提供多價免疫的重組非致病性mdv載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及獸醫(yī)疫苗領域，具體涉及基于重組非致病性馬立克氏病病毒（npMDV）的用于家禽的載體疫苗領域。本發(fā)明的重組npMDV穩(wěn)定且有效表達各自源于不同微生物的兩種異源基因：來自新城疫病毒的融合蛋白基因，和來自傳染性法氏囊病病毒的病毒蛋白質2基因?；谶@種重組npMDV的疫苗可以用于在家禽中誘導不僅針對馬立克氏病，還針對新城疫和傳染性法氏囊病的保護性免疫應答。本發(fā)明還涉及關于重組npMDV、表達盒、受感染的宿主細胞和疫苗的方法和用途。
【專利說明】提供多價免疫的重組非致病性MDV載體
[0001]本發(fā)明涉及獸醫(yī)疫苗領域，具體涉及基于重組非致病性馬立克氏病病毒的用于家禽的病毒載體疫苗領域。
[0002]馬立克氏病病毒(MDV)形成感染禽類物種的α皰疹病毒亞科(alphaherpesvirideae)的。病毒粒子是有包膜的，并且大小約160 nm。它們在衣殼內包含線性雙鏈DNA的大基因組。
[0003]MDV血清型I (MDVl)也命名為禽皰疹病毒2型(Gallid herpesvirus 2)，對于雞是致病性的并且在全世界發(fā)生。它是致瘤的且引起淋巴瘤和麻痹。減毒的MDVl毒株已用作疫苗，例如 Rispens 疫苗(毒株 CV1-988) (Kreager, 1998, Poultry Sc1.，第 77 卷，第 1213頁)。
[0004]MDV血清型2 (MDV2)也被稱為禽皰疹病毒3型，強減毒為雞的實際無致病性MDV(Petherbridge 等人,2009, J.Virol.Meth.，第 158 卷,第 11 頁)，其通常用作針對 MDVl 的疫苗。眾所周知的 MDV2 疫苗是 Nobilis ? Marexine SBl (MSD Animal Health)。
[0005]MDV血清型3也被稱為:吐綬雞皰疫病毒I型(Meleagrid herpesvirus I)、火雞皰疹病毒，但最通常被稱為:火雞的皰疹病毒(HVT)。這大約在1970年被描述為感染火雞的皰疹病毒(Witter等人，1970, Am.J.Vet.Res.，第31卷，第525頁)，其對于雞是無致病性的。HVT毒株例如PBl或FC-126通常用于針對MDVl接種。或者，當需要針對超強毒MDVl的保護時，HVT與MDV2疫苗株組合使用，例如在Nobilis ? Marexine CA126+SB1 (MSDAnimal Health)中與 SBl 組合，或在 Nobilis ? RISMAVAC+CA126 (MSD Animal Health)中與MDVl疫苗株例如Rispens組合。
[0006]非致病性馬立克氏·病病毒(npMDV)MDV2和HVT在鳥類的外周血淋巴細胞(PBL，s)中復制，因而它們是全身性病毒，這誘導長持續(xù)時間的免疫應答，所述免疫應答主要針對細胞而不是體液免疫系統。
[0007]npMDV疫苗可在早期應用于雞，這是其安全無致病性的性質以及對針對MDV2或HVT的母源抗體(MDA)的相對不敏感性的組合結果；雛雞中的MDV是經由來自其母親的蛋衍生的抗體，所述母親作為例行程序針對常見的家禽病原體進行充分接種。因而，npMDV疫苗可早在其從蛋中孵化的當天(第一天)，或甚至在孵化前仍在蛋中時接種到雛雞內。該后一種方法，所謂的‘雞胚接種(in ovo vaccination)’，是胚胎接種的形式，其通常在胚胎發(fā)育(ED)的第18天(在孵化前約3天)應用。
[0008]在活的重組載體中表達的異源基因通常編碼這樣的蛋白(或其相關部分)，所述蛋白是待針對其接種的微生物的主要宿主保護免疫原；因為這種蛋白或肽攜帶此類微生物的一個或多個免疫顯性表位，所以它可以誘導宿主的免疫系統產生將所述微生物從接種的靶動物中清除的中和抗體和/或細胞免疫。
[0009]除自身用作疫苗，HVT也用作病毒載體疫苗用于多種免疫原性蛋白的表達和向家禽動物的遞送，參見WO 87/04463。編碼來自家禽病原體的抗原的幾種基因已在HVT載體中表達，所述基因例如來自:新城疫病毒(NDV) (Sondermeijer等人，1993,Vaccine,第11卷，第349-358頁)、和傳染性法氏囊病病毒(IBDV) (Darteil等人，1995，Virology，第211卷，第481-490頁)。但還描述了寄生蟲抗原(Cronenberg等人，1999, Acta Virol.,第43卷，第192-197頁)和細胞因子的表達，以操縱雞的免疫應答(WO 2009/156.367 ；Tarpey等人，2007，Vaccine，第 25 卷，第 8529-8535 頁)。
[0010]HVT載體疫苗向家禽的施用生成針對所表達的異源基因、以及針對HVT (其針對MDV進行保護)的免疫應答。這應用于多種商業(yè)HVT載體疫苗產品中，例如:NDV F蛋白基因:Innovax ?-ND (MSD Animal Health),和 Vectormune ? HVT-NDV (Ceva);或 IBDV VP2基因=Vaxxitek? HVT+IBD (Merial ;先前命名為:Gallivac ? HVT-1BD)、和 Vectormune ?HVT-1BD (Ceva)；
HVT的基因組核苷酸序列例如可作為:AF291866(毒株FC-126)得自Genbank ?。已描述了用于將異源核酸插入HVT內的幾種方法,例如通過使用同源重組(Sondermeijer等人，同上)、黏粒再生(US 5，961，982)或桿粒(細菌人工染色體)(Baigent等人，2006，J.0f Gen.Virol.，第 87 卷，第 769-776 頁)。
[0011]用于將異源基因構建體插入HVT基因組內的許多遺傳位置已進行研究，并且?guī)讉€合適的非必需基因座已得到描述，例如在HVT基因組的獨特短區(qū)(unique short region)中(EP 431.668);或在 HVT 獨特長區(qū)(unique long region)中(EP 794.257)。
[0012]不同啟動子已用于驅動異源基因在HVT的表達盒中的表達，例如:PRV gpX啟動子(W0 87/04.463);勞斯肉瘤病毒LTR啟動子、SV40早期基因啟動子和人巨細胞病毒立即早期l(hCMV IEl)基因啟動子(EP 719.864);或雞β -肌動蛋白基因啟動子(EP 1.298.139)。
[0013]類似地，MDV2毒株的基因組核苷酸序列可得自Genbank?:HQ840738 (SBl)JPAB049735 (HPRS24)。MDV2的基因組組構非常類似于HVT的，并且特別是Us區(qū)與HVT的相同(Kingham 等人,2001, J.0f Gen.Virol.,第 82 卷，第 1123 頁；Spatz 和 Schat, 2011，Virus genes,第42卷,第331頁)。MDV2病毒的克隆和轉染已得到描述(Petherbridge等人，同上)。
[0014]對于重組載體的構建，待`插入載體的基因組內的異源構建體通常為包含至少一個(異源)基因或編碼區(qū)的核酸分子，其必須能夠編碼抗原蛋白(的至少免疫原性部分)。而且，構建體可以包含啟動子序列以驅動異源基因的表達。在后面一種情況下，構建體通常稱為‘表達盒’。
[0015]表達盒插入載體的基因組內所得到的作用可以不同，因為這個基因組的大小可以變得更大、相同或更小，這取決于對基因組的最終結果是否分別是遺傳材料的添加、替換或缺失。插入位置也可以改變:置于基因組的編碼區(qū)內或非編碼區(qū)內；并且放置可以在載體的基因或調節(jié)區(qū)域內或兩者之間。這些選擇決定表達盒的最終組成必須是怎樣的，并且其對載體的作用以及最終對接種的靶動物的作用將是怎樣的。
[0016]無論構建體多么精確，有利的表達盒均必須允許活的重組病毒載體克服對其穩(wěn)定性和功效的許多生物應激:首先，在已接受異源插入片段后生成后代的能力。這指示盡管插入其基因組內，但重組病毒仍是活的。接下來，在體外在宿主細胞系中復制多個循環(huán)，同時保持異源插入片段的復制和表達的能力。這指示重組體未由于插入而在其復制方面減弱，并且插入片段是穩(wěn)定維持且表達的。第三，體內復制和表達。這指示重組病毒可以克服活動物中例如由其免疫系統造成的的強選擇壓力。在這個環(huán)境中，外源基因的表達喪失有利于在動物中的更快速復制；此類‘逃避突變體(escape mutants)’具有在外源基因或其調節(jié)區(qū)中的獲得性突變或主要缺失，并且可以使完整病毒載體過度生長。最后且最重要的是，在動物中的載體復制和異源基因的表達需要能夠生成此類有效的免疫應答，使得接種的動物得到保護不受否則將由微生物引起的感染和/或疾病，所述微生物是載體表達的異源插入片段的供體。
[0017]因而，所得到的重組載體必須提供表達盒在其基因組中的穩(wěn)定整合；所得到的重組載體在體外和體內的良好復制；和一種或多種異源基因在體內的有效表達，優(yōu)選為高水平并隨著時間保持一致，以誘導且維持保護性免疫應答。
[0018]這個特征組合將允許在體外的大量的復制輪次，這是大規(guī)模生產必需的，以及是當載體疫苗在接種的靶動物中復制時，插入的外源基因持續(xù)表達和呈遞給宿主的免疫系統所必需的。此外，該復制和表達中的穩(wěn)定性是載體疫苗順應非常高的安全性和生物穩(wěn)定性標準所必需的，在獲得來自國家政府當局的上市許可后，待作為商業(yè)產品引入領域內的重組病毒必須滿足所述標準。
[0019]新城疫和傳染性法氏囊病是重要的家禽疾病，其在全世界發(fā)生且可以引起養(yǎng)禽業(yè)中關于動物福利和經濟運行的嚴重負面效應(參見Disease of poultry，第12版，2008，Υ.Saif 編輯，1wa State Univ.出版社，ISBN-10:0813807182)。
[0020]新城疫病毒屬于單股反鏈病毒目(Mononegavirales)，具體為副粘液病毒科(Paramyxoviridae)，并且可以根據其毒力分組成不同致病型；非致病性緩發(fā)型(Ientogenic)NDV在家禽中幾乎不引起癥狀。相比之下，中發(fā)型(mesogenic)(中等致病性)和速發(fā)型(velogenic)(高致病性)NDV毒株引起廣泛疾病和死亡率，并且因此是許多國家中的法定傳染病。疾病癥狀包括呼吸和神經異常，并且喘息(gasping)和‘斜頸’是最值得注意的。 [0021 ] 在商業(yè)家禽操作中，針對由致病性NDV毒株引起的感染和/或疾病的保護通過家禽的常規(guī)接種來實現，通常在孵化當天，使用活的緩發(fā)型NDV毒株，例如Nobilis ? NDClone 30 (MSD Animal Health)。
[0022]NDV具有非節(jié)段、負義、單鏈RNA基因組，其長度約15 kb，并且含有六種基因，在其中有免疫顯性蛋白F糖蛋白的基因。F蛋白涉及NDV附著宿主細胞和進入宿主細胞內，并且可以是針對NDV的有效免疫應答的基礎。它作為天然H)蛋白表達，所述H)蛋白由肽酶細胞外切割成Fl和F2。切割的容易性由位于F1/F2切割位點處的某些堿性氨基酸的氨基酸序列決定，并且這決定NDV毒株的毒力。
[0023]傳染性法氏囊病病毒(IBDV)也被稱作禽腎病病毒，是傳染性法氏囊病的致病因子，并且是雙核糖核酸病毒科的成員。這個科中的病毒具有由雙鏈RNA的兩個節(jié)段(A和B)組成的基因組。較大節(jié)段A編碼110 kDa的多蛋白，其隨后通過自體溶解切割，以形成成熟病毒蛋白VP2、VP3和VP4。在這些中，VP2和VP3是病毒粒子的結構衣殼蛋白，并且VP2是主要宿主保護性免疫原。
[0024]在IBDV的情況下，存在兩種血清型，血清型I和2。兩種血清型可以通過病毒中和(VN)測試加以區(qū)分。血清型I病毒已顯示對雞是致病性的，而血清型2 IBDV僅在火雞中引起亞急性疾病。
[0025]歷史上，IBDV血清型I病毒僅由稱為“經典” IBD病毒的一種類型組成。近來，出現所謂的“變體” IBDV毒株；可以通過使用單克隆抗體實驗對象組的病毒中和測試或通過RT-PCR，來鑒定并區(qū)分經典毒株和變體毒株；這由Wu等人(2007，Avian Diseases，第51卷，第515-526頁)綜述。眾所周知的經典IBDV毒株是:D78、Faragher 52/70和STC。
[0026]IBDV是雞淋巴組織的急性、高度接觸傳染性病毒感染，具有鳥類的基本免疫器官:法氏囊作為它的主要靶。易感群體中的死亡率高，伴隨快速體重減輕和中至高的死亡率。由于法氏囊(部分)的破壞，從該疾病恢復的雛雞可能具有免疫缺陷。這使得它們易受繼發(fā)感染影響。
[0027]在野外，傳播的野生型IBDV的毒力似乎從強毒株逐漸增加到超強毒株。這可能需要所使用的疫苗的改變。
[0028]針對IBD的常規(guī)接種使用活IBDV毒株在雛雞壽命中盡可能早地進行，但這些僅在針對IBDV的MDA水平已足夠降低時才可以適用，其通常在孵化后7-30天之間的某處，通常在第15-20天之間。許多活的或滅活的IBDV疫苗是商購可得的，例如活疫苗例如Nobilis?Gumboro D78 (MSD Animal Health)。
[0029]為了實現成本效益，常見方法是設計包含抗原組合的疫苗。以這種方式，單個接種輪次可以使鳥類針對許多疾病立刻免疫。這不僅節(jié)省時間和勞力成本，它還減少對接種動物的不適和應激，所述不適和應激否則將由于必須接受反復接種而發(fā)生。在這方面的最高效率在這樣的接種的情況下實現，其不通過大量應用例如通過噴射或經由飲用水而給予，而是需要通過注射個別應用。這個的實例是用滅活的亞單位疫苗給蛋雞和種雞接種。這些目前已發(fā)展成包含高達7種不同抗原的組合疫苗；例如Nobilis? Cor4+IB+ND+EDS (MSDAnimal health)。
[0030]因為基于重組npMDV作為病毒載體的疫苗也需要通過個別注射進行施用，因此在這個背景下的組合也是高度希望的。(除了來自NPMDV載體自身的MDV保護之外)立刻保護以不受幾種不同疾病的能力將具有極大利益。因此，許多團體已研究多于一種異源抗原通過npMDV載體接種的組合表`達和遞送。
[0031]顯而易見的方法是組合各自含有單個異源插入片段的現有重組npMDV載體疫苗。然而，過去已發(fā)現這并未產生良好結果，因此關于現有HVT重組疫苗的產品信息不推薦其與其他(單個)HVT重組體的組合。
[0032]可能由于在接種的靶動物中的競爭選擇，重組npMDV毒株之一能夠相對于其他毒株過度生長。因此，僅一種重組疫苗株能夠有效復制，并且從而產生僅針對有關病原體的僅一種的免疫保護。
[0033]替代方案是構建在一個重組體基因組中攜帶多個異源插入片段的npMDV載體。自從開發(fā)了第一種重組npMDV構建體(W0 87/044630)，這已得到研究，并且隨著時間過去事實上已描述了 HVT中的幾種多價插入片段組合，例如:在WO 93/25665中，實施例11的“二價疫苗”，構建體HVT-007、HVT-048和HVT-096 ;類似地，在WO 96/05291中，實施例11-14的“二價疫苗”，以及甚至實施例16-17的“三價疫苗”。這同樣適用于如EP 719.864中所述的HVT重組體。
[0034]雖然這些構建體中的大多數僅是建議，但實際上分離了所描述的具有多個插入片段的載體中的一些；一些甚至在SPF (無特異性病原體)雞中進行測試。然而，對于這些多價表達構建體中的大多數，從未公開關于這些構建體的遺傳穩(wěn)定性，或關于異源插入片段隨著時間在體外或在體內的表達的任何研究結果。[0035]事實上，根據許多現有技術公開，已充分測試且證明作為疫苗是安全、穩(wěn)定和有效的具有多個插入片段的唯一重組npMDV，是包含來自傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的gD和gl基因的構建體，其作為Innovax ?-1LT (MSD Animal Health)商購可得。
[0036]然而，即使在這種情況下，異源插入片段仍僅提供針對單一家禽病原體即ILTV的單價保護。這是因為ILTV gD/gl基因天然重疊且需要組合表達，以允許針對ILTV的適當免疫接種。因此，多價插入是出于必要，而不是有意擴大免疫接種范圍。
[0037]因而，直到今天，并且盡管極大的潛在優(yōu)點和隨著時間的多次嘗試，仍不存在描述安全、穩(wěn)定和有效的重組npMDV載體疫苗的現有技術，所述疫苗提供各自源于不同微生物的多于一種異源基因的表達，且由此允許通過用單一重組npMDV載體疫苗的接種生成(除針對MDV的免疫應答之外)多價免疫應答。
[0038]本發(fā)明的目的是適應本領域的這個需要，并且首次提供安全和穩(wěn)定的重組npMDV載體疫苗，其允許(除針對MDV的保護之外)針對多于一種家禽病原體的有效家禽免疫接種。
[0039]令人驚訝地發(fā)現這個目的由根據本發(fā)明的重組npMDV滿足，所述重組npMDV提供來自多于一種家禽病原體的異源免疫保護性抗原的表達。
[0040]因此，本發(fā)明涉及包含異源核酸分子的重組非致病性馬立克氏病病毒(npMDV)，其特征在于所述異源核酸分子在5’至3’方向上并按該次序包含:
人巨細胞病毒立即早期I基因(hCMV-1El)核心啟動子， k.新城疫病毒(NDV)融合(F)蛋白基因，
C1.轉錄終止子，
4.雞肌動蛋白基因核心啟動子，
L經典型傳染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒蛋白2 (VP2)基因。
[0041]這完全不象本發(fā)明人在其實驗過程中發(fā)現的那么簡單，因為在現有技術中描述的用于二價或三價構建體(在其他中表達NDV F蛋白基因或IBDV VP2基因)的許多重組npMDV具有嚴重缺點；它們或者完全不能復制，或者僅能夠復制有限數目的循環(huán)，或者在體外不顯示異源插入片段的表達，并且極少在體內是有效的，或者提供足夠的免疫保護。遺傳穩(wěn)定性在測試的大多數情況下差。因此，大多數不適合生成基于重組npMDV的有效疫苗。
[0042]類似地，由已知表達盒與單個F蛋白或VP2基因組合制成的重組npMDV也是不成功的；或者不生成后代，或者不可見表達，或者表達由于不穩(wěn)定性而快速喪失，導致逃避突變體(參見實施例1和圖1)。
[0043]為了克服這些問題，必須作出非顯而易見的選擇，并且作出超出例行活動(routine activities)的選擇和修飾，以便取得用于表達NDV F蛋白和IBDV VP2蛋白兩者的重組npMDV，其的確具有所需水平的遺傳穩(wěn)定性，載體病毒復制能力和異源基因的一致表達。
[0044]本發(fā)明人發(fā)現 太強啟動子的使用引起所得到的npMDV載體的多價表達盒中的不穩(wěn)定性，而太弱的啟動子不誘導足夠的表達或免疫保護。盡管他們不希望受理論束縛，但他們推測使得根據本發(fā)明的重組npMDV相對于現有技術載體取得成功的關鍵特征是:所使用的特定啟動子的選擇，并組合為調節(jié)其相對強度而對這些啟動子進行的修飾，以及由這些啟動子表達的異源基因在表達盒中相對于彼此的特定次序。這個復雜和特定的特征組合提供了攜帶多價表達盒的重組npMDV，其具有在穩(wěn)定性、復制能力和表達水平方面的恰到好處的平衡，以使得這種重組npMDV克服它在體外和體內遇到的所有生物學障礙，并且在使靶動物免疫接種中仍是有效的。
[0045]對于本發(fā)明，“重組體”是其遺傳材料已進行修飾以導致它最初不具有的遺傳構成的核酸分子或微生物。
[0046]對于本發(fā)明，“npMDV”是來自MDV病毒家族的病毒，其顯示對家禽很少的致病性或無致病性。優(yōu)選地，npMDV是天然存在的病毒，或已通過傳代進行減毒例如用于用作疫苗的病毒。在更優(yōu)選的實施方案中，npMDV是MDV2或HVT病毒。取決于效用，這些中的任一種均可以是更優(yōu)選的，因為它們提供特定優(yōu)點:MDV2比HVT自然地更加病毒血癥化(vireamic)，因此當需要根據本發(fā)明的重組npMDV的快速傳播時，優(yōu)選的親本病毒是MDV2，更優(yōu)選SBl毒株。另一方面，當根據本發(fā)明的重組npMDV的安全性是首要的時，HVT是優(yōu)選親本病毒，更優(yōu)選PBl或FC-126毒株。
[0047]在甚至更優(yōu)選的實施方案中，采用根據本發(fā)明的重組npMDV的組合，其中重組載體的親本病毒具有不同類型，例如MDV2和HVT。這個實施方案的優(yōu)點是極大增強在靶動物內呈遞且表達的免疫原性蛋白數目的可能性。每種載體可以包含多種異源基因，直到其中它的穩(wěn)定性、病毒復制和表達變得受影響的某一最大數目。因此，載體的組合可以遞送且呈遞比單獨的一類載體更多的異源基因。這種來自不同類型的載體組合隨后克服現有技術的問題，其中多于一種相同類型載體的接種導致這些之一的過度生長，使得免疫接種僅對于來自載體之一的抗原實現。通過組合根據本發(fā)明具有不同類型的npMDV載體，例如基于MDV2和HVT載體的組合，不出現一種相對于其他的明顯過度生長。
[0048]如本文使用的術語“包含(comprising)” (以及變化諸如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、和“包含(comprised)”)意在指由在其中使用該術語的正文部分、段落、權利要求等覆蓋或包括于其中的，對于本發(fā)明可設想的所有要素和以任何可能組合的所有要素，即使此類要素或組合并未明確敘述；并且不指排除任何的此類一種或多種要素或組
口 ο`
[0049]因此，任何此類正文部分、段落、權利要求等因此還可以涉及其中術語“包含
(comprising)”(或其變體)替換為術語例如“由......組成(consist of)”、“由......組成
(consisting of)”、或“基本上由......組成(consist essentially of)”的一個或多個實施方案。
[0050]如果基因不存在于用于生成根據本發(fā)明的重組npMDV載體的親本npMDV中，則該基因對于攜帶它的npMDV是“異源的”。
[0051]術語“基因”用于指示能夠編碼蛋白的核酸。用于本發(fā)明的基因優(yōu)選編碼完整的蛋白，但還可以編碼蛋白的區(qū)段，例如僅編碼成熟形式的蛋白，即不含‘前導區(qū)’、‘錨’或‘信號序列’。基因甚至可以編碼蛋白的特定區(qū)段，例如包含免疫保護性表位的區(qū)段。
[0052]在那方面，本發(fā)明的“蛋白”是氨基酸的分子鏈。蛋白可以是天然或成熟蛋白、前蛋白(preprotein)或蛋白原(proprotein)、或蛋白的功能片段。尤其地:肽、寡肽和多肽包括在蛋白的定義內。
[0053]對于本發(fā)明，“包含異源核酸分子”涉及異源核酸分子插入npMDV的基因組內。插入可以通過任何可獲得的技術進行，只要所得到的重組npMDV能夠展示其安全、穩(wěn)定和有效的多價抗原表達的有利作用。[0054]優(yōu)選的插入技術是例如如WO 93/25.665中所述的通過黏粒再生，或如EP996.738中所述的通過使用桿粒。這基本上采用一組npMDV基因組的重疊亞基因組大片段，以通過共轉染到宿主細胞內重構完整的npMDV基因組。因為黏粒之一攜帶表達盒，所以這變得穩(wěn)定整合到(隨后重組的)npMDV的基因組內。
[0055]用于通過黏粒再生將根據本發(fā)明的核酸轉染到HVT的基因組內的方案概述在圖3中描述。
[0056]術語“在5’至3’方向上”，也被稱為:“在下游方向上”，是本領域眾所周知的。它連同術語“按該次序”一起用于指示概括的元件其后需要關于彼此和關于宿主細胞的基因表達機(gene-expression machinery)具有的相對定向，根據本發(fā)明的重組npMDV將在所述宿主細胞中復制且表達。如技術人員將認識到的，該定向涉及來自npMDV的雙鏈DNA基因組的為‘編碼鏈’的DNA鏈，并且它涉及在‘有義’方向上編碼的mRNA分子。
[0057]雖然如此，并且對上文部分無偏差:在其為‘模板’鏈的DNA雙螺旋的互補鏈上，所列出元件的相對次序是相同的，但DNA鏈定向是從3’到5’。
[0058]另外，如對于技術人員顯而易見的，因為表達盒是自包含的表達模塊，所以用于本發(fā)明的表達盒整體相對于npMDV基因組的定向不是關鍵的。這意指核酸分子就整體而言可以以兩種定向的任一種整合到npMDV基因組內。例如，當根據本發(fā)明的核酸分子插入npMDV基因組的Us區(qū)中時，它可以定向為朝向TR閱讀或可定向為朝向IR閱讀。圖1在這方面僅展示這兩種可能定向之一。
[0059]本發(fā)明的“啟動子”眾所周知是在生物的基因組上的功能區(qū)，其指導下游編碼區(qū)的轉錄。啟動子因此是位于可讀框(通常為基因)上游的核酸元件(通常為DNA)。
[0060]啟動子起始它控制的基因或編碼區(qū)從‘轉錄起始位點’(TSS)開始的mRNA合成。產生的mRNA依次從基因的起·始密碼子開始翻譯成蛋白，所述起始密碼子是可讀框中的第一個ATG序列(mRNA中的第一個AUG)。通常，TSS位于起始密碼子上游30-40個核苷酸處。TSS可以通過例如經由RACE技術測序基因mRNA的5’端進行測定。
[0061]一般而言,啟動子包含在起始密碼子的A位置上游1000個核苷酸內，所述A位置一般指示為A+1，并且大多數啟動子位于-500和A+1之間。
[0062]常見啟動子含有許多可識別的調節(jié)區(qū)，例如涉及調節(jié)轉錄的時間、持續(xù)時間、條件和水平的增強子區(qū)域。中心啟動子區(qū)涉及轉錄因子的結合和指導RNA聚合酶。這一般含有許多保守序列元件例如TATA框、CAAT框和GC框。
[0063]啟動子的命名法通?；谒刂破浔磉_的基因。例如，術語‘hCMV-1El基因啟動子’指在自然界中驅動來自hCMV的IEl基因表達，并且位于該基因緊密上游的啟動子。因為IEl-基因是如此充分記錄且可明確識別的基因，并且因為許多皰疹病毒科(herpesvirideae)的基因組已(整體或部分)進行測序，所以此類啟動子可以容易地通過常規(guī)技術進行鑒定。例如，啟動子可以簡單地通過大致亞克隆在兩個連續(xù)基因之間的區(qū)進行選擇，所述區(qū)例如從上游基因的聚A信號到下游基因的TSS。啟動子隨后通過標準測試進行鑒定:通過懷疑的啟動子的亞克隆的更小或更大區(qū)段表達標記基因。
[0064]因而，“hCMV-1El”基因啟動子是本領域眾所周知的，并且可以容易地得自多種商業(yè)來源，例如得自用于克隆和表達的商業(yè)質粒的供應商。IEl基因也被稱作主要IE基因。通常，這個hCMV-1El基因啟動子大小約1.5 kb，并且由增強子、啟動子和內含子組成，由此啟動子活性進行到內含子區(qū)內。hCMV-1El增強子-啟動子區(qū)的詳細研究由Koedood等人(1995，J.0f Virol.，第69卷，第2194-2207頁)描述。hCMV-1El基因啟動子可以例如來源于如由Cox等人(2002, Scand.J.1mmunol.,第55卷,第14-23頁)描述的質粒pi 17,或來源于哺乳動物表達載體例如pCMV (Clontech)、或pCMV-MCS (Stratagene ;Genbank?登記號AF369966)系列。或者，啟動子可以使用常規(guī)分子生物學工具和方法得自hCMV病毒的基因組，得自在IEl基因前的區(qū)域。
[0065]對于本發(fā)明，現有技術hCMV-1El基因啟動子不是有效的，因為它在npMDV載體的背景下和在進一步的異源基因由其表達的表達盒中沒有展示出所需的強度和穩(wěn)定性。令人驚訝地發(fā)現通過使用hCMV-1El基因啟動子的特定中心部分，“核心”啟動子(元件a.)，實現了所需特征。在具體實施方案中，這個核心啟動子大小僅約361 bp，并且呈現于SEQ ID NO:1中。
[0066]然而，對于hCMV-1El基因核心啟動子，許多高度相似的形式是已知的；例如，使用Blast比對用SEQ ID NO:1作為查詢針對NCBI，s Genbank ?的檢索，展示在95%同一性水平內的超過60種相似的啟動子序列。這些hCMV-1El啟動子的同系物和變體同樣可用于本發(fā)明，只要使用這種啟動子的相似核心區(qū)段。
[0067]因此，在優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明的hCMV-1El基因核心啟動子是約361個堿基對的核酸分子，其包含與SEQ ID NO:1中的核苷酸序列全長具有至少95%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選的是至少96、97、98、99或甚至100%的核苷酸序列同一性,這是優(yōu)先的次序。
[0068]如技術人員清楚地知道的，可以出現hCMV-1El基因核心啟動子以及其他元件的長度中的一些變化，所述其他元件構成插入根據本發(fā)明的重組npMDV中的異源核酸分子。這可以由用于克隆和構建的確切條件中的差異所產生；例如由使用不同限制酶位點、PCR克隆引物、或用于適應 使用的克隆分子端的不同條件所產生。因而，可以出現構成元件長度中的一些變化。
[0069]因此，對于本發(fā)明“約361”是:361 ± 25%，優(yōu)選土 20、15、12、10、8、6、5、4、3、2、
I或甚至0%，這是優(yōu)先的次序。
[0070]然而，這在這樣的條件下:此類長度差異不影響總體異源核酸分子插入片段的穩(wěn)定性和功效，則這些長度差異是不重要的，并且視為本發(fā)明的部分。
[0071]用于在(病毒)載體中表達異源基因的啟動子必須能夠有效驅動下游編碼區(qū)的轉錄。這通常被稱為啟動子與基因“可操作地連接”，或:基因“處于啟動子的控制下”。這通常意指在表達盒中，啟動子和基因在相同DNA上連接，處于有效接近中，并且在它們之間沒有將干擾有效轉錄和翻譯的信號或序列。
[0072]因此，在優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明的hCMV-1El基因核心啟動子與NDV F蛋白的下游基因“可操作地連接”。
[0073]用于本發(fā)明的“NDV F蛋白基因”(元件b.)編碼來自NDV的融合蛋白。此類基因是眾所周知的，并且它們的序列信息是現有技術中從多種通?？色@得的質粒構建體中可廣泛獲得的?；蛘撸梢允褂糜糜诓僮鱎NA病毒的常規(guī)技術獲得自從自然界中分離的NDV。NDV病毒可以使用血清學或分子生物學容易地鑒定。
[0074]用于本發(fā)明的F蛋白基因來源于NDV克隆30，常見的緩發(fā)型NDV疫苗株；該基因的序列呈現于SEQ ID N0:2中。對于本發(fā)明，來自緩發(fā)型、中發(fā)型或速發(fā)型NDV的F蛋白基因的同系物和變體將同樣適用，因為F蛋白基因序列自身在這些不同的NDV致病型中是高度保守的。
[0075]因此，對于本發(fā)明，NDV F蛋白基因優(yōu)選是包含這樣的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列與如SEQ ID NO:2中的核苷酸序列全長具有至少90%核苷酸序列同一'丨生。更優(yōu)選的是至少92、94、95、96、97、98、99或甚至100%的核苷酸序列同一性，這是優(yōu)先的次序。
[0076]或者，為了進一步改善由根據本發(fā)明的核酸分子表達的異源蛋白的免疫功效，可對異源基因實施密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化的方法是本領域眾所周知的，并且涉及編碼蛋白的核苷酸序列的改變，以編碼與原始編碼序列相同的氨基酸，但它具有其他核苷酸；即進行的突變是基本上沉默的。這可以改進編碼序列在不同于所表達基因起源的生物背景下表達的水平。
[0077]本發(fā)明人已發(fā)現為了實現所需復制穩(wěn)定性和表達效率，必需有意將在根據本發(fā)明的核酸分子中的兩種異源基因的轉錄分開，從而生成兩種單獨的mRNA。因此，需要在下述兩個編碼區(qū)之間引入轉錄終止子:NDV F蛋白基因的下游和Ch β_肌動蛋白基因核心啟動子的上游。
[0078]“轉錄終止子”(元件c.)眾所周知是調節(jié)核酸區(qū)，其引起通過RNA聚合酶的編碼DNA序列轉錄的終止。通常，‘內在型終止’由所生成的mRNA中的莖環(huán)結構引起，所述莖環(huán)結構包含富含G-C的序列，隨后為富含U的序列。大多數基因包含在其編碼序列下游端處的轉錄終止子，并且對于本發(fā)明，使用何種終止子不是關鍵的，只要實現下游F蛋白基因的有效轉錄終止，并且阻止進入VP2編碼區(qū)的‘通讀’轉錄?？梢杂糜诒景l(fā)明的方便的轉錄終止子的一個實例是在SEQ ID NO:3中所述的hCMV-1El基因轉錄終止子。
[0079]“雞β-肌動蛋白基因啟動子”(Ch β_肌動蛋白基因啟動子)是現有技術眾所周知的，并且許多質粒構建體和商業(yè)表達載體采用這種啟動子。它首先由Kost等人(1983，Nucl.Acids Res.，第 11 卷，第 82`87-8301 頁)描述，參見 Genbank 登記號:Χ00182。隨后制備許多變體，例如雜合啟動子(Tsukamoto等人，2002，J.0f Virol.，第76卷，第5637-5645頁)。在EP 351.585中，發(fā)明人通過改變剪接受體位點來修飾Ch β_肌動蛋白基因啟動子，以使得其高達10倍多的多產性:位于Ch B-肌動蛋白基因啟動子-7處的原始剪接受體位點替換為來自兔珠蛋白基因的第三內含子的剪接受體位點；所得到的經修飾的Ch β-肌動蛋白基因啟動子在Genbank登記號:Ε03011中描述，并且用于Genbank登記號:AJ575208中所述的質粒中。
[0080]對于本發(fā)明，測試了這種經修飾的Ch β_肌動蛋白基因啟動子，但它是無效的；它需要進一步的重大改變，以提供所需強度和穩(wěn)定性平衡，用于npMDV多價表達載體的背景下。這通過缺失該Ch β_肌動蛋白基因啟動子中的大部分內含子來實現。所得到的僅包含該啟動子的核心區(qū)的經改變的啟動子是Ch β_肌動蛋白基因核心啟動子(元件d.)，其大小約696 bp并且呈現為SEQ ID N0.:4。
[0081]然而，如同上文描述的經修飾的hCMV-1El基因核心啟動子的情況，許多高度相似形式的Ch β-肌動蛋白基因核心啟動子是已知的。此類Ch β-肌動蛋白基因核心啟動子的同系物和變體同樣可用于本發(fā)明，只要使用這種啟動子的相似核心區(qū)段。
[0082]因此，在優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明的Ch β_肌動蛋白基因核心啟動子是具有約696個堿基對的核酸分子，其包含與SEQ ID NO:4中的核苷酸序列全長具有至少95%核苷酸序列同一'I"生的核苷酸序列。更優(yōu)選的是至少96、97、98、99或甚至100%的核苷酸序列同一性，這是優(yōu)先的次序。
[0083]如上所述，不影響根據本發(fā)明的總體核酸分子的穩(wěn)定性和功效的長度差異視為本發(fā)明的部分。因此，對于本發(fā)明“約696”是:696 土 25%，優(yōu)選土 20、15、12、10、8、6、5、4、
3、2、I或甚至0%，這是優(yōu)先的次序。
[0084]根據本發(fā)明的Ch β_肌動蛋白基因核心啟動子需要與下游經典IBDV VP2基因“可操作地連接”。
[0085]用于本發(fā)明的“經典型IBDV VP2基因”(元件e.)編碼來自為經典類型的IBDV的VP2蛋白。此類基因是眾所周知的，并且它們的序列信息是現有技術中可容易獲得的，參見例如.Genbank 登記號:D00869 (F52/70)、D00499 (STC)或 AF499929 (D78)?；蛘撸@種基因可以使用用于操作雙RNA病毒的常規(guī)技術得自從自然界中分離的經典IBDV的基因組。經典型IBDV可以使用血清學或分子生物學容易地鑒定。
[0086]用于本發(fā)明的VP2基因來源于經典IBDV毒株Faragher 52/70 ;該基因的序列呈現于SEQ ID N0:5中。對于本發(fā)明，VP2基因的同系物和變體將同樣適用，只要它們是經典
血清型。
[0087]因為此類VP2蛋白基因通常共享多于90%核苷酸序列同一性，因此，對于本發(fā)明，經典IBDV VP2基因優(yōu)選是包含這樣的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列與如SEQ IDNO:5中的核苷酸序列全 長具有至少90%核苷酸序列同一性。更優(yōu)選的是至少92、94、95、96、97、98、99或甚至100%的核苷酸序列同一性，這是優(yōu)先的次序。
[0088]根據本發(fā)明的重組npMDV可以通過常見技術產生，主要通過在雞原代細胞通常為雞胚成纖維細胞(CEF)的體外培養(yǎng)中擴增。這些可以通過雞胚的胰蛋白酶消化進行制備。將CEF鋪為單層并且用npMDV感染。該方法可以將規(guī)模擴大到工業(yè)規(guī)模的生產。
[0089]通常，收獲仍完整的受感染的宿主細胞，以獲得以其細胞伴隨的(cell-associated)形式的重組npMDV。將這些細胞吸收于適當的載體組合物中以提供穩(wěn)定作用用于貯存和冷凍。接下來，受感染細胞通常被裝填到玻璃安瓿內，將所述玻璃安瓿密封、冷凍且貯存于液氮中。這樣它們可以在所謂的‘冷鏈’物流中轉運至世界各地的使用者。
[0090]在其中冷鏈不可行，并且根據本發(fā)明的npMDV是重組HVT的情況下，替代方案是使用冷凍干燥。這采用HVT的有利特征，即它可以例如通過在培養(yǎng)結束時的超聲處理從其宿主細胞中分離，吸收到穩(wěn)定劑內，并且冷凍干燥用于穩(wěn)定貯存。
[0091]在根據本發(fā)明的重組npMDV的優(yōu)選實施方案中，在表達盒中包含進一步的遺傳元件:另外的轉錄終止子(元件f.)存在于根據本發(fā)明的核酸中的經典IBDV VP2基因下游。這用于保證VP2基因表達的轉錄終止，其不依賴于側接表達盒3’側的npMDV基因組區(qū)的組成。
[0092]與F蛋白基因下游的終止子(元件c.)相比較，VP2下游的轉錄終止子(元件f.)可以是相同或不同的，只要提供適當的轉錄終止并且穩(wěn)定性和表達不受影響。
[0093]在進一步優(yōu)選的實施方案中，在根據本發(fā)明的核酸中的經典IBDV VP2基因的3’側處的轉錄終止子(元件f.)來源于貓皰疹病毒I (FHV1)，來自FHVl Us9下游的FHVl Us/TRs連接部。這例如在Genbank登記號:D42113中描述，并且用于本發(fā)明的一個實施方案的序列呈現于SEQ ID NO:6中。
[0094]在優(yōu)選實施方案中，根據本發(fā)明的重組npMDV包含如呈現于SEQ ID NO:7中和如圖2中所述的核苷酸序列。
[0095]應當指出SEQ ID NO:7中提供的序列是對于來自重組npMDV構建體HVP309的表達盒確定的實際核苷酸序列，其已從轉染后選擇的蝕斑擴增用于6次組織培養(yǎng)傳代。
[0096]因此，在進一步方面，本發(fā)明涉及用于根據本發(fā)明的重組npMDV的構建的核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上并按該次序包含:
a.hCMV-1El核心啟動子， b.NDV F蛋白基因，
C.轉錄終止子，
d.雞β-肌動蛋白基因核心啟動子， e.經典型IBDV VP2基因，
f. 轉錄終止子。
[0097]根據本發(fā)明的核酸分子是用于本發(fā)明的表達盒。
[0098]在優(yōu)選實施方案中，根據本發(fā)明的核酸分子具有如呈現于SEQ ID NO:7中的核苷酸序列。
[0099]所有根據本發(fā)明的重組npMDV、核酸分子和重組DNA分子的生成、構建和裝配可以通過眾所周知的分子生物學技術來完成，其涉及克隆、轉染、重組、選擇和擴增。
[0100]這些及其他分子生物學技術在如下述標準教科書中更詳細地說明=SambiOOk和 Russell "‘Molecular cloning:a laboratory manual”(2001, Cold SpringHarbour Laboratory Press ;ISBN:0879695773) ;Ausubel 等人，于:Current Protocolsin Molecular Biology (J.Wiley and Sons Inc, NY,2003, ISBN:047150338X) ；C.Dieffenbach 和 G.Dveksler:“PCR primers:a laboratory manual，，(CSHL Press, ISBN0879696540);和“PCR protocols，，，由:J.Bartlett 和 D.StirlingCHumana press, ISBN:0896036421)。
[0101]為了根據本發(fā)明的核酸分子的方便構建和為了其生成根據本發(fā)明的重組npMDV的用途，核酸自身可以包含在更大的核酸分子中。
[0102]因此，在進一步方面，本發(fā)明涉及包含根據本發(fā)明的核酸分子的重組DNA分子。
[0103]優(yōu)選地，此類根據本發(fā)明的重組DNA分子是常見克隆質粒，例如如來源于pBR322或PUC系列。這些是廣泛商購可得的。
[0104]當根據本發(fā)明的重組DNA分子設置用于在轉染方案中使用時，它通常被稱為‘轉移載體’、‘穿梭載體’或‘供體質?！?。在這種情況下，根據本發(fā)明的核酸分子可以在兩側上由來源于npMDV基因組的序列側接。這些允許同源重組，并且指導插入(在所需定向上)npMDV基因組上的靶遺傳插入基因座。
[0105]或者，根據本發(fā)明的重組DNA分子可以是用于黏粒再生的黏粒構建體。
[0106]通常，在轉染中使用的轉移載體自身不整合到活的重組載體微生物的基因組內，它僅促進它攜帶的表達盒的整合。
[0107]充當用于本發(fā)明的轉移載體的根據本發(fā)明的重組DNA分子的實例是圖4中所示的質粒 p435vec9。[0108]根據本發(fā)明的重組npMDV包含在單個遺傳插入基因座中的根據本發(fā)明的核酸分子。許多插入基因座對于npMDV是已知的，并且原則上這些都適合于在本發(fā)明中使用，只要插入的多價表達盒能夠展示它的穩(wěn)定和有效性質。由于實際原因，某些基因座是優(yōu)選的，例如因為用于構建和分析的必需分子生物學工具是可獲得的。在這點上，對于本發(fā)明，在npMDV基因組的Us區(qū)中的遺傳插入基因座的使用是優(yōu)選的。
[0109]因此，在根據本發(fā)明的重組npMDV的優(yōu)選實施方案中，將異源核酸分子插入重組npMDV的基因組內的Us區(qū)中。
[0110]通過采用npMDV基因組的Us2基因或UslO基因作為用于本發(fā)明的單個遺傳插入基因座，可以制備對于本發(fā)明特別合適和有效的npMDV重組體。
[0111]因此，在根據本發(fā)明的重組npMDV的優(yōu)選實施方案中，將異源核酸分子插入重組npMDV的基因組內的Us2基因或UslO基因中。
[0112]對于本發(fā)明，術語“在Us2基因中”和“在UslO基因中”意在指示插入已在包含Us2或UslO基因的npMDV基因組區(qū)中進行；這可以指這些基因中任一個的啟動子或編碼區(qū)。另外，如所述的，插入的內托作用(netto effect)自身可以是插入、缺失或中性替換。此類插入的期望后果是Us2或UslO基因的正常編碼功能在所得到的重組npMDV中被擾亂。
[0113]根據本發(fā)明的重組npMDV是活的重組載體微生物，或“載體”病毒，其有利地用于家禽接種。在這個效用中，它是安全的，因為即使在超幼齡時應用，它也不引起負面接種反應,例如任何疾病或感染體征,或接種動物的生長或發(fā)育中的降低。進一步地,重組npMDV在細胞培養(yǎng)中(在體外)或在靶動物中(在體內)的復制中是穩(wěn)定的。另外，重組npMDV提供了它攜帶的兩種異源基因的強烈且一致的表達(在體外和在體內):NDV F蛋白基因和經典IBDV VP2基因。最后，通過它在靶動物中的復制和表達，它提供了所表達異源基因對靶免疫系統的有效呈遞。這生成有效的免疫應答，其保護接種的靶動物不受由NDV和IBDV引起的感染和/或疾病。此外，npM·DV重組體提供了針對MDV的免疫保護。
[0114]對于本發(fā)明“穩(wěn)定的”意指根據本發(fā)明的重組npMDV的遺傳構成在后續(xù)病毒復制輪次中不顯著改變；在實踐中，這將意指一種或兩種插入的異源基因的表達喪失。這可以例如方便地用常規(guī)技術進行監(jiān)控，例如通過對根據本發(fā)明的重組npMDV實施在細胞培養(yǎng)中的后續(xù)傳代，隨后為在動物中的傳代。再分離的病毒隨后在細胞培養(yǎng)皿中鋪平板，用瓊脂覆蓋，并且孵育直到蝕斑變得可見；全部使用常規(guī)技術。接下來，在免疫熒光測定(IFA)方案中使用合適的抗體制劑，將蝕斑對F或VP2蛋白的表達染色。記錄不再表達一種或兩種蛋白的蝕斑數目，由此應例如通過UV顯微鏡檢查來監(jiān)控至少100個單獨的蝕斑。
[0115]嚴格穩(wěn)定性測試是應用15次連續(xù)組織培養(yǎng)傳代，隨后接種到靶動物內，以在攻擊-感染實驗中評價剩余效價。
[0116]如技術人員將理解的，在此類密集傳代的情況下，不能保證絕對(100%)穩(wěn)定性，因為始終可以出現一定水平的自然本底突變。這并非顯著不穩(wěn)定性的征兆；事實上，展示優(yōu)于95%遺傳穩(wěn)定性的重組載體病毒原則上適合于疫苗生產和在靶動物中的使用，盡管在目前情況下實現好得多的穩(wěn)定性。
[0117]令人驚訝地發(fā)現在如上所述的嚴格穩(wěn)定性測試中，根據本發(fā)明的重組npMDV在多于95%的再分離蝕斑中維持兩種異源基因的穩(wěn)定表達。事實上，在幾個測試中，僅發(fā)現極低百分比的蝕斑(0%-0.3%)不再表達異源基因之一(實施例5)。另外，當這些傳代的重組npMDV在靶動物中進行測試時，它們仍能夠提供極佳的針對NDV和IBDV感染的免疫保護(實施例6和7)。
[0118]這是相對于用現有技術npMDV重組體和在本發(fā)明的實驗過程中制備且測試的不成功重組體(參見實施例1)發(fā)現的結果的有力改進。此類不成功的重組npMDV通常在轉染后不產生可以擴增多輪的蝕斑，或僅顯示異源蛋白的極弱表達，或在少數幾輪擴增循環(huán)后喪失表達。一些構建體可以在動物中測試時擴增，但不提供免疫應答，因為發(fā)現這些重組npMDV中的大多數在再分離后已喪失表達異源基因(之一)的能力。
[0119]因此，在優(yōu)選實施方案中，根據本發(fā)明的重組npMDV特征在于在細胞培養(yǎng)中15次連續(xù)傳代后，多于95%的所述重組病毒維持兩種異源蛋白的表達。
[0120]在進一步優(yōu)選的實施方案中，多于96、97、98、99、99.5、99.7或100%的重組病毒維持兩種異源蛋白的表達，這是優(yōu)先的次序。
[0121]通過轉染方法例如如上文描述和下文例示的黏粒再生，根據本發(fā)明的核酸分子和/或重組DNA分子可以用于獲得根據本發(fā)明的重組npMDV，其包含在其基因組上的單個遺傳插入基因座中穩(wěn)定整合的根據本發(fā)明的核酸分子。
[0122]因此，本發(fā)明的進一步方面涉及用于制備根據本發(fā)明的重組npMDV的方法，所述方法包括將根據本發(fā)明的核酸分子插入在npMDV的基因組上的單個遺傳插入基因座中。
`[0123]通過使用根據本發(fā)明的重組DNA分子作為轉移載體，可以方便地進行根據本發(fā)明的核酸分子插入npMDV基因組內，以生成根據本發(fā)明的重組npMDV。
[0124]盡管根據本發(fā)明的完整核酸分子直接插入npMDV基因組內是生成根據本發(fā)明的重組npMDV的優(yōu)選方法，但存在其中可以生成此類重組npMDV的其他眾所周知的方法。例如通過在單個或多個輪次轉染中，將根據本發(fā)明的核酸分子的部分插入npMDV內。這些部分可以以這樣的方式設計，使得在所有部分都整合后，全部插入片段形成本發(fā)明的完整表達盒，例如通過采用重疊區(qū)以控制部分的次序和定向。
[0125]如所述的，npMDV通常在原代細胞培養(yǎng)物中擴增，并且所得到的npMDV疫苗可以作為無細胞產品供應，或(在HVT作為親本病毒的情況下)以冷凍干燥形式儲存。然而，并且優(yōu)選地，npMDV疫苗作為細胞結合產品供應，其包含由npMDV感染的收獲的CEF細胞。
[0126]類似地，根據本發(fā)明例如以質粒形式的核酸分子和重組DNA分子通常通過將其引入細菌細胞內進行擴增，所述細菌細胞隨后提供復制和擴增；黏?？梢允褂忙耸删w進行擴增。例如，大腸桿菌(Escherichia coli)細菌的專用實驗室株是通常應用的，并且可廣泛得自商業(yè)供應商。方便地，這些可以作為準備通過常見技術例如電穿孔或熱激引入DNA的感受態(tài)細胞來購買。
[0127]因此，在進一步方面，本發(fā)明涉及包含所有根據本發(fā)明的重組npMDV、核酸分子或重組DNA分子的宿主細胞。
[0128]本發(fā)明的“宿主細胞”優(yōu)選是用于與根據本發(fā)明的核酸或重組DNA分子使用的大腸桿菌細菌細胞。另外，用于本發(fā)明的宿主細胞優(yōu)選是用于與根據本發(fā)明的重組npMDV使用的CEF。
[0129]如所述的，根據本發(fā)明的重組npMDV的有利用途是在用于家禽的疫苗中。
[0130]因此，在進一步方面，本發(fā)明涉及用于家禽的疫苗，其包含兩者均根據本發(fā)明的重組npMDV或宿主細胞、和藥學上可接受的載體。[0131]“疫苗”眾所周知是在藥學上可接受的載體中包含免疫活性化合物的組合物?！懊庖呋钚曰衔铩被颉翱乖笔怯砂忻庖呦到y識別且誘導免疫應答的分子。應答可以源于先天性或獲得性免疫系統，并且可以是細胞和/或體液類型。
[0132]疫苗誘導幫助預防、改善、降低對疾病或病癥的敏感性、或治療疾病或病癥的免疫應答，所述疾病或病癥產生于由微生物的感染。保護作為施用來源于該微生物的至少一種抗原的結果而實現。這將引起靶動物顯示由微生物引起的臨床體征數目或強度中的降低。這可以是通過微生物的侵入、集落形成或感染率降低的結果，導致由微生物或對其的靶應答引起的損害和影響的數目或嚴重性中的降低。
[0133]用于本發(fā)明的術語“家禽”指對用npMDV接種敏感的鳥類的任何物種；優(yōu)選靶物種是雞、火雞和鴨；其中雞是最優(yōu)選物種。
[0134]靶鳥類可以是產蛋者、育種者、組合品種或此類品種中的任何的親本品系。[0135]待接種的家禽的年齡、重量、性別、免疫狀態(tài)及其他參數不是關鍵的，盡管給健康靶接種，并且盡可能早地接種以預防任何野外感染(的后果)是明顯有利的。
[0136]根據本發(fā)明的疫苗優(yōu)選以細胞伴隨的形式應用，由此將由此類重組npMDV感染的宿主細胞接種到靶動物內。
[0137]“藥學上可接受的載體”意在幫助疫苗的穩(wěn)定和施用，而不引起對它對其施用的靶動物的健康的(嚴重)不良反應。此類載體可以例如是無菌水或無菌生理鹽溶液。在更復雜的形式中，載體可以例如是緩沖液，其可以包含進一步的添加劑，例如穩(wěn)定劑或防腐劑。細節(jié)和實例例如在眾所周知的手冊中描述例如:“Remington:the science and practice ofpharmacy”(2000，Lippincott，USA, ISBN:683306472),和！“Veterinary vaccinology，，(P.Pastoret 等人編輯，1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)。
[0138]對于本發(fā)明，當疫苗是基于細胞的時，則載體優(yōu)選是培養(yǎng)基與血清(約10%)和DMSO (約6%)的混合物。血清可以是常規(guī)用于細胞培養(yǎng)的任何血清，例如胎牛血清或新生小牛血清。
[0139]根據本發(fā)明的疫苗通過如本文描述的方法從根據本發(fā)明的活的重組npMDV制備，所述方法可容易地由本領域技術人員應用。例如，根據本發(fā)明的重組npMDV通過轉染和重組進行構建，并且所需重組npMDV如本文描述的進行選擇。接下來，重組npMDV載體病毒以更小或更大體積工業(yè)生產。盡管在宿主動物中的生產是可能的，但在體外培養(yǎng)物例如CEF中的增殖是優(yōu)選的。從此類培養(yǎng)物中收獲作為全細胞或細胞超聲處理物的包含病毒的懸浮液，將這種懸浮液配制成疫苗且將最終產品包裝。在對質量、數量和無菌度的廣泛測試后，此類疫苗產品投放出售。
[0140]適用于疫苗制備的一般技術和考慮是本領域眾所周知的，并且例如在政府法規(guī)(藥典)和手冊例如“Veterinary vaccinology”和“Remington”(兩者同上)中描述。
[0141]根據本發(fā)明的疫苗原則上可以通過不同應用途徑和在其壽命的不同點時給予靶家禽，只要接種的重組npMDV可以建立保護性感染。
[0142]然而，因為由MDV、NDV或IBDV的感染可以已在超幼齡時建立，所以盡可能早地應用根據本發(fā)明的疫苗是有利的。根據本發(fā)明的疫苗優(yōu)選在孵化當天時(“第I天”)或在雞胚中例如在ED18天時應用。在工業(yè)規(guī)模上用于自動注射到蛋內的合適設備是商購可得的。這提供了最早的可能保護，同時使勞力成本降到最低。[0143]因此，在優(yōu)選實施方案中，根據本發(fā)明的疫苗在雞胚中施用。
[0144]不同的雞胚接種途徑是已知的，例如向卵黃囊中、向胚胎中或向尿囊液腔中；這些可以根據需要進行優(yōu)化。優(yōu)選地，雞胚接種進行，使得針實際上接觸胚胎。
[0145]或者，可以應用個別幼鳥的腸胃外接種。這優(yōu)選肌內或皮下應用。
[0146]根據本發(fā)明適合于注射的疫苗制劑是例如懸浮液、溶液、分散液或乳狀液。
[0147]依賴根據本發(fā)明的疫苗的應用途徑，可能需要改變疫苗組合物。這完全在技術人員的能力內，并且一般涉及疫苗功效或安全性的細調。這可以通過下述來完成:改變疫苗劑量、數量、頻率、途徑，通過使用以另一種形式或制劑的疫苗，或通過改變疫苗的其他組成成分(例如穩(wěn)定劑或佐劑)。
[0148]例如，為了適合于在雞胚應用，疫苗組合物需要是非常溫和的，以便不降低蛋的孵化率。然而，即使這樣，仍可以出現孵化率中的一些降低，例如由通過接種自身、感染等對胚胎的機械損害導致。
[0149]除了由根據本發(fā)明的核酸分子提供的遺傳穩(wěn)定性外，通過采用建立的安全npMDV疫苗株，例如HVT疫苗株PBl或FC-126，作為根據本發(fā)明的重組npMDV的親本病毒，還提供了根據本發(fā)明的疫苗的安全性。或者，MDV2疫苗株SB1。所有這些都是一般可獲得的(來自ATCC:VR # 584-C 的 FC-126 ;并且 PBl 和 SBl 由 MSD Animal Health 商業(yè)化)，并且已知適合于接種幼鳥或胚胎。異源核酸的摻入不增加親本npMDV的毒力或致病性(相反)，并且不期望毒力的逆轉，因為npMDV是天然無致病性的。
[0150]疫苗的每動物劑量的根據本發(fā)明的重組npMDV的確切量不是關鍵的，因為它將是用于滅活型疫苗的；因為重組npMDV是活的，所以它將自身復制，并且從而在靶動物中繁殖直到生物學上可以忍受的·病毒血癥水平。原則上，疫苗劑量僅需要足以起始此類產毒性感染。更高的接種物劑量并不縮短在宿主中達到最佳病毒血癥感染花費的時間。因此，極高劑量不是有效的，因為病毒血癥不能高于自然平衡，并且另外，此類極高接種物劑量由于經濟原因而沒有吸引力。
[0151]優(yōu)選的接種物劑量因此是每動物劑量1χ10~2至1χ10~6蝕斑形成單位(pfu)的npMDV載體病毒,更優(yōu)選1χ10~2至lxl0~5 pfu/劑量,甚至更優(yōu)選1χ10~3至lxl0~4 pfu/劑量；最優(yōu)選1500至5000 pfu/劑量。當根據本發(fā)明的疫苗是細胞伴隨時，這些數目的重組npMDV包含在受感染的宿主細胞中。在那種情況下，一個動物劑量包含100-10.000個受感染的宿主細胞，優(yōu)選每劑量100-5000個受感染細胞，更優(yōu)選:每劑量200-2000個受感染細胞。
[0152]計數根據本發(fā)明的重組npMDV的病毒顆粒的方法是眾所周知的。
[0153]根據本發(fā)明的疫苗的免疫有效量的測定完全是技術人員力所能及的，例如通過監(jiān)控在接種后的免疫應答，或在攻擊感染后例如通過病原體的再分離，或通過監(jiān)控疾病的靶臨床體征或血清學參數，并且比較這些與模擬接種動物中可見的應答。
[0154]用于將根據本發(fā)明的疫苗應用于靶生物的給藥方案可以在單個或多個劑量中，所述劑量可以同時或順次給予，以與疫苗制劑相容的方式，以及以此類將是免疫學有效的量。
[0155]根據本發(fā)明的疫苗可以用于預防和/或治療性處理，并且因此干擾感染或其疾病臨床癥狀的建立和/或進展。
[0156]根據本發(fā)明的疫苗可以有效充當引發(fā)接種，其隨后可以跟隨加強接種并且通過加強接種擴大，例如再一次使用相同疫苗，或使用經典滅活且佐劑化的全病毒疫苗。
[0157]用于施用根據本發(fā)明的疫苗的方案理想地整合到其他疫苗的現有接種時間表內。
[0158]優(yōu)選地，根據本發(fā)明的疫苗僅在孵化當天時或在ED第18天時雞胚中應用一次。
[0159]每動物劑量的根據本發(fā)明的重組npMDV的體積可以根據預期應用途徑進行優(yōu)化:雞胚接種通常用0.05-0.5 ml/蛋的體積應用，并且腸胃外注射通常用0.1-1 ml/鳥的體積完成。
[0160]疫苗劑量體積的優(yōu)化完全在技術人員的能力內。
[0161]不言而喻的是將其他化合物例如穩(wěn)定劑、載體、稀釋劑、乳化劑等與根據本發(fā)明的疫苗混合也在本發(fā)明的范圍內。此類添加劑描述于眾所周知的手冊例如^Remington”和“Veterinary Vaccinology”(兩者同上)。
[0162]使用如上所述的適當的制劑、劑量和應用優(yōu)化，根據本發(fā)明的疫苗能夠由于在超幼齡時的單次接種而保護家禽不受MDV、NDV和IBDV。因為npMDV提供持續(xù)性感染，所以提供的保護具有極佳的免疫持續(xù)時間，其良好持續(xù)到在約20-25周齡時的產蛋開始。保護的有效性可以不同方式例如臨床評分、血清學、(組織)病理學等進行評價。
[0163]根據本發(fā)明有效的疫苗是對于NDV和IBDV的‘標記疫苗’，因為它生成的免疫僅針對來自這些病毒的一種蛋白。這允許“區(qū)分受感染和接種的動物”，所謂的DIVA法。這可以方便地通過血清學測定例如ELISA或免疫熒光測定進行檢測。
[0164]除了根據本發(fā)明 的疫苗提供的多價免疫保護(針對NDV和IBDV ;和加上針對MDV)外，通過添加進一步的抗原化合物制備進一步組合是有利的，以便增強已提供的免疫保護或以擴展到其他病原體。原則上，這可以是任何活的或被殺死的微生物或亞單位抗原，只要這不負面干擾根據本發(fā)明的疫苗的安全性、穩(wěn)定性和功效。
[0165]因此，在優(yōu)選實施方案中，根據本發(fā)明的疫苗包含至少一種另外的免疫活性組分。
[0166]此類“另外的一種或多種免疫活性組分”可以是抗原、免疫增強物質、細胞因子和/或疫苗。這提供了在成本、效率和動物福利方面的優(yōu)點?；蛘?，根據本發(fā)明的疫苗自身可以加入疫苗中。
[0167]在更優(yōu)選的實施方案中，至少一種另外的免疫活性組分是對家禽致病性的微生物；微生物自身可以是重組生物，例如表達免疫保護性蛋白?；蛘?，至少一種另外的免疫活性組分是來源于對家禽致病性的微生物的(亞單位)抗原。這可以以任何合適的方式例如‘來源’于微生物提取物或勻漿物，或作為來自重組表達核酸的產物，所述核酸已來源于編碼來自對家禽致病性的微生物的抗原蛋白的區(qū)域。
[0168]另外的微生物優(yōu)選選自下述，和/或另外的抗原優(yōu)選來源于選自下述的微生物:
-病毒:傳染性支氣管炎病毒、NDV、腺病毒、減蛋綜合征病毒、IBDV、雞貧血病毒、禽腦
脊髓炎病毒、禽痘病毒、火雞鼻氣管炎病毒、鴨瘟病毒(鴨病毒性腸炎)、鴿痘病毒、MDV、禽白血病病毒、ILTV、禽肺病毒和呼腸孤病毒；
-細菌；大腸桿菌、沙門氏菌屬(Salmonella)物種、鼻氣管鳥桿菌(Ornitobacteriumrhinotracheale)、副雞嗜血桿菌(Haemophilis paragal I inarum)、多殺巴斯德桿菌(Pasteurella multocida)、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、丹毒種(Erysipelas spec.)、支原體屬(Mycoplasma)物種和梭菌屬(Clostridium)物種；
-寄生蟲:艾美蟲屬(Eimeria)物種；和-真菌:例如曲霉屬(Aspergillus)物種。
[0169]在根據本發(fā)明的疫苗的更優(yōu)選的實施方案中，另外的免疫活性組分選自MDV、NDV和IBDV，或其任何組合。此類另外的組分用于改進且擴展提供的免疫原性。這在其中MDV、NDV或IBDV的超強毒野生株流行的那些情況下或地理區(qū)域中是有利的。
[0170]在這點上，npMDV與MDV1、MDV2或HVT的組合是已知的的；對于本發(fā)明，MDV毒株Rispens (MDV1)、毒株SBl (MDV2)或毒株FC-126或PBl (HVT)優(yōu)選作為另外的免疫活性組分。
[0171]為了改進針對NDV的應答，根據本發(fā)明的重組npMDV可以與NDV疫苗株例如溫和的活NDV疫苗株C2組合。
[0172]類似地，為了改進針對IBDV的應答，根據本發(fā)明的重組npMDV可以與溫和的活IBDV 疫苗株例如 D78、PBG98、Cu-U ST-12 或 89-03 組合。
[0173]如技術人員將理解的，這些‘組合’還包括其中根據本發(fā)明的重組npMDV和另外的免疫活性組分不同時應用的接種時間表；例如重組npMDV可以在雞胚中應用，并且NDV C2和/或IBDV 89-03毒株可以在第一天應用。
[0174]因此，在根據本發(fā)明包含至少一種另外的免疫活性組分的疫苗的更優(yōu)選實施方案中，所述至少一種 另外的免疫活性組分是選自下述疫苗株的微生物:MDV、NDV和IBDV，或其任何組合。
[0175]更優(yōu)選地，另外的免疫活性組分選自:MDV Rispens,MDV SBUNDV C2、IBDV D78和IBDV 89-03。
[0176]組合疫苗可以以多種方式進行制備:通過組合病毒或宿主細胞制劑，或這些的混合物；全部都并入本發(fā)明中。在優(yōu)選實施方案中，此類組合疫苗的組分方便地分開產生，并且隨后組合且裝填到相同的疫苗容器內。
[0177]通過上文描述和下文例示的方法，可以獲得根據本發(fā)明的疫苗。
[0178]因此，本發(fā)明的進一步方面涉及用于制備根據本發(fā)明的疫苗的方法，所述方法包括下述步驟:
-用根據本發(fā)明的重組npMDV感染宿主細胞，
-收獲受感染的宿主細胞，和
-將收獲的受感染的宿主細胞與藥學上可接受的載體混合。
[0179]用于本發(fā)明的合適宿主細胞和藥學上可接受的載體已在上文得到描述。另外，用于感染、培養(yǎng)和收獲的合適方法是本領域眾所周知的，并且在本文中描述且例示。
[0180]如上文詳細概述的，根據本發(fā)明的重組npMDV可以有利地應用于家禽疫苗中，提供針對MDV、NDV和IBDV的安全、穩(wěn)定和有效的接種，其可以在超幼齡時施用于家禽。
[0181]因此，本發(fā)明的進一步方面涉及用于家禽疫苗中的根據本發(fā)明的重組npMDV。
[0182]‘用于疫苗中’的不同方面和實施方案已在上文進行概述，并且包含作為無細胞病毒或作為細胞伴隨的病毒用于用于接種家禽的不同疫苗組合物中。
[0183]因而，本發(fā)明的不同方面和實施方案可以有利地用于產生安全、穩(wěn)定和有效的用于家禽的疫苗。
[0184]因此，在進一步方面，本發(fā)明涉及所有根據本發(fā)明的重組npMDV、核酸分子、重組DNA分子或宿主細胞或其任何組合用于制造用于家禽的疫苗的用途。[0185]如上文描述的，和如下文例示的，根據本發(fā)明的疫苗可以通過在超幼齡時的單次接種，有利地用于在家禽中提供針對許多疾病的安全和有效的免疫保護。
[0186]因此，在進一步方面，本發(fā)明涉及家禽接種的方法，其包括用根據本發(fā)明的疫苗接種所述家禽的步驟。
[0187]關于用根據本發(fā)明的疫苗接種家禽的細節(jié)已在上文描述；具體地，通過一日齡雛雞的肌內接種或皮下接種，以及18日齡胚胎的雞胚中接種。
[0188]本發(fā)明現在將參考下述非限制性實施例進行進一步描述。
實施例
[0189]1.測試的不同表達盒裝配:
(關于所述構建體的圖示參見圖1，并且關于結果概述參見表1)
1.1.HVT-F 和 HVT-VP2:
兩種重組HVT已用單一基因表達盒進行構建；其包含NDV克隆30 F蛋白基因，或來自經典型IBDV毒株Faragher 52/70的VP2基因。兩者使用不同的啟動子:F蛋白基因由勞斯肉瘤病毒LTR啟動子驅動，并且VP2基因由hCMV-1El基因核心啟動子驅動。兩個表達盒均已(通過體外同源重組)引入親株PBl的HVT基因組的UslO基因內。HVT-F重組體與商業(yè)疫苗Innovax ? ND中使用的那種相同。
[0190]兩種重組體關于穩(wěn)定性、病毒血癥和表達均表現良好。
[0191]當這兩種重組HVT 在一次接種中組合；在4周后接種的雞的再分離顯示兩種中的僅一種可以以顯著數目再分離，而另一種為較小量。相互排斥不是總影響同一構建體:有時HVT-F存活，有時HVT-VP2存活。
[0192]體內病毒血癥測定為在接種后二或三周時，取自接種雛雞的血樣中由(重組)HVT感染的外周血淋巴細胞(PBL)百分比。
[0193]體內保護如下測定:NDV保護通過對在用致死劑量的強毒NDV病毒攻擊后的存活雛雞進行評分來測量。IBDV保護通過粘液囊中的淋巴細胞耗竭的組織學測定進行測量；使用的評分系統從對于完全耗竭(無保護)的5運行到對于完全保護(無耗竭)的O。
[0194]1.2.HVP163:
命名為HVP163的重組HVT包含在PBl HVT毒株的UslO中的表達盒，其為HVT-F和HVT-VP2重組體中的兩個盒的組合:IE/VP2啟動子+基因區(qū)段是LTR/F區(qū)段的上游。將轉錄終止子引入F蛋白基因下游，其來源于FHVl的Us/TRs連接部；VP2已具有終止子，SPhCMV-1El基因的終止子。
[0195]這個重組體表現不佳；無法檢測到F蛋白基因的表達。
[0196]1.3.HVP193:
在關于HVP193的表達盒中，通過Nco1-EcoRI限制酶消化將LTR啟動子替換為強啟動子:嵌合雞β-肌動蛋白基因啟動子，其作為長1.34 kb的元件，來源于Genbank登記號AJ575208。
[0197]雖然VP2和F異源蛋白兩者的表達均是明確可檢測的，但與親本PBl株的復制相比較，在體內的復制差。
[0198]這還由使用HVP193的接種攻擊測試的結果反映(在下文關于HVP204的部分中描述)，其中接種HVP193的雛雞僅17%被保護不受致死性NDV攻擊感染。
[0199]1.4.HVP204:
HVT重組HVP204包含超過HVP193的兩種進一步改變:交換VP2和F蛋白基因的相對次序，以及驅動這些基因的啟動子。在所得到的表達盒中，F蛋白基因目前位于VP2基因上游，并且F蛋白基因目前由hCMV-1El基因核心啟動子驅動；下游VP2基因由(嵌合)β -肌動蛋白基因啟動子驅動。用VP2-和F-蛋白特異性抗體的IFA染色證實兩種基因在受感染的CEF單層中的功能表達。病毒血癥水平在接種后(p.1.)15或22天時在接種的雞的PBL中進行測試。結果顯示HVP204的體內復制比HVP193的復制改進很多，但未接近野生型病毒血癥水平。
[0200]在一日齡時接種后三周，使用兩種單獨的HVP204分離物，針對用NDV的致死攻擊或用IBDV的嚴重攻擊，測試體內保護能力。
[0201]通過HVP204的NDV保護是47% ；IBDV保護幾乎是完全的，具有0-0.5的損害得分。
[0202]然而，HVP205重組HVT的遺傳穩(wěn)定性是不足夠的，因為在第10次連續(xù)細胞培養(yǎng)傳代后，高達26%的重組體喪失表達兩種異源基因之一的能力。
[0203]1.5.HVP216:
令人驚訝地發(fā)現對Ch β -肌動蛋白啟動子的重大改變得到這樣的重組HVT，其具有需要的遺傳穩(wěn)定性，同時維持(且甚至改進)其他復制和表達性質。如在HVP193和HVP204中使用的對嵌合雞β_肌動蛋白基因啟動子作出的修改，是內含子的大部分的缺失，所述內含子在這個Chi3-肌動蛋白基因啟動子中位于起始密碼子上游。這可以方便地通過用Eco47III和NaeI的限制酶消化來完成。這導致來自啟動子的內含子的675 bp的缺失(由來自Nco1-EcoRI片段的核苷酸807-1483表示)，所述Nco1-EcoRI片段自身延伸自核苷酸394-1734(均關于Genbank登記號:AJ575208中的質粒)。將所得到的β-肌動蛋白基因啟動子的核心版本用于替換在PBl親株的UslO基因座中在HVP204表達盒內的長版本。
[0204]所得到的重組HVP216具有所需遺傳穩(wěn)定性，以及極佳的復制和表達性質:用VP2-和F-特異性抗體的IFA染色證實來自HVP216病毒的兩種基因的功能表達，所述HVP216病毒已在CEF細胞培養(yǎng)物上細胞傳代多于10次。
[0205]通過HVP216的免疫保護在一系列實驗中進行測試:IBDV攻擊試驗使用在一日齡時(sc)接種和在第21天攻擊的MDA+雛雞。耗竭得分證實PBl不給予保護(得分4.5)，但極佳的IBDV攻擊保護由下述提供:HVT-VP2:1.0 ；HVP204:0 ；HVP216:0和0.5 (兩個平行分離物)。
[0206]NDV攻擊保護在SPF雛雞接種后3或4周時進行測試:PB1提供可忽略不計的保護，而HVP216在接種后(p.V) 4周時保護高達90%的雛雞。
[0207]1.6.HVP309:
HVP309重組HVT再次與HVP216的那些的不同之處在于:使用不同基因組插入基因座用于將HVP216的表 達盒插入HVT親本病毒株FC-126毒株的Us2基因內，由此重組體通過黏粒再生而生成。所得到的重組HVP309顯示在復制、表達、遺傳穩(wěn)定性和接種功效的測試中的極佳結果(參見下文實施例)，如同HVP216 —樣。
[0208]表1:關于測試的不同表達盒的結果概括
【權利要求】
1.重組非致病性馬立克氏病病毒(npMDV)，其包含異源核酸分子，其特征在于所述核酸分子在5’至3’方向上并按該次序包含:
人巨細胞病毒立即早期I基因(hCMV-1El)核心啟動子， k.新城疫病毒(NDV)融合(F)蛋白基因， C1.轉錄終止子， 4.雞肌動蛋白基因核心啟動子， L經典型傳染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒蛋白2 (VP2)基因。
2.核酸分子，其用于構建根據權利要求1的重組npMDV，所述核酸分子在5’至3’方向上并按該次序包含: a^.hCMV-1El核心啟動子， k.NDV F蛋白基因， C1.轉錄終止子， 4.雞肌動蛋白基因核心啟動子， e^.經典型IBDV VP2基因， 轉錄終止子。
3.重組DNA分子，其包含根據權利要求2的核酸分子。
4.根據權利要求1的重組npMDV，其中將所述異源核酸分子插入到所述重組npMDV基因組內的Us區(qū)中。
5.用于制備根據權利要求1的重組npMDV的方法，所述方法包括將根據權利要求2的核酸分子插入到npMDV基因組上的單個遺傳插入基因座內。
6.宿主細胞,其包含根據權利要求1或4中任一項的重組npMDV、根據權利要求2的核酸分子、或根據權利要求3的重組DNA分子。
7.用于家禽的疫苗，其包含根據權利要求1或4中任一項的重組npMDV、或根據權利要求6的宿主細胞、和藥學上可接受的載體。
8.根據權利要求7的疫苗，其包含至少一種另外的免疫活性組分。
9.用于制備根據權利要求7的疫苗的方法，所述方法包括下述步驟: -用根據權利要求1或4中任一項的重組npMDV感染宿主細胞， -收獲所述受感染的宿主細胞，和 -將所述收獲的受感染的宿主細胞與藥學上可接受的載體混合。
10.根據權利要求1或4中任一項的重組npMDV，其用于用于家禽的疫苗。
11.根據權利要求1或4中任一項的重組npMDV、根據權利要求2的核酸分子、根據權利要求3的重組DNA分子、根據權利要求6的宿主細胞或其任何組合用于制造用于家禽的疫苗的用途。
12.家禽接種的方法，其包括用根據權利要求7或8中任一項的疫苗接種所述家禽的步 驟。
【文檔編號】A61K39/12GK103874508SQ201280050862
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年10月19日 優(yōu)先權日:2011年10月21日
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