織 學(xué)的特征，例如細(xì)胞角蛋白或細(xì)胞間橋的產(chǎn)生。本發(fā)明的典型的癌包括黑色素瘤、卵巢癌、 陰道癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、胰島細(xì)胞瘤、腺 癌、腺鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、口腔癌、腦癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)外 胚層瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體癌和骨癌。
[0036] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"肉瘤"是指由結(jié)締組織產(chǎn)生的癌癥，例如骨、軟骨、月旨 肪和神經(jīng)組織，每一種從起源于骨髓外的間充質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，即一種由在從 胚胎的中胚層發(fā)育的許多組織中的一種組織中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的癌癥。因此，肉瘤包括 骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管和造血組織的腫瘤。例如，骨肉瘤來(lái)自骨，軟骨肉瘤來(lái)自軟骨， 脂肪肉瘤來(lái)自脂肪，平滑肌肉瘤來(lái)自平滑肌。典型的肉瘤包括:Askin腫瘤、葡萄狀肉瘤 (botryodies)、軟骨肉瘤、Ewing' s-PNET、惡性血管內(nèi)皮瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、骨肉瘤、軟組織 肉瘤。軟組織肉瘤的次級(jí)分類包括：腺泡狀軟組織肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維 肉瘤、硬纖維瘤、促纖維增生性小圓細(xì)胞瘤、上皮樣肉瘤骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉 瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、Kaposi肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉 瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。
[0037] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"淋巴瘤"是指由離開骨髓并在淋巴結(jié)中成熟的造血細(xì)胞 所產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞的癌癥。淋巴瘤通常呈現(xiàn)為實(shí)體瘤。典型的淋巴瘤包括：小 淋巴細(xì)胞淋巴瘤、淋巴楽細(xì)胞性淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、楽 細(xì)胞瘤、結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、結(jié)節(jié)性邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤（NMZL)、濾泡 性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴瘤、血管內(nèi)大B 細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、典型霍 奇金淋巴瘤、結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤、成人T細(xì)胞淋巴瘤、鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞 淋巴瘤、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤、肝脾T細(xì)胞淋巴瘤、母細(xì)胞性NK細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣霉菌病、塞 澤里綜合征（sezary syndrome)、原發(fā)性皮膚⑶30-陽(yáng)性T細(xì)胞淋巴增生性疾病、原發(fā)性皮 膚間變性大細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤、非指定外周T 細(xì)胞淋巴瘤和間變性大細(xì)胞淋巴瘤。典型霍奇金淋巴瘤的代表形式包括：結(jié)節(jié)性硬化、混合 細(xì)胞性、富淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞耗盡或非耗盡。
[0038] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"白血病"是指由離開骨髓并在血液中成熟的造血細(xì)胞所 產(chǎn)生的癌癥。白血病是涵蓋廣泛疾病的廣義術(shù)語(yǔ)。反過(guò)來(lái)，它是稱為血液腫瘤的更廣泛的 一組疾病的一部分。白血病被細(xì)分成各種大類，第一部是介于白血病急性和慢性形式之間。 急性白血病的特征在于，未成熟的血細(xì)胞的數(shù)量迅速增加。由于這種細(xì)胞的聚集，使骨髓無(wú) 法產(chǎn)生健康的血細(xì)胞。慢性白血病的特征是相對(duì)成熟的白血細(xì)胞的過(guò)度積聚，但仍然不正 常。通常經(jīng)過(guò)幾個(gè)月或幾年的發(fā)展，細(xì)胞以比正常細(xì)胞高得多的速率產(chǎn)生，導(dǎo)致血液中許多 異常的白血細(xì)胞。白血病也通過(guò)影響血細(xì)胞細(xì)分。這種區(qū)分將白血病劃分為淋巴細(xì)胞或淋 巴細(xì)胞性白血病和髓細(xì)胞或骨髓性白血病。在淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞性白血病中，癌性變化 發(fā)生在一類通常會(huì)形成為淋巴細(xì)胞的骨髓細(xì)胞中。在骨髓細(xì)胞或骨髓性白血病中，癌性變 化發(fā)生在一類通常形成為紅細(xì)胞的骨髓細(xì)胞中、某些其它類型的白細(xì)胞和血小板中。結(jié)合 這兩種分類，共提供四種主要類型。在這四個(gè)主要類型的每一種中，通常有幾種小類。也有 這種分類方法以外的罕見的類型。典型的白血病包括急性淋巴細(xì)胞白血病（all)、慢性淋 巴細(xì)胞性白血病（CLL)、急性髓性白血病（AML)、慢性髓細(xì)胞性白血病（CML)、毛細(xì)胞白血病 (HCL)、T-細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病、大顆粒淋巴細(xì)胞性白血病、未成熟骨髓單核細(xì)胞性白血 病、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病、伯基特細(xì)胞白血病、成熟T-細(xì)胞白血病。
[0039] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"黑色素瘤"是一種黑素細(xì)胞的癌癥或惡性腫瘤。黑素細(xì) 胞是產(chǎn)生暗色素、黑色素(負(fù)責(zé)皮膚的顏色)的細(xì)胞。它們主要在皮膚中發(fā)生，但在身體的其 他部位也發(fā)現(xiàn)過(guò)，包括腸和眼睛。黑色素瘤分為以下定型和亞型：惡性雀斑樣痣、惡性雀斑 樣痣黑素瘤、淺表擴(kuò)散性黑色素瘤、肢端雀斑樣痣黑素瘤、黏膜黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、 息肉狀黑色素瘤、黑色素瘤促纖維增生、無(wú)色素性黑色素瘤、軟組織惡性黑色素瘤、有小痣 樣細(xì)胞的黑色素瘤、有斯皮茨痣特征的黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤。
[0040] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"生殖細(xì)胞腫瘤"是指由生殖或多能干細(xì)胞衍生的癌癥， 包括存在于睪丸(精原細(xì)胞瘤）或卵巢(無(wú)性細(xì)胞瘤）的那些細(xì)胞。生殖細(xì)胞腫瘤可以是癌 性或非癌性腫瘤。生殖細(xì)胞通常發(fā)生在性腺(卵巢和睪丸）內(nèi)，起源于性腺外的生殖細(xì)胞腫 瘤可能是在胚胎發(fā)育過(guò)程中的錯(cuò)誤所導(dǎo)致的出生缺陷。生殖細(xì)胞腫瘤大致分為兩大類：生 殖細(xì)胞瘤的或精原細(xì)胞瘤的和非生殖細(xì)胞瘤的或非精原細(xì)胞瘤的生殖細(xì)胞腫瘤。典型的生 殖細(xì)胞瘤的或精原細(xì)胞瘤的生殖細(xì)胞腫瘤包括：生殖細(xì)胞瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤和精原細(xì)胞瘤。典 型的非生殖細(xì)胞瘤的或非精原細(xì)胞瘤的生殖細(xì)胞腫瘤包括：胚胎癌、內(nèi)胚竇瘤或卵黃囊瘤 (EST，YST)、絨毛膜癌、成熟性畸胎瘤、皮樣囊腫、未成熟畸胎瘤、惡性轉(zhuǎn)化畸胎瘤、多胚瘤、 性腺胚細(xì)胞瘤和混合型GCT。
[0041] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"胚細(xì)胞瘤"是指由未成熟前體細(xì)胞或胚胎組織衍生的癌 癥。
[0042] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"BrCa"指的是乳腺癌。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"PCa"是指前 列腺癌。
[〇〇43] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)移"是指癌癥或癌從一個(gè)器官或部分?jǐn)U散到另一個(gè)非 相鄰的器官或部分。
[0044] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"抗體"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白（Ig)分子的免 疫活性部分，即含有與抗原特異性結(jié)合(發(fā)生免疫反應(yīng)）的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。術(shù)語(yǔ)"抗 體"在最廣泛的意義上使用，特別地覆蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、 多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。由 "特異性結(jié)合"或"發(fā)生免疫反應(yīng)"是指該抗體與期望抗原的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇發(fā)生反 應(yīng)，不與其它多肽發(fā)生反應(yīng)(即結(jié)合)或與其它多肽以更低的親和力結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"抗體"還包 括包含全長(zhǎng)抗體的一部分(通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū))的抗體片段?？贵w片段的實(shí)例包 括Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段；雙抗體、線性抗體、單鏈抗體（scFv)分子；以及由抗體 片段形成的多特異性抗體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，例如，可能理想的是使用抗體片段 而非完整抗體來(lái)提高腫瘤穿透。在這種情況下，為了增加其血清半衰期，可能理想的是使用 已通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法修飾的抗體片段。
[0045] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指從實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即 除了可能天然發(fā)生的少量存在的突變之外，構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的。特別地，在本發(fā) 明中單克隆抗體包括"嵌合"抗體，以及此類抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活 性，其中，重鏈和/或輕鏈的一部分與由特定物種衍生的或?qū)儆谔囟贵w類別和亞類的抗 體中的序列相同或同源，而其余的鏈?zhǔn)桥c由其他物種衍生的或?qū)儆谄渌贵w類別和亞類的 抗體中的序列相同或同源。
[0046] 非人抗體的"人源化"形式是含有從非人免疫球蛋白衍生的最小序列的嵌合抗體。 在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體)，其中，來(lái)自受體的高變區(qū)殘基由 來(lái)自非人物種(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、兔或具有所需特異性、親和力和/或能力的非人 靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替換。用于制備人源化的和其它嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域中是已 知的。
[0047] "雙特異性抗體"是具有對(duì)于至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性的抗體。用于制備雙 特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。
[0048] "異源結(jié)合抗體（heteroconjugate antibodies)"的使用也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。 異源結(jié)合抗體由兩種共價(jià)連接的抗體組成。例如，有人提出此類抗體使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向 不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4, 676, 980)?？梢栽O(shè)想，可以用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中已知的方法 (包括涉及交聯(lián)劑的方法）在體外制備該抗體。
[0049] 本申請(qǐng)還考慮使用"免疫偶聯(lián)物（immunoconjugates)"，包含與諸如毒素(例如 細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶促活性毒素，或其片段）或放射性同位素（即放射性偶 聯(lián)物）的細(xì)胞毒性劑結(jié)合的抗體?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅?A鏈、白喉 毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素 A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa))、 菌麻毒素 A鏈（ricin A chain)、相思豆毒蛋白A鏈（abrin A chain)，蒴蓮根毒素 A鏈 (modeccin A chain)、a -帚曲霉素（alpha-sarcin)、油桐（Aleurites fordii)蛋白、石竹 蛋白（dianthin protein)、美洲商陸（Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜（momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白（curcin)、巴豆毒素（crotin)、肥阜 草（sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素（gelonin)、絲林霉素（mitogellin)、局限 曲菌素（restrictocin)、酚霉素（phenomycin)、伊諾霉素（enomycin)和單孢霉烯族毒素 (tricothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射性偶聯(lián)抗體。實(shí)例包括 212Bi、131I、131In、 90Υ 和 186Re。
[0050] 為治療目的的"哺乳動(dòng)物"是指分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人類、非人類的 靈長(zhǎng)類動(dòng)物、家畜和農(nóng)畜，以及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，例如狗、馬、貓、牛等，優(yōu)選地，所述 哺乳動(dòng)物是人。
[0051] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"治療（treat、treating或treatment)"是指減輕或消 除疾病和/或其并發(fā)癥的方法。當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防（prevent、preventing或 prevention)"是指限制受試者罹患疾病和/或其并發(fā)癥的方法。在某些實(shí)施方式中，"預(yù)防 (prevent、preventing或prevention)"是指降低摧患疾病和/或其并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法。
[0052] 術(shù)語(yǔ)"抑制"是相對(duì)的術(shù)語(yǔ)，相對(duì)于參照試劑，如果施用藥劑后，反應(yīng)或狀態(tài)從數(shù) 量上減弱，或者，如果施用藥劑后，其被減弱，則藥劑抑制反應(yīng)或狀態(tài)。類似地，術(shù)語(yǔ)"防止" 并不一定意味著藥劑完全消除了反應(yīng)或狀態(tài)，只要消除了反應(yīng)或條件中的至少一種特性即 可。因此，可以減少或防止腫瘤生長(zhǎng)或反應(yīng)(例如病理反應(yīng))組合物，可以但不必完全消除上 述增長(zhǎng)或反應(yīng)，只要生長(zhǎng)或反應(yīng)可測(cè)量地減弱，例如，比在沒有藥劑的生長(zhǎng)或反應(yīng)或者與參 照藥劑相比，減少至少約50%，例如至少約70%、或約80%，或甚至約90% (即至其10%以 下)。
[0053] 術(shù)語(yǔ)"提高水平"指的是高于在相關(guān)領(lǐng)域中通常限定或使用的正?；?qū)φ账降?更高水平。例如，在組織中免疫染色增加的水平是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)為比在對(duì)照組 織中的免疫染色水平更高的水平。
[0054] 當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"生物樣品"是指生物來(lái)源的材料，其可以是體液或身體 產(chǎn)物，例如血液、血漿、尿液、唾液、脊髓液、糞便、汗液或呼出的空氣。生物樣品還包括組織 樣品和細(xì)胞樣品。
[0055] 在本發(fā)明中，范圍可以表示為從"約"一個(gè)特定值，和/或到"約"另一個(gè)特定值。 當(dāng)表達(dá)這樣的范圍時(shí)，另一種實(shí)施方式包括從一個(gè)特定值和/或到另一個(gè)特定值。類似地， 當(dāng)數(shù)值表示為近似值時(shí)，通過(guò)使用先行詞"約"，可以理解的是，該特定值形成另一種實(shí)施方 式?？梢赃M(jìn)一步理解為，每個(gè)范圍的端點(diǎn)相對(duì)于另一端點(diǎn)是顯著的，并且獨(dú)立于另一端點(diǎn)。 也可以理解的是，本發(fā)明中公開了一些值，并且除了該值本身，每個(gè)值在本發(fā)明中也以"約" 的特定值公開。例如，如果公開了"10"的值，那么"約10"也被公開。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員 的適當(dāng)理解，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)以"小于或等于"某值公開該值時(shí)，"大于或等于該值"以及 數(shù)值間可能的范圍也被公開。例如，如果公開了"10"的值，則"小于或等于10"以及"大于 或等于10"也被公開。
[0056] 在本申請(qǐng)的上下文中，"有效量"是指足以實(shí)現(xiàn)有益的或期望的結(jié)果的組合物的 量，例如，預(yù)防或治療疾病的有效量。"疾病"指會(huì)受益于抗體治療的任何狀態(tài)，包括癌和化 學(xué)抗性。這包括慢性和急性疾病，或包括使哺乳動(dòng)物易于罹患所討論的疾病的那些病理狀 態(tài)的疾病。
[0057] 攜帶特異性靶向癌細(xì)胞的納米顆粒的藥物
[0058] 本申請(qǐng)的一個(gè)方面涉及攜帶特異性靶向特定細(xì)胞的納米顆粒的藥物，例如腫瘤細(xì) 胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞)。在一些實(shí)施方式中，攜帶納米顆粒的藥物包括一個(gè)行星球 磨納米顆粒核，一種或多種細(xì)胞毒性劑，以及一種或多種細(xì)胞靶向劑。在某些實(shí)施方式中， 所述一種或多種細(xì)胞毒性劑包括姜黃素，所述一種或多種細(xì)胞靶向劑包括葉酸。在某些其 它實(shí)施方式中，一種或多種細(xì)胞毒性劑包含姜黃素和一種或多種其他細(xì)胞毒性劑。本申請(qǐng) 的攜帶藥物的納米顆粒允許使用較低劑量的細(xì)胞毒性藥物，降低不良反應(yīng)，提高療效，并減 少藥物被迅速?gòu)陌袠?biāo)腫瘤或癌細(xì)胞清除的可能性。例如，本申請(qǐng)的攜帶藥物的納米顆粒能 夠靶向并由乳腺或前列腺癌細(xì)胞吸收，從而有效地將化學(xué)治療劑運(yùn)送到癌細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi) 靶標(biāo)，并攜帶充足的藥物以完成細(xì)胞凋亡過(guò)程來(lái)限制化學(xué)抗性和全身毒性的可能性。
[0059] 行星球磨（PBM)納米顆粒
[0060] 如在本發(fā)明中所用，術(shù)語(yǔ)" PBM納米顆粒"和" XPc 1 ad納米顆粒"是相同的，可以互 換使用。在一些實(shí)施方式中，所述PBM納米顆粒的直徑的范圍為0. 1ηπι-60μπι、0. lnm-?μπι、 0· lnm-500nm、0. lnm_200nm、lnm-200nm、5nm_60 μ m、5nm-30nm、30nm-80nm、30nm-180nm、 80nm_l μ m、180nm_l μ m、200nm_l μ m、1 μ m_6 μ m、4 μ m_12 μ m 和 10 μ m_60 μ m。在其它實(shí)施 方式中，所述PBM納米顆?？梢允巧锟山到獾募{米顆粒?？梢允褂靡环N新配方的方法來(lái) 產(chǎn)生大小均勻，100%的疏水性或親水性藥物負(fù)載效率，含有用于靶向遞送的后續(xù)涂層并控 制用于全身性、口服或皮膚運(yùn)送的表面的logP (用于親脂性：親水性分布的度量）的顆粒， 以制造 PBM納米顆粒。
[0061] 本申請(qǐng)中描述的PBM納米顆粒表示使用行星球磨機(jī)以產(chǎn)生均勻尺寸的，100 %的 疏水性或親水性藥物負(fù)載效率，含有用于靶向遞送的后續(xù)涂層并控制用于全身性、口服或 皮膚運(yùn)送的表面的logP的顆粒的新型納米顆粒制劑方法。這些是通過(guò)以RES設(shè)計(jì)表面特 性靶向乳腺腫瘤的FR1和無(wú)間隙的FR4表達(dá)Treg細(xì)胞的均勻大小的顆粒得到的PBM納米 顆粒的首次研究。
[0062] 在一些實(shí)施方式中，所述PBM納米顆粒包括納米基質(zhì)芯，包括一種或多種可生物 降解的聚合物或多糖，例如藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉。其它合適的可生物降解的 聚合物包括但不限于聚乙二醇（PEG)、聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸（PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物 (PLGA)、聚羥基脂肪酸酯（PHA)、聚羥基丁酸酯-戊酸酯（PHBV)、聚乙烯醇（PVA)、聚對(duì)苯二 甲酸乙酯（PET)、聚乙交酯-丙交酯、聚己內(nèi)酯（PCL)、乳酸-ε-己內(nèi)酯共聚物（PLCL)、聚二 噁烷酮（PD0)、聚三亞甲基碳酸酯（PTMC)、聚（氨基酸)、聚二噁烷酮、聚草酸酯、聚酐、聚（磷 酸酯)、聚原酸酯以及它們的共聚物。在某些實(shí)施方式中，所述納米顆粒核心的基質(zhì)包括PEG 和選自藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉的聚合物或多糖的混合物。細(xì)胞毒性劑的分子截留 在納米顆粒核基質(zhì)中。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞毒性劑在基質(zhì)芯的形成過(guò)程中與生物可降 解聚合物和多糖混合。在其他實(shí)施方式中，首先形成基質(zhì)芯，在隨后的階段中加載細(xì)胞毒性 劑。
[0063] 在一些實(shí)施方式中，所述基質(zhì)的核心是通過(guò)將生物聚合物(例如藻酸鹽、纖維素、 膠原蛋白和淀粉）溶解在水中以形成水溶液，將細(xì)胞毒性劑加入到該水溶液中以形成生物 聚合物/細(xì)胞毒性劑的混合物，并任選地將另一種聚合物(例如PEG)加入到該生物聚合物/ 細(xì)胞毒性劑的混合物中以形成最終混合物。將該最終混合物干燥為顆粒或片劑的形式，然 后在受控的溫度（<37°C)下使用行星式球磨機(jī)研磨?？梢酝ㄟ^(guò)行星球磨的速度和時(shí)間控制 納米顆粒的尺寸。在一些實(shí)施方式中，所述納米顆粒的尺寸范圍為〇· 1至5nm、5至30nm、30 至 80nm、30 至 180nm、180 至 lOOOnm 或 200 至 lOOOnm。研磨速度范圍為 100-600rmp,優(yōu)選 200-400rmp〇
[0064] 在其它實(shí)施方式中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步用釋放控制聚合物涂覆以控制內(nèi)含 物釋放的時(shí)間、提高顆粒的機(jī)械強(qiáng)度和/或穩(wěn)定PBM納米顆粒中的活性成分。適合的用于 釋放控制涂層的聚合物包括但不限于聚己內(nèi)酯（PCL)和聚乙二醇。在其它實(shí)施方式中，所 述PBM納米顆粒可以被進(jìn)一步涂布，與腫瘤特異性或細(xì)胞/組織特異性的祀向劑結(jié)合或修 飾。所述腫瘤特異性或細(xì)胞/組織特異性的靶向劑的實(shí)例包括但不限于賴氨酸、多肽、抗體 和葉酸。
[0065] 如圖1所示，由于PEG-涂層和具有負(fù)的LogP值，可生物降解的行星球磨（PBM)納 米顆粒具有提高的包封藥物的血清半衰期。
[0066]目前有幾種用于藥物遞送的納米載體：聚合物、膠束、樹枝狀聚合物、脂質(zhì)體、白蛋 白、病毒、碳納米管以及氧化硅/金屬。然而這些納米顆粒存在一定的限制（即非均勻的尺 寸、難以制造和/或缺乏靶向），降低了它們的實(shí)用性。
[〇〇67] 在一些實(shí)施方式中，通過(guò)涂布口服抗癌劑(包括但不限于沙鉬、卡培他濱、厄洛替 尼）配制成用于口服遞送的PBM納米顆粒。用于口服遞送的納米顆粒調(diào)節(jié)：用于腸道吸收 的表面logP值，在首過(guò)效應(yīng)中水解的共聚物的添加，通過(guò)肝臟膽道系統(tǒng)無(wú)肝毒性地轉(zhuǎn)運(yùn)， 對(duì)原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤(包括乳腺癌和前列腺腫瘤)的靶向-全身性傳遞。也可制成制劑以包 括用于檢測(cè)微轉(zhuǎn)移灶和活化處理的基板。
[0068] 細(xì)胞毒性藥劑
[〇〇69] 具有不同的胞內(nèi)靶標(biāo)的各種細(xì)胞毒性藥劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相同表型。這意味 著細(xì)胞毒性藥劑的細(xì)胞毒素活性不是完全依賴于特定的藥物-靶標(biāo)相互作用，而且還依賴 于癌細(xì)胞的凋亡(細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo))系統(tǒng)的活性。細(xì)胞毒性藥劑的實(shí)例包括但不限于基于鉬的 藥物(例如卡鉬、順鉬、奧沙利鉬、沙鉬、三鉬替群妥英和卡鉬等)、天然的酚類(例如小豆蘧、 姜黃、高良姜、生姜、內(nèi)亞胡椒、姜黃等)、植物生物堿和紫杉烷類(例如喜樹堿、多西他賽、紫 杉醇、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿等)、其它的烷基化劑(例如六甲蜜胺、白消安、 卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、乙撐亞胺、六甲蜜胺、肼、異環(huán)磷酰胺、洛莫司 汀、氮芥、美法侖、亞硝基脲、胡椒堿、丙卡巴肼、鏈佐星、替莫唑胺、塞替派、三嗪等)、腫瘤抗 生素和蒽環(huán)類抗生素(例如博萊霉素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊 達(dá)比星、絲裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如安吖啶、依托泊苷、伊 立替康、替尼泊苷、托泊替康等)、抗代謝物(例如5-氟尿嘧啶、6-硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、腺 苷脫氨酶抑制劑、卡培他濱、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、甲氨蝶呤、 奈拉濱、噴司他丁有絲分裂抑制劑、嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑等）以及雜抗腫瘤藥(例如天 冬酰胺酶、貝沙羅汀、雌莫司汀、羥基脲、異維甲酸、米托坦、培門冬酶、類視黃酸、維A酸，等 等)。
[0070] 基于鉬類的治療法廣泛使用，通過(guò)破壞DNA和通過(guò)細(xì)胞色素 C釋放及隨后的半胱 天冬酶激活來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮功能。許多化療耐藥的細(xì)胞系對(duì)于基于鉬的藥物(例如 多西紫杉醇和卡鉬）更敏感。但是，這些藥物有許多副作用，包括但不限于：嗜中性白血球 減少癥、肝功能障礙、貧血（70%)、惡心（40%)、感染（20%)、神經(jīng)肌肉功能障礙（15%)、腎 功能衰竭，以及可能的心臟毒性-接受此種治療的患者死亡率上升為1. 7%。這些副作用意 味著需要?jiǎng)?chuàng)新方法，從而克服或規(guī)避藥物療效的內(nèi)在機(jī)理、耐藥性、毒性以及同時(shí)阻礙早期 原發(fā)性或預(yù)發(fā)性(例如，轉(zhuǎn)移性三重陰性）疾病。
[0071] 盡管以多西他賽進(jìn)行了廣泛的臨床試驗(yàn)，對(duì)于其功效和毒性仍有較高水平的不可 預(yù)測(cè)性，這限制了其應(yīng)用。多西他賽由CYP3-介導(dǎo)的氧化進(jìn)行代謝，，這導(dǎo)致具有降低了的 細(xì)胞毒性的代謝產(chǎn)物。這種排除途徑部分是由藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCB1支配，但在ABCB1基 因中的C1236T多態(tài)性顯著地降低多西他賽清除率。也有證據(jù)表明，在編碼的DNA修復(fù)基因 中的多態(tài)性(例如NER和BER)和代謝滅活酶可能有助于在抗腫瘤功效以及卡鉬毒性方面的 個(gè)體差異。幾種機(jī)制說(shuō)明，賦予毒性，降低敏感性和對(duì)于卡鉬(包括外排泵(例如ABCB1))的 耐受性，提高解毒酶，分別與NER和BER相關(guān)。在以基于鉬類的療法的背景下，這些多態(tài)性 可以減少NER/BERd的功能和鉬-DNA損傷的修復(fù)。
[0072] 在一種具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒性劑是姜黃素。在另一種實(shí)施方式中，所述 細(xì)胞毒性劑包含姜黃素和一種或多種其他細(xì)胞毒性劑。
[0073] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述細(xì)胞毒性劑選自化療劑、放射性偶聯(lián)物、抗體、 siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的任何其他藥劑。
[0074] 在另一種實(shí)施方式中，所述化療劑選自基于鉬的藥物、天然酚、植物生物堿和紫杉 烷類、其他烷化劑、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗代謝物以及各種抗腫瘤藥 物。
[0075] 在又一種實(shí)施方式中，所述放射性偶聯(lián)物包含選自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[0076] 在又一種實(shí)施方式中，所述抗體能夠與選自以下的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合：腺苷受體、 α νβ 3整合素、氨肽酶Ρ、α -胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白1、趨化因子受 體、叢生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、Ras、Ρ53、Her2/Neu、 ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤受體、輻射 誘導(dǎo)的細(xì)胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑M、鱗狀細(xì)胞癌抗原、 血小板反應(yīng)蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關(guān)糖蛋白72、酪氨酸酶和酪氨酸激酶。
[〇〇77] 在又一種實(shí)施方式中，所述對(duì)于癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的藥劑選自白喉A鏈、白喉毒 素的非結(jié)合活性片段、外毒素 A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白 A鏈、蒴蓮根毒素 A、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII和 PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲 霉素、酚霉素、依諾霉素、單端孢子菌霉菌毒素以及它們的片段。
[0078] 姜黃素
[0079] 姜黃素(姜黃素 diferuloylmethane)是一種來(lái)源于植物姜黃的多酚，通常稱為姜 黃。其在印度草藥學(xué)中保持高度地位，眾所周知的作為"具有抗氧化劑、抗炎、抗致癌、抗增 殖和抗血管生成特性的身體清潔劑"的疏水性天然化合物。然而姜黃素的疏水性導(dǎo)致其生 物利用性差，這阻礙了姜黃素的功效和作為抗癌劑的有效作用。因此，關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是將姜黃 素直接遞送到腫瘤細(xì)胞以提高其效用，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡，同時(shí)防止損害正常細(xì)胞。
[0080] 能夠克服姜黃素較差的生物利用性并避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES)間隙的長(zhǎng)循環(huán)納米 顆粒會(huì)導(dǎo)致具有增加的通透性和有缺陷的淋巴引流(即增強(qiáng)通透性和保留EPR效應(yīng))的腫瘤 的聚集。這些納米尺寸的媒介的吸收有許多優(yōu)點(diǎn)，包括由于靶向給藥而顯著地減少全身毒 性。這些納米顆粒防止化學(xué)抗性的出現(xiàn)也是合理的。納米顆粒能夠靶向并由前列腺腫瘤吸 收，會(huì)有效地遞送姜黃素以擾亂細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)，并在生物利用上充分地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋 亡過(guò)程。
[0081] 釋放控制聚合物涂層
[0082] 所述釋放控制聚合物涂層控制釋放內(nèi)含物的時(shí)間，增加涂層PBM納米顆粒的機(jī)械 強(qiáng)度，和/或穩(wěn)定PBM納米顆粒的活性成分。適合的釋放控制涂層的聚合物包括但不限于 聚乙二醇、聚己內(nèi)酯（PCL)、化學(xué)改性PCL和它們的混合物。在一些實(shí)施方式中，所述控制釋 放聚合物涂層PBM納米顆粒進(jìn)一步以針對(duì)特異性祀標(biāo)(例如，腫瘤細(xì)胞或Treg細(xì)胞)的細(xì)胞 靶向藥劑涂布、結(jié)合或修飾。
[0083] 細(xì)胞靶向藥劑
[0084] 細(xì)胞靶向藥劑允許含藥物的納米顆粒靶向附加物中的細(xì)胞的特定類型。細(xì)胞靶向 藥劑的實(shí)例包括但不限于結(jié)合到或靶向腫瘤相關(guān)抗原的小分子(例如葉酸、腺苷、嘌呤）和 大分子(例如肽或抗體)。腫瘤相關(guān)抗原的實(shí)例包括但不限于腺苷受體、αΥβ 3、氨肽酶P、 α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白-1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、 CD20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、Ras、Ρ53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸 受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤受體、輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞表面受體、絲氨 酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑M、鱗狀細(xì)胞癌抗原、血小板反應(yīng)蛋白、腫瘤抗原 4、腫瘤相關(guān)糖蛋白72、酪氨酸酶以及和酪氨酸激酶。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向藥劑是與 葉酸受體（FRs)特異性結(jié)合的葉酸或葉酸衍生物。
[0085] 所述還原性葉酸載體（RFC)是低親和力、高容量系統(tǒng)，其介導(dǎo)還原性葉酸在藥理 (μ M)濃度下吸收到癌細(xì)胞中。生理葉酸的濃度在5至50nM的范圍內(nèi)。因此，存在高親和 力的人FRs并由一個(gè)家族基因編碼，其同源產(chǎn)物稱為FRa、β、 Υ、δ型，其也分別描述為 FR1、FR2、FR3、FR4。膜同種型FR1、FR2和FR4可以結(jié)合并運(yùn)輸葉酸或葉酸衍生物進(jìn)入細(xì)胞 內(nèi)，而FR3缺少膜錨定點(diǎn)并從細(xì)胞中分泌。FR1和FR2分別以類似但不同的親和力結(jié)合葉酸 和6S5-甲酰四氫葉酸（即亞葉酸鈣)，親和力L5nM對(duì)0·35ηΜ (葉酸）以及和800nM對(duì)7nM (亞葉酸鈣)。6S5-甲基四氫葉酸是在血液中占主導(dǎo)地位的葉酸，并對(duì)于FR1和FR2具有相 似的親和力，分別為55nM和InM。而PC3人前列腺癌細(xì)胞在培養(yǎng)基中不顯著表達(dá)FR (例如 FR1 )，F(xiàn)Rs是由PC3腫瘤表達(dá)。FRs還通過(guò)BrCa細(xì)胞表達(dá)，與不良后果或通過(guò)這些受體運(yùn)輸 葉酸(不管對(duì)于甲氨蝶呤的抗性）有關(guān)。
[0086] 大多數(shù)非增殖性組織缺乏功能性FR表達(dá)。在增殖性正常組織中的FR表達(dá)僅限于 某些上皮細(xì)胞的腔表面，從而無(wú)法進(jìn)入循環(huán)。然而，在惡性腫瘤和白血病中存在的高水平的 FR2 (高親和力受體）暴露于循環(huán)中，使得它們成為用于腫瘤特異性療法的有吸引力的候選 者。腎臟(其中FR1 (中度親和力受體）的表達(dá)在近端小管）由排除腎小球?yàn)V過(guò)的FR-靶向 性治療來(lái)保護(hù)。進(jìn)一步保護(hù)是腎葉酸保護(hù)機(jī)制的結(jié)果，其中，通過(guò)腎小管細(xì)胞的FR-介導(dǎo)的 內(nèi)吞后，還有葉酸的迅速分解和運(yùn)輸穿過(guò)基底膜進(jìn)入血液。
[〇〇87] 癌細(xì)胞的氨甲喋呤抗性主要依賴于在二氫葉酸還原酶基因中的變化，降低的細(xì)胞 內(nèi)聚谷氨酸、增加的經(jīng)由RFC流出和運(yùn)輸；由于這種治療是通過(guò)FR結(jié)合和運(yùn)輸，僅僅適度地 影響甲氨蝶呤耐藥腫瘤的作用，因此，不太可能存在對(duì)本申請(qǐng)的生物降解的行星球磨（PBM) 納米顆粒的抗性。
[0088] 在PBM納米顆粒中葉酸作為靶向劑的應(yīng)用還允許腫瘤細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì) 胞。廣泛認(rèn)可的是，大量的Treg細(xì)胞抑制腫瘤的免疫力。具體而言，Treg細(xì)胞抑制(外部 和自身）反應(yīng)性T細(xì)胞，而不是通過(guò)接觸-依賴或細(xì)胞因子(例如IL-KKTGF-β等）分泌殺 死它們。FR4在Treg細(xì)胞中選擇性地上調(diào)。已經(jīng)表明FR4的抗體阻斷耗盡Treg細(xì)胞并引 起荷瘤小鼠的腫瘤免疫。因此，攜帶細(xì)胞毒性劑的葉酸-涂層PBM納米顆粒將吸收用于其 破裂的FR-表達(dá)細(xì)胞，其包括直接（即BrCa細(xì)胞）和間接（S卩乳腺腫瘤相關(guān)及周邊Treg細(xì) 胞）抑制腫瘤發(fā)展。
[0089] 在另一種實(shí)施方式中，所述靶向劑是能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的選自但不限于以下 各項(xiàng)的抗體或肽：腺苷受體、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小 窩蛋白-1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、 RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性 抗原、嘌呤受體、輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑 B4、鱗狀細(xì)胞癌抗原、血小板反應(yīng)蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關(guān)糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸 激酶等。
[0090] 治療方法
[0091] 本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及用于在所需要受試者中治療癌癥的方法，其包括給所述 受試者施用有效量的包括含有細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞祀向劑的行星球磨（PBM)納米顆粒的藥物 組合物。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞靶向劑是葉酸或葉酸衍生物。
[0092] 含有藥物的PBM納米顆粒是能夠抗巨噬細(xì)胞的吞噬作用并避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) (RES)間隙的長(zhǎng)循環(huán)納米顆粒，這反過(guò)來(lái)，將導(dǎo)致具有增加的透氣性和有缺陷的淋巴引流 (即增強(qiáng)通透性和保留-EPR效應(yīng))的腫瘤積聚。這些納米尺寸的載體的吸收有許多益處。由 于靶向遞送，本申請(qǐng)的含藥物的PBM納米顆粒顯著地減少全身毒性。
[0093] 在其它實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的含藥物的PBM納米顆粒防止耐藥性的出現(xiàn)。耐藥性 通過(guò)兩個(gè)主要機(jī)制介導(dǎo)：（i)足夠量的細(xì)胞毒性藥物未到達(dá)所述祀向細(xì)胞(和胞內(nèi)作用位 點(diǎn))和（ii)細(xì)胞凋亡機(jī)制的誘導(dǎo)后未能完成細(xì)胞死亡。能夠靶向并由乳腺腫瘤吸收的納米 顆粒有效地遞送化學(xué)治療劑和細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)，并攜帶足夠的藥物以完成細(xì)胞凋亡過(guò)程。
[0094] 在一些實(shí)施方式中，所述癌癥選自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細(xì)胞腫瘤和生殖 細(xì)胞瘤。
[0095] 在另一種實(shí)施方式中，所述癌是前列腺癌。在一些其它實(shí)施方式中，所述癌癥是前 列腺癌并且本申請(qǐng)的藥物組合物有效量的維生素 D結(jié)合施用。在一些男性的極低的維生素 D狀態(tài)也在PCa過(guò)程中顯示。此外，抗癌藥物相關(guān)的低鈣血癥通常是溫和的，但如果患者有 預(yù)先存在維生素 D缺乏，則可能是嚴(yán)重的。由于基于鉬類的癌癥治療和調(diào)節(jié)NER基因的靶 標(biāo)以調(diào)節(jié)DNA修復(fù)(這有助于前列腺癌的發(fā)展和對(duì)藥物的反應(yīng))，維生素 D能有效防止腎毒 性。
[0096] 在又一種實(shí)施方式中，所述癌是乳腺癌。
[0097] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述細(xì)胞毒性劑是姜黃素。
[〇〇98] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述細(xì)胞毒性劑選自化療劑、放射性偶聯(lián)物、抗體、 siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的任何其他藥劑。
[0099] 在另一種實(shí)施方式中，所述化療劑選自基于鉬的藥物、天然酚、植物生物堿和紫杉 烷類、其他烷化劑、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗代謝物以及各種抗腫瘤藥 物。
[0100] 在又一種實(shí)施方式中，所述放射性偶聯(lián)物包含選自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[〇1〇1] 在又一種實(shí)施方式中，所述能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的抗體或肽包括但不限于以下 各項(xiàng)：腺苷受體、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白-1、 趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、RAS、Ρ53、 HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤 受體、輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑M、鱗狀細(xì) 胞癌抗原、血小板反應(yīng)蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關(guān)糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0102] 在又一種實(shí)施方式中，對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的試劑選自白喉毒素 A鏈、白喉毒素 的非結(jié)合活性片段、外毒素 A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒蛋白A鏈，蒴 蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、 苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚 霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素，以及它們的片段。
[0103] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述細(xì)胞毒性劑包括天然苯酚和選自化學(xué)治療劑、放 射性偶聯(lián)物、抗體、肽、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性 的任何其他藥劑中的一種或多種其他細(xì)胞毒性劑。
[0104] 本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及在需要的受試者中抑制癌轉(zhuǎn)移，包括對(duì)所述受試者施用 有效量的包括含有細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞靶向劑的行星球磨（PBM)納米顆粒的藥物組合物。在 一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞靶向劑是葉酸或葉酸衍生物。
[0105] 在一種【具體實(shí)施方式】中，所述癌癥選自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細(xì)胞腫瘤和 胚細(xì)胞瘤。
[0106] 在另一種實(shí)施方式中，所述癌是前列腺癌。
[0107] 在又一種實(shí)施方式中，所述癌是乳腺癌。
[0108] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述細(xì)胞毒性劑是姜黃素。
[0109] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述所述細(xì)胞毒性劑選自化學(xué)治療劑、放射性偶聯(lián)物、 抗體、肽、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的任何其他藥 劑。
[〇11〇] 在另一實(shí)施方式中，所述化療劑選自基于鉬的藥物、天然酚、植物生物堿和紫杉烷 類、其他烷化劑、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗代謝物以及各種抗腫瘤藥物。
[0111] 在又一種實(shí)施方式中，所述放射性偶聯(lián)物包含選自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[0112] 在又一種實(shí)施方式中，所述能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的抗體或肽包括但不限于以下 各項(xiàng)：腺苷受體、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白-1、 趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、RAS、Ρ53、 HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤 受體、輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑M、鱗狀細(xì) 胞癌抗原、血小板反應(yīng)蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關(guān)糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0113] 在又一種實(shí)施方式中，對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的試劑選自白喉毒素 A鏈、白喉毒素 的非結(jié)合活性片段、外毒素 A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒蛋白A鏈，蒴 蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、 苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚 霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素，以及它們的片段。
[0114] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述細(xì)胞毒性劑包括姜黃素和選自化學(xué)治療劑、放射 性偶聯(lián)物、抗體、肽、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的 任何其他藥劑中的一種或多種其他細(xì)胞毒性劑。
[0115] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，靶向配體包括能夠與以下腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合的抗體或 肽，但不限于此：腺苷受體、ανβ3、氨肽酶Ρ、α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩 蛋白-1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、 RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性 抗原、嘌呤受體、輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑 B4、鱗狀細(xì)胞癌抗原、血小板反應(yīng)蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關(guān)糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸 激酶等。
[0116] 本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及在需要的受試者中誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞的細(xì)胞 凋亡，其包括：對(duì)所述受試者施用有效量的包括含有細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞靶向劑的行星球磨 (PBM)納米顆粒的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞靶向劑是葉酸或葉酸衍生物。
[0117] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及含有一種以上的化學(xué)治療劑的葉酸涂層的可生物降解 的PBM納米顆粒在治療癌癥的發(fā)展中的應(yīng)用。負(fù)載多西紫杉醇或卡鉬的葉酸涂覆PBM納米 顆粒增強(qiáng)了對(duì)腫瘤的治療效果，降低毒性，并通過(guò)靶向和誘導(dǎo)BrCa細(xì)胞和Treg細(xì)胞的細(xì)胞 凋亡以增加腫瘤免疫力。
[0118] 本申請(qǐng)的另一個(gè)具體方面涉及涂布有葉酸的負(fù)載姜黃素的PBM納米顆粒的靶向 遞送以增強(qiáng)體內(nèi)效力并改進(jìn)現(xiàn)有的化學(xué)預(yù)防癌癥的策略。
[0119] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是與受試者預(yù)先的治療結(jié)合，給受試者用含有細(xì)胞毒性劑的 PBM納米顆粒治療，同時(shí)或之后，用至少一種治療有效量的其它治療劑(包括但不限于不包 含在PBM納米顆粒的姜黃素或化療劑)。在一些實(shí)施方式中，所述不包含在PBM納米顆粒中 的化學(xué)治療劑選自卡鉬、順鉬、多西他賽和奧沙利鉬。
[0120] 本申請(qǐng)的藥物組合物可以用已知的方法對(duì)受試者給藥，例如作為推注的或通過(guò)連 續(xù)輸注一段時(shí)間的靜脈內(nèi)給藥、通過(guò)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、 口服、局部或吸入途徑。在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的藥物組合物直接給藥至腫瘤或癌組 織，包括在侵入性手術(shù)中直接給藥至腫瘤床。本申請(qǐng)的藥物組合物也可以放置在固體支持 物(例如海綿或紗布)上施加到受感染的組織中。本申請(qǐng)的含有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆粒 可以以通常接受的藥學(xué)上可接受的載體來(lái)施用?？山邮艿妮d體包括但不限于生理鹽水、緩 沖鹽水和生理鹽水中的葡萄糖。
[0121] 例如，適當(dāng)劑量("治療有效量"）的本申請(qǐng)的藥物組合物取決于待治療的疾病、病 情的嚴(yán)重程度和狀態(tài)進(jìn)程、本申請(qǐng)的藥物組合物給藥是用于預(yù)防還是治療目的、先前的療 法、患者的臨床史、對(duì)包含在所述藥物組合物中的細(xì)胞毒性劑的反應(yīng)、所使用的細(xì)胞毒性劑 的種類以及主治醫(yī)師的診斷。本申請(qǐng)的藥物組合物可以適當(dāng)?shù)匾淮位蛟谝幌盗兄委熤惺┯?給患者，并且可以在自診斷起的任何時(shí)間施用給患者。本申請(qǐng)的藥物組合物可以作為單獨(dú) 治療或者與對(duì)于所討論的治療狀態(tài)中有用的其他藥物或療法相結(jié)合來(lái)給藥。
[0122] 在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的藥物組合物含有姜黃素，以0. lmg/kg至100mg/kg、 0· 5mg/kg 至 100mg/kg、0. lmg/kg 至 50mg/kg、0. 5mg/kg 至 50mg/kg、l. Omg/kg 至 20mg/kg、 2. 5mg/kg至50mg/kg、2. 5mg/kg至20mg/kg以及5mg/kg至lOmg/kg的日姜黃素劑量范圍給 藥。含姜黃素的PBM納米顆?？梢赃B續(xù)給藥，每小時(shí)，每天4次，每天3次，每天2次，每天 一次，或者每2、3、4、5、6和7天一次，或者每1、2、3或4周一次。
[0123] 作為一般的建議，無(wú)論是通過(guò)一次或多次給藥，包含在PBM納米顆粒中的治療有 效量的每種細(xì)胞毒劑(例如姜黃素或順鉬)，以約lng/kg體重/天至約100mg/kg體重/天 的范圍給藥。在一種【具體實(shí)施方式】中，包含在PBM納米顆粒中的每種細(xì)胞毒劑以以下范圍 給藥：從約lng/kg體重/天至約lOmg/kg體重/天、約lng/kg體重/天至約lmg/kg體重 /天、約lng/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、約lng/kg體重/天至約10 μ g/kg體重 /天、約lng/kg體重/天至約1 μ g/kg體重/天、約lng/kg體重/天至約100ng/kg體重/ 天、約lng/kg體重/天至大約10ng/kg體重/天、約10ng/kg體重/天至約100mg/kg體重 /天、約l〇ng/kg體重/天至約10mg/kg體重/天、約10ng/kg體重/天至約lmg/kg體重/ 天、約10ng/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、約10ng/kg體重/天至大約10 μ g/kg 體重/天、約l〇ng/kg體重/天至約1 μ g/kg體重/天、10ng/kg體重/天至約100ng/kg體 重/天、約l〇〇ng/kg體重/天至約100mg/kg體重/天、約100ng/kg體重/天至約10mg/kg 體重/天、約l〇〇ng/kg體重/天至約lmg/kg體重/天、約100ng/kg體重/天至約100 μ g/ kg體重/天、約l〇〇ng/kg體重/天至約10μ g/kg體重/天、約100ng/kg體重/天至約 1 U g/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約100mg/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約 10mg/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約lmg/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約 100 μ g/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約10 μ g/kg體重/天、約10 μ g/kg體重/天 至約100mg/kg體重/天、約10 μ g/kg體重/天至約10mg/kg體重/天、約10 μ g/kg體重/ 天至約lmg/kg體重/天、約10 μ g/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、約100 μ g/kg體 重/天至約l〇〇mg/kg體重/天、約100 μ g/kg體重/天至約10mg/kg體重/天、約100 μ g/ kg體重/天至約lmg/kg體重/天、約lmg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天，約lmg/kg 體重/天至約l〇mg/kg體重/天、約10mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天。
[0124] 在另一種實(shí)施方式中，包含在PBM納米顆粒中的每種細(xì)胞毒性劑以以下范圍給 藥：每個(gè)體給藥約10ng至約100ng、每個(gè)體給藥約10ng到約1 μ g、每個(gè)體給藥約10ng到約 10以8、每個(gè)體給藥約1〇1^到約100以8、每個(gè)體給藥約1〇1^到約111^、每個(gè)體給藥約1〇1^ 到約10mg、每個(gè)體給藥約10ng至約100mg、每次注射約10ng至約lOOOrng、每個(gè)體給藥約 l〇ng到約10, OOOrng、每個(gè)體給藥約100ng至約1 μ g、每個(gè)體給藥約100ng至約10μ g、每 個(gè)體給藥約l〇〇ng至約100yg、每個(gè)體給藥約100ng至約lmg、每個(gè)體給藥約100ng至約 10mg、每個(gè)體給藥約100ng至約100mg、每次注射約100ng至約lOOOrng、每個(gè)體給藥約100ng 至約10,000mg、每個(gè)體給藥約lyg到約10yg、每個(gè)體給藥約lyg到約lOOyg、每個(gè)體 給藥約1 μ g到約lmg、每個(gè)體給藥約1 μ g到約10mg、每個(gè)體給藥約1 μ g到約100mg、每 次注射約1 μ g到約l〇〇〇mg、每個(gè)體給藥約1 μ g到約10, OOOmg、每個(gè)體給藥約10 μ g到約 100 μ g、每個(gè)體給藥約10 μ g到約lmg，每個(gè)體給藥約10 μ g到約10mg、每個(gè)體給藥約10 μ g 到約100mg、每次注射約10 μ g到約lOOOrng、每個(gè)體給藥約10 μ g到10, OOOrng、每個(gè)體給藥 約100 μ g到約lmg、每個(gè)體給藥約100 μ g至約10mg、每個(gè)體給藥約100 μ g至約100mg、每 次注射約100 μ g至約l〇〇〇mg、每個(gè)體給藥約100 μ g至約10, OOOrng、每個(gè)體給藥約lmg至 約10mg、每個(gè)體給藥約lmg到約100mg、每次注射約lmg至約lOOOrng、每個(gè)體給藥約lmg到 約10,000mg、每個(gè)體給藥約10mg至約100mg、每次注射約10mg至約lOOOrng、每個(gè)體給藥約 10mg至約10, OOOmg、每次注射約lOOmg至約lOOOmg、每個(gè)體給藥約lOOmg至約10, OOOmg以 及每個(gè)體給藥約lOOOmg到約10,000mg。包含在PBM納米顆粒中的化學(xué)治療劑可以每天、或 每2、3、4、5、6和7天、或每1、2、3或4周給藥。
[0125] 在其他的【具體實(shí)施方式】中，包含在PBM納米顆粒中的每種細(xì)胞毒性劑的給藥量為 或是約為：〇· 〇〇〇6mg/ 天、0· OOlmg/ 天、0· 003mg/ 天、0· 006mg/ 天、0· Olmg/ 天、0· 03mg/ 天、 0· 06mg/天、0· lmg/天、0· 3mg/天、0· 6mg/天、lmg/天、3mg/天、6mg/天、10mg/天、30mg/天、 60mg/天、lOOmg/天、300mg/天、600mg/天、lOOOmg/天、2000mg/天、5000mg/天或 10, OOOmg/ 天。正如預(yù)期的那樣，所述劑量取決于患者的病情、體重、年齡和狀況。正如預(yù)期的那樣，所 述劑量取決于患者的病情、體重、年齡和狀況。
[0126] 所述含有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆?？梢园凑者m當(dāng)?shù)鼗虮砻鞯耐ㄟ^(guò)丸劑或通過(guò) 連續(xù)輸注的單劑量，或通過(guò)丸劑或通過(guò)連續(xù)輸注作為多劑量來(lái)給藥。例如，多劑量可以每天 多次，每日一次，每2、3、4、5、6或7天，每周，每2、3、4、5或6周或每月一次給藥。然而，其 它劑量方案也可利用。此療法的進(jìn)程易于通過(guò)常規(guī)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。
[0127] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，治療有效量的含有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆?？梢?作為唯一的治療劑給需要的受試者給藥。在【具體實(shí)施方式】中，治療有效量的含有細(xì)胞毒性 劑的PBM納米顆粒殺死腫瘤或癌癥細(xì)胞或促進(jìn)其凋亡。在另一種【具體實(shí)施方式】中，治療有 效量的含有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌的形成。在進(jìn)一步的具體實(shí)施 方式中，治療有效量的含有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌細(xì)胞從現(xiàn)有的 腫瘤或癌細(xì)胞中的遷移或轉(zhuǎn)移。在又一【具體實(shí)施方式】中，治療有效量的含有細(xì)胞毒性劑的 PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌癥細(xì)胞侵入非癌組織。
[0128] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，治療有效量的含有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆?？梢?與一種或多種附加的治療有效的細(xì)胞毒性劑結(jié)合以施用給需要的受試者。一種或多種附加 的治療有效的細(xì)胞毒性劑也可以在具有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆粒施用之前、與其同時(shí)、 和/或之后來(lái)施用。
[0129] 在具體的實(shí)施方式中，治療有效量的含有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆粒增強(qiáng)所述的 一種或多種附加的治療學(xué)上有效的細(xì)胞毒性劑殺死腫瘤或癌癥細(xì)胞的有效性。在一種更具 體的實(shí)施方式中，治療有效量的包含細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆粒減少了所述的一種或多種 附加的治療學(xué)上有效的細(xì)胞毒性劑用于殺死腫瘤或癌癥細(xì)胞所需要的量。在一種更具體的 實(shí)施方式中，治療有效量的含有細(xì)胞毒性劑的PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌癥細(xì)胞從 已形成的腫瘤或癌遷移或轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)所述的一種或多種附加的治療學(xué)上有的細(xì)胞毒性劑殺 死腫瘤或癌癥細(xì)胞的局部有效性。在又一種【具體實(shí)施方式】中，治療有效量的含有細(xì)胞毒性 劑的PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌癥細(xì)胞向非癌組織侵入，增強(qiáng)所述的一種或多種附 加的治療學(xué)上有效的細(xì)胞毒性劑殺死腫瘤或癌癥細(xì)胞的局部有效性。
[0130] 在另一種實(shí)施方式中，所述的PBM納米顆粒包含對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的藥劑。 在一些實(shí)施方式中，所述對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的藥劑選自白喉毒素 A鏈、白喉毒素的非 結(jié)合活性片段、外毒素 A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮 根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、苦 瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉 素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素，以及它們的片段。
[0131] 本發(fā)明通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，而不應(yīng)該解釋為限制。本申請(qǐng)引用的所有 參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)，以及圖和表的內(nèi)容，通過(guò)引用并入本發(fā)明。
[0132] 實(shí)施例1 :制各行星球磨納米顆粒
[0133] 首先，將10%至15% (w/v)的藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白、淀粉、乳糖、其它生物聚 合物或它們的混合物(賦形劑/生物聚合物)溶解在水中，并使用均化器混合。接著，將10% 至20% (w/v)的蛋白質(zhì)(例如BSA或IgG)或大分子(例如禮、紫杉醇和順鉬等）（w/v)在 4°C下加入到賦形劑/生物聚合物溶液中。接著，將10% PEG (w/v)加入到生物聚合物-細(xì) 胞毒性劑溶液中，并攪拌30分鐘。離心后，將溶液倒入約3mm3壓片機(jī)并干燥。然后在控制 的溫度條件下（<37°C)用行星式球磨機(jī)研磨上述藥片。所得到的顆粒可以單獨(dú)使用（即未 涂覆的)，或者通過(guò)在l〇〇〇rpm的連續(xù)攪拌下涂布5%、10%或20%的？(^溶液(在二氯甲烷 中）。最后用水漂洗PCL包衣生物聚合物-PEG顆粒，干燥并以粉末貯存。
[0134] PCL活化和肽偶聯(lián)：活化PCL以將肽或底物(例如葉酸）連接到其表面上用于 顆粒的靶向遞送。首先，將2g的PCL溶解于6ml無(wú)水二噁烷中，并在50°C的水浴中 加熱2小時(shí)以溶解聚合物，然后冷至室溫（RT)。2ml的Ν，Ν'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯 (Ν, Ν' disuccinimidylcarbonate) (153. 7mg/ml，在無(wú)水丙酮中）和 2ml 批陡溶液（4. 745mg/ ml，在無(wú)水丙酮中）與PCL懸浮液在室溫下連續(xù)攪拌下6小時(shí)進(jìn)行混合。然后用具有1 μ m 孔隙尺寸的G2玻璃纖維過(guò)濾該混合物以除去沉淀物。用4體積的乙醚將得到的上清液沉 淀。沉淀物在丙酮中再懸浮，用乙醚再次沉淀。然后干燥已活化的或活性的PCL，并于4°C 下貯存。
[0135] 然后將活化的PCL偶聯(lián)到賴氨酸或來(lái)自肽的任何游離胺基。將所需的肽或氨基酸 (例如賴氨酸)溶解在〇. 1M Na.取代.2HP04、0. 1M硼酸，2mg/ml的濃度，pH值為8. 5。接著， 在4°C下將所述溶解在乙腈中的活化的PCL與肽或氨基酸以8:1的比例（活化的PCL :肽或 氨基酸）攪拌混合過(guò)夜，用玻璃濾器過(guò)濾除去過(guò)量的活化未偶聯(lián)的PCL。
[0136] 顆粒的涂覆：用溶解在二氯甲烷中的各種濃度(例如5%、10%和10%)的PCL或結(jié) 合胺的PCL連續(xù)攪拌（lOOOrmp)涂布已知量和尺寸的顆粒。通過(guò)離心分離后除去上清液， 將所得到的PCL涂覆顆粒從PCL涂布液中分離。所得PCL涂覆的納米球經(jīng)過(guò)過(guò)濾、風(fēng)干，在 4°C下貯存。
[0137] 熱分析：使用珀金埃爾默鉆石DSC (PerkinElmer Diamond DSC)進(jìn)行差示掃描量熱 法（DSC)和熱重/差熱分析。首先，在氮?dú)夥罩?，以恒定的速?每分鐘10°C )將約lmg顆 粒從30°C加熱到250°C。然后完成顆粒的熱重曲線。
[0138] 蛋白質(zhì)負(fù)載的量化和表征：在其內(nèi)含物結(jié)合之后，在37°C下，進(jìn)行了 pH為7. 4的 磷酸鹽緩沖鹽水中PCL包覆的生物聚合物PEG顆粒的體外釋放研究。在37°C下，將約100mg 顆粒在100ml PBS或檸檬酸t(yī)ris緩沖液中懸浮并消化以確定其釋放速率。還使用0. 1、0. 22 或0. 45 μ m的微孔過(guò)濾器過(guò)濾顆粒。含蛋白質(zhì)的內(nèi)含物溶解于PBS或檸檬酸t(yī)ris緩沖鹽 水中，并使用洛瑞蛋白質(zhì)測(cè)定法（Lowry's protein assay)測(cè)定釋放速率。在聚合物包衣的 微粒的情況下，每48小時(shí)收集樣品，同時(shí)更換PBS以模仿宿主的無(wú)限滲透狀態(tài)。
[0139] 圓二色性光譜分析也用于評(píng)價(jià)分子組裝相比于標(biāo)準(zhǔn)或包封蛋白（例如BSA或IgG) 的規(guī)律性。通過(guò)測(cè)量它們的以△ ε方式表示的圓二色性并將它們與作為標(biāo)準(zhǔn)的未封裝的 蛋白質(zhì)比較以確定釋放的蛋白質(zhì)的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)(例如α-螺旋、β片層等）的構(gòu)象。
[0140] 顆粒大小、電荷和形態(tài)分析：通過(guò)使用馬爾文顆粒大小和電荷分析儀(激光粒度 儀）對(duì)顆粒進(jìn)行激光衍射分析其粒徑。顆粒分散在dH 20中，分析電荷和大小。用掃描電子 顯微鏡（SEM)表征PCL涂覆的生物聚合物PEG顆粒的表面形態(tài)。對(duì)于SEM分析，顆粒是通過(guò) 將干燥的顆粒分配到粘在鋁樁的雙面粘合帶的一側(cè)來(lái)制備。然后使用極化SC S00-噴射涂 布機(jī)用金涂覆該樁，至其厚度為20至30nm。然后將樣品引入到掃描電子顯微鏡的樣品室， 并檢測(cè)表面形態(tài)。通過(guò)首先將lmg樣品和lOOmg干燥溴化鉀粉末混合以得到的PCL包覆生 物聚合物-PEG顆粒制劑的不同階段的紅外光譜。接著，使用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定樣 品的紅外光譜。
[0141] 對(duì)于將納米顆粒上漿，以下的方向提供指導(dǎo)。在一般情況下，通過(guò)使用填充有一 到三個(gè)20mm和10至60個(gè)10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保 持在200至400rmp的研磨速度，以控制粒度范圍為5至30nm、30至180nm、0. 2至1 μ m、1 至6 μ m、4至12 μ m或10至60 μ m。該研磨間隔時(shí)間應(yīng)設(shè)置為10分鐘，隨后進(jìn)行15分鐘 的靜止周期。10至25個(gè)循環(huán)(研磨和靜止）允許>99. 5 %的顆粒尺寸范圍為5至30nm、30 至180nm、0. 2至Ιμπκ?至6μ m、4至12 μ m或10至60 μ m。當(dāng)研磨罐的尺寸增大到>50ml (例如125ml、500ml等)，球的數(shù)量隨罐體積的增加而成比例的增加。
[0142] 通過(guò)研磨球和活動(dòng)-靜止周期的顆粒尺寸調(diào)節(jié)的實(shí)例：使用填充有三個(gè)20mm和 10個(gè)10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保持在400rmp的研磨速 度，可以獲得范圍為5至30nm的顆粒尺寸。該研磨間隔時(shí)間應(yīng)設(shè)置為10分鐘，隨后進(jìn)行 15分鐘的靜止周期。15至25個(gè)周期(研磨和靜止)導(dǎo)致>99. 5%的顆粒尺寸范圍從5nm到 30nm〇
[0143] 使用填充有三個(gè)20mm和10個(gè)10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐， 并使用保持在400rmp的研磨速度，可以獲得范圍為30至180nm的顆粒尺寸。該研磨間隔 時(shí)間應(yīng)設(shè)置為10分鐘，隨后進(jìn)行15分鐘的靜止周期。15至20個(gè)周期(研磨和靜止）導(dǎo)致 >99. 5%的顆粒尺寸范圍從30至180nm。
[0144] 使用填充有三個(gè)20mm和10個(gè)10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐， 并使用保持在300rmp的研磨速度，可以獲得范圍為0. 2至1 μ m的顆粒尺寸。該研磨間隔 時(shí)間應(yīng)設(shè)置為10分鐘，隨后進(jìn)行15分鐘的靜止周期。15至20個(gè)周期(研磨和靜止）導(dǎo)致 >99.5%的顆粒尺寸范圍從0.2至1以111。
[0145] 使用填充有2個(gè)20mm和13個(gè)10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨 罐，并使用保持在300rmp的研磨速度，可以獲得范圍為1至6 μ m的顆粒尺寸。該研磨間隔 時(shí)間應(yīng)設(shè)置為10分鐘，隨后進(jìn)行15分鐘的靜止周期。20至25個(gè)周期(研磨和靜止）導(dǎo)致 >99. 5%的顆粒尺寸范圍從1至6μπι。
[0146] 使用填充有2個(gè)20mm和13個(gè)10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨 罐，并使用保持在250rmp的研磨速度，可以獲得范圍為4至12 μ m的顆粒尺寸。該研磨間 隔時(shí)間應(yīng)設(shè)置為10分鐘，隨后進(jìn)行15分鐘的靜止周期。15至20個(gè)周期(研磨和靜止）導(dǎo) 致>99. 5%的顆粒尺寸范圍從4至12 μ m。
[0147] 使用填充有1個(gè)20mm和16個(gè)10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐， 并使用保持在200rmp的研磨速度，可以獲得范圍為10至60 μ m的顆粒尺寸。該研磨間隔 時(shí)間應(yīng)設(shè)置為10分鐘，隨后進(jìn)行15分鐘的靜止周期。10至15個(gè)周期(研磨和靜止）導(dǎo)致 >99. 5%的顆粒尺寸范圍從10至60 μ m。
[0148] 賦形劑/生物聚合物濃度對(duì)顆粒特性的影響：用在dH20賦形劑/生物聚合物溶液） 中約10% (w/v)的藻酸鈉、約8% (w/v)纖維素或約10% (w/v)淀粉生產(chǎn)具有不同尺寸 的顆粒（5nm至60μπι土平均尺寸的10%)。低于2% (w/v)的藻酸鈉、纖維素或淀粉，發(fā)現(xiàn) 平均尺寸變化不大于10%的顆粒的產(chǎn)率較低。在大于15%的海藻酸鈉或10%的纖維素時(shí)， 賦形劑/生物聚合物溶液保持高粘性，不能用于片劑形成和隨后的顆粒制備。類似地，淀粉 (賦形劑/生物聚合物）溶液需要加熱到50°C維持20分鐘，以獲得最佳的溶解性和粘度，淀 粉的濃度不能超過(guò)12% (w/v)。
[0149] 賦形劑/生物聚合物溶液的粘度也對(duì)顆粒的形態(tài)具有顯著的影響。隨著賦形劑/ 生物聚合物溶液濃度（>1 % (w/v))的增加，顆粒變得更光滑和球形的。然而，〈10%的賦形 劑/生物聚合物溶液產(chǎn)生出理想的顆粒尺寸。在藻酸鈉、纖維素或淀粉的濃度（w/v)分別 為10%、8%或10%時(shí)，對(duì)于納米或微顆粒的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)了最佳的產(chǎn)率。因此，在隨后的研究 中，準(zhǔn)備上述最佳濃度用于研磨成顆粒的3mm 3片劑的產(chǎn)生。
[0150] 研磨速度和行星球的尺寸對(duì)于顆粒尺寸的影響：如上面的實(shí)例所示，行星球磨裝 置的研磨速度（RetschPMlOO)和研磨球的尺寸在控制顆粒大小方面發(fā)揮了顯著作用。改變 轉(zhuǎn)速?gòu)?到lOOrpm進(jìn)行20分鐘，并用10個(gè)10mm加3個(gè)20mm的球，導(dǎo)致顆粒尺寸范圍從 20至50 μ m ;而以速度為100至200rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行20分鐘，得到10至20 μ m的微粒。調(diào) 節(jié)速度為200至300rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行20分鐘，并使用50個(gè)5mm加15個(gè)10mm球，導(dǎo)致顆粒 尺寸范圍從1至5 μ m。增加轉(zhuǎn)速?gòu)?00到400rpm，并使用100個(gè)5mm球，導(dǎo)致顆粒尺寸范 圍為〇. 5至1 μ m。
[0151] 先研磨片劑產(chǎn)生-20至50 μ m尺寸的微粒以產(chǎn)生<500nm的顆粒。使用100個(gè)3mm 球加500個(gè)2mm球在400至600rpm下將所得到的微粒進(jìn)一步研磨20分，以產(chǎn)生尺寸范圍 為5至500nm的納米顆粒。再進(jìn)一步增加速度并未對(duì)尺寸的減小有任何顯著的效果。
[0152] 顆粒蛋白截留和負(fù)載效率：BSA負(fù)載可以從4至25% (w/v)變化。在>20% (w/ v)負(fù)載蛋白時(shí)，研磨后形成的產(chǎn)物顆粒積聚且形態(tài)異常。在納米或微顆粒中具有100%的 效率的BSA負(fù)載的可以實(shí)現(xiàn)的最1?限為約20%。
[0153] 無(wú)涂層的和PCL-涂層的生物聚合物-PEG顆粒的形態(tài)：由SEM來(lái)看，顯而易見的 是，與無(wú)涂層顆粒相比，通過(guò)PCL-涂層修飾的顆粒表面表現(xiàn)平整、均勻。以多種PCL涂布的 顆粒表面特征出現(xiàn)額外的平滑。然而，在體外釋放內(nèi)含物之后，顆粒的表面由光滑球形變?yōu)?粗糙的、非球形的，并形成空泡。
[0154] 實(shí)施例2 :腫瘤相關(guān)抗原配體涂層和負(fù)載對(duì)乳腺癌細(xì)朐的化學(xué)治療劑的PBM納米 顆粒
[0155] 用于偶聯(lián)至葉酸的聚己內(nèi)酯-聚乙二醇共聚物涂布?20nm直徑的負(fù)載細(xì)胞毒性 藥物的可生物降解的行星球磨（PBM)納米顆粒。葉酸涂布的PBM納米顆粒進(jìn)一步負(fù)載多西 紫杉醇、卡鉬或順鉬。使用20 μ Μ的順鉬溶液的初級(jí)細(xì)胞和細(xì)胞系的孵化，導(dǎo)致在24小時(shí) 的培養(yǎng)后，81^&細(xì)胞（1〇^-7、10^-1^-231和41'1)和正常(初級(jí)）乳房上皮細(xì)胞的>90%的 細(xì)胞死亡。然而，含有10倍以下的化學(xué)治療劑的ΡΒΜ納米顆粒被吸收，并分別誘導(dǎo)與順鉬、 多西紫杉醇或卡鉬溶液相同水平的BrCa細(xì)胞凋亡，但不是原發(fā)性乳腺上皮細(xì)胞。此外，通 過(guò)靜脈注射接受順鉬溶液（8mg/kg/周）或順鉬包裹葉酸涂布的PBM納米顆粒(相當(dāng)于順鉬 劑量=0. 08mg/kg/周）的攜帶乳腺腫瘤的小鼠產(chǎn)生顯著的（以及類似的）腫瘤消退。接受順 鉬溶液的小鼠比天然的或PBM納米顆粒處理過(guò)的小鼠具有顯著更高的腎臟和肝臟的毒性。 據(jù)了解，類似表達(dá)高水平的葉酸受體a (FRa/FRl)的腫瘤細(xì)胞，T調(diào)節(jié)性（Treg)細(xì)胞表達(dá) FRY (FR4)，并且FR4阻斷增強(qiáng)的腫瘤免疫。因此，本申請(qǐng)的新型PBM納米顆粒增強(qiáng)BrCa 治療效果，降低毒性，提高乳腺腫瘤免疫。
[0156] PBM納米顆粒(含卡鉬或紫杉醇）介導(dǎo)的腫瘤消退是具有特征的。納米顆粒可用 于治療MDA-MB-231-螢光素酶陽(yáng)性（LUC)，以及MCF-7-luc的異種移植腫瘤(發(fā)展之前和之 后)。在一些實(shí)施方式中，Caliper/Xenogen IVIS?生物光子成像系統(tǒng)用于測(cè)量乳腺腫瘤的 負(fù)載量。使用Aperio Scanscope和Spectrum軟件，通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC)的離體腫瘤的 體外分析和形態(tài)分析，確定在乳腺腫瘤中細(xì)胞凋亡的變化(半胱天冬酶-3和陽(yáng)性_9)和增 生（Ki67陽(yáng)性）的表型。
[0157] 圖3示出了高親和力的葉酸受體（FR)由BrCa腫瘤和細(xì)胞系表達(dá)。
[0158] 圖4示出了負(fù)載順鉬、多西紫杉醇或卡鉬的葉酸涂布的PBM納米顆粒選擇性地靶 向BrCa細(xì)胞和誘導(dǎo)其中的細(xì)胞凋亡。
[0159] 圖5示出了通過(guò)靜脈注射接受順鉬溶液（8mg/kg/周）或含順鉬(相當(dāng)于順鉬劑量 =0. 08mg/kg/周）的葉酸涂布的PBM納米顆粒的MDA-MD-231-luc的荷瘤小鼠產(chǎn)生顯著的腫 瘤消退。通過(guò)靜脈注射接受順鉬溶液（8mg/kg/周)或含順鉬(相當(dāng)于順鉬劑量=0. 08mg/kg/ 周）的葉酸涂布的PBM納米顆粒的MDA-MD-231-luc的荷瘤小鼠產(chǎn)生顯著的腫瘤消退。
[0160] 接受順鉬溶液的的荷瘤小鼠具有比天然的或PBM納米顆粒治療的小鼠顯著更高 的腎臟和肝臟的毒性。熒光素酶表達(dá)人類BrCa細(xì)胞（MDA-MB-231-luc ;ERNeg PRNeg Her2Neg和 MCF-7-luc ;ERP°S PRp°s Her2p°s)的原位乳腺脂肪墊注射后，描述PBM納米顆粒(含有卡鉬或紫 杉醇）介導(dǎo)的腫瘤消退的特征。腫瘤發(fā)展或腫瘤消退之后，含有多紫杉醇、卡鉬或不加藥物 的texas紅染料的葉酸涂布的PBM納米顆粒遞送后，是使用Caliper/Xenogen IVIS-100成 像系統(tǒng)是對(duì)荷瘤Nu/Xid小鼠的非侵入性成像。通過(guò)免疫組織化學(xué)的體外分析確定在乳腺 腫瘤中細(xì)胞凋亡(半胱天冬酶-3和陽(yáng)性_9)的變化和用新型PBM納米顆粒處理過(guò)的腫瘤的 表型。NIH-III小鼠用于移植MDA-MB-231-luc和MCF-7-luc的細(xì)胞系。
[0161] PBM納米顆粒影響腫瘤發(fā)展、免疫，分別使用4Tl-LUC_synograft和新型PyMT-luc 小鼠模型來(lái)確定自發(fā)性腫瘤發(fā)展。使用Caliper/Xenogen IVIS-100成像系統(tǒng)對(duì)臨床相關(guān)的 移植（4T1)和自發(fā)性（PyMT)乳腺腫瘤的發(fā)展進(jìn)行非侵入性監(jiān)測(cè)。使用Aperio組織學(xué)掃描 儀和分析系統(tǒng)進(jìn)行的免疫組織化學(xué)和顯微形態(tài)分析測(cè)量在乳腺腫瘤中細(xì)胞凋亡的變化(半 胱天冬酶-3和陽(yáng)性-9)和增生（Ki67陽(yáng)性）的表型。此外，描述對(duì)于⑶25、FR4、FoxP3的、 IL-10和/或TGF-β 1的表達(dá)，和抑制Thl/Th2細(xì)胞增殖能力的外周的、淋巴結(jié)和腫瘤相關(guān) 的T細(xì)胞的數(shù)量和活性的特征。
[0162] 本申請(qǐng)的PyMT-LUC轉(zhuǎn)基因小鼠是通過(guò)首先將小鼠跨越3代交配以創(chuàng)造 F3MMTV-LUC小鼠。隨后F3MMTV-LUC小鼠與PyMT小鼠繁殖創(chuàng)造 PyMT-luc小鼠。
[0163] 圖6示出PBM納米顆粒選擇性地殺死調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（F0XP3+CD25Hi)，但不是T輔 助（FoxP3TD25,細(xì)胞。類似于表達(dá)高水平FR的癌細(xì)胞，T調(diào)節(jié)性（Treg)細(xì)胞表達(dá)FRY (FR4)，并且FR4封鎖增強(qiáng)的腫瘤免疫；以及（vi)顯示我們可以選擇性地破壞Treg細(xì)胞 (F0XP3+CD25Hi)，但不是T輔助細(xì)胞。圖3-5提供了生物學(xué)和臨床基本原理以顯示新型負(fù)載 多西紫杉醇或卡鉬的葉酸涂層PBM納米顆粒增強(qiáng)對(duì)腫瘤的治療效果，降低毒性，并通過(guò)靶 向和誘導(dǎo)BrCa和Treg細(xì)胞死亡來(lái)增加腫瘤免疫以減少與化療相關(guān)的健康差距。
[0164] 實(shí)施例3 :腫瘤細(xì)朐靶向和化療-負(fù)載PBM納米顆粒對(duì)前列腺癌細(xì)朐的影響
[0165] 用聚己內(nèi)酯-聚乙二醇共聚物和葉酸涂布?20nm直徑的負(fù)載細(xì)胞毒性藥物的可 生物降解的PBM納米顆粒。使用20 μ Μ順鉬對(duì)PCa細(xì)胞（PC3和PTEN-CaP2)和正常前列腺 上皮細(xì)胞（PrEC和RWPE-1)的處理導(dǎo)致>90%的細(xì)胞死亡。含有100倍以下順鉬的PBM納 米顆粒被吸收，并誘導(dǎo)與順鉬溶液相同的水平的前列腺癌細(xì)胞凋亡，但并沒有顯著影響正 常細(xì)胞。接受順鉬溶液（8mg/kg/周)或葉酸包覆的PBM納米顆粒(含0.08mg/kg/周的等效 劑量順鉬）的荷瘤小鼠產(chǎn)生了顯著（以及類似）的腫瘤消退。然而，接受順鉬溶液的小鼠比 天然的或PBM納米顆粒處理過(guò)的小鼠具有顯著更高的腎臟和肝臟的毒性。PCa細(xì)胞表達(dá)高 水平的葉酸受體a (FRa/FRl);類似地，T調(diào)節(jié)性（Treg)細(xì)胞表達(dá)FRY (FR4)，并且FR4 阻斷增強(qiáng)的腫瘤免疫。盡管有維生素 D缺乏、小窩蛋白1的表達(dá)和NER的基因型相關(guān)的健 康差距，PBM納米顆粒增強(qiáng)了腫瘤治療效果，降低毒性，并提高乳腺腫瘤免疫。
[0166] 圖7示出FR是由PC3和PTEN_CaP2腫瘤表達(dá)，而不是由細(xì)胞系或正常細(xì)胞表達(dá)。
[0167] 如圖8所示，負(fù)載順鉬的葉酸涂覆的PBM納米顆粒選擇性地靶向體外PC3細(xì)胞的 破壞。
[0168] 如圖9所示，通過(guò)靜脈注射接受順鉬溶液（8mg/kg/周）或葉酸包覆的
【權(quán)利要求】
1. 一種用于特異性靶向癌細(xì)胞的藥物組合物，包括：包含姜黃素的行星球磨（PBM)納 米顆粒，其中，所述的PBM納米顆粒涂有葉酸或葉酸衍生物。
2. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括選自化學(xué)治療 齊U、放射性偶聯(lián)物、抗體、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及細(xì)胞毒性劑中的一 種或多種附加的細(xì)胞毒性劑。
3. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包含選自基于鉬的 藥物、天然酚，植物生物堿和紫杉烷類、其他烷化劑、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制 齊[J、抗代謝物、熱休克蛋白拮抗劑和各種抗腫瘤藥物中的一種或多種化學(xué)治療劑。
4. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括來(lái)自結(jié)合一種 或多種腫瘤相關(guān)抗原的肽或抗體的靶向配體。
5. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括包含選自 212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和186Re的放射性同位素的放射性偶聯(lián)物。
6. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括選自白喉毒 素 A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素 A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思 豆毒蛋白A鏈，蒴蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、 ΡΑΡΙΙ和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉 素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素以及它們的片段中的一種或多種細(xì)胞 毒性劑。
7. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述ΡΒΜ納米顆粒包括基質(zhì)芯，其含有選自 藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白、淀粉和PEG中的一種或多種可生物降解的聚合物和多糖。
8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒包含基質(zhì)芯，其含有PEG 和選自藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉的其它可生物降解的多糖。
9. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒還包括包含選自PEG、PCL 或它們的混合物的可生物降解聚合物的釋放控制涂層。
10. 如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述葉酸或葉酸衍生物與所述釋放控制涂 層結(jié)合。
11. 一種用于在有需要的受試者中治療癌癥的方法，其包括給受試者施用一種有效量 的藥物組合物，所述藥物組合物包含： 包含姜黃素的行星式球磨（PBM)納米顆粒，其中，所述PBM納米顆粒涂覆有葉酸、腺苷、 嘌呤、激素、高親和力腫瘤受體的肽配體或抗腫瘤抗原的抗體或它們的混合物。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述癌癥選自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細(xì) 胞腫瘤，以及胚細(xì)胞瘤。
13. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括選自化學(xué)治療劑、 放射性偶聯(lián)物、抗體、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及細(xì)胞毒性劑中的一種或 多種附加的細(xì)胞毒性劑。
14. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括選自卡鉬、順鉬、多 西他賽和奧沙利鉬中一種或多種化學(xué)治療劑。
15. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括放射性偶聯(lián)物，所 述放射性偶聯(lián)物包含選自212Bi、 131I、mIn、9°Y、188Tu和186Re的放射性同位素。
16. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括選自白喉毒素 A 鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素 A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒 蛋白A鏈，蒴蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII 和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限 曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素以及它們的片段中的一種或多種細(xì)胞毒性劑。
17. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒包含基質(zhì)芯，其含有選自藻酸 鹽、纖維素、膠原蛋白、淀粉和PEG中的一種或多種可生物降解的聚合物。
18. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒包含基質(zhì)芯，其含有PEG和選 自藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉的其它可生物降解的聚合物。
19. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進(jìn)一步包括包含PEG、PCL或 它們的混合物的釋放控制涂層。
20. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述葉酸或葉酸衍生物與所述釋放控制涂層結(jié) 合。
21. -種用于在有需要的受試者中抑制癌轉(zhuǎn)移的方法，其包括給受試者施用有效量的 藥物組合物，所述藥物組合物包括：包含姜黃素的行星球磨（PBM)納米顆粒，其中，所述PBM 納米顆粒涂覆有葉酸。
22. -種用于在有需要的受試者中誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的方法，其包 括向受試者施用有效量的涂覆有葉酸的并含有對(duì)Treg細(xì)胞有細(xì)胞毒性的藥劑的行星球磨 (PBM)納米顆粒。
【文檔編號(hào)】A61K9/14GK104066425SQ201280050727
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月15日
【發(fā)明者】詹姆斯·W·利拉德 申請(qǐng)人:詹姆斯·W·利拉德