納米顆粒腫瘤疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于哺乳動物受試者中的腫瘤的預防性或治療性處理的疫苗，以及使用所述疫苗的方法，該方法包括處理腫瘤和產(chǎn)生CTL應答。所述疫苗包含多個納米顆粒和藥學可接受的載體、鹽或稀釋劑。所述納米顆粒包含包含金屬和/或半導體原子的核心；以及包含共價連接至核心的多個配體的冠，其中所述多個中的至少第一配體包含經(jīng)由第一接頭共價連接至核心的碳水化合物部分，并且其中所述多個中的至少第二配體包含經(jīng)由第二接頭共價連接至核心的表位肽。第二接頭包含肽部分和非肽部分，其中所述第二接頭的所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中：X1為選自A和G的氨基酸；X2為選自A和G的氨基酸；且Z1為選自Y和F的氨基酸，并且其中所述表位肽形成腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的至少一部分或者來自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。
【專利說明】納米顆粒腫瘤疫苗
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于基于肽的疫苗方案中的物質(zhì)和組合物，特別是為了刺激T細胞應答的肽的納米顆粒-介導的遞送。疫苗方案針對腫瘤例如肺癌腫瘤的治療性和預防性處理。
[0002]發(fā)明背景
[0003]細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是特化的T細胞，其主要通過識別和殺死癌細胞或感染的細胞發(fā)揮功能，但也通過分泌稱為細胞因子的、能夠調(diào)解對免疫系統(tǒng)的多種影響的可溶性分子發(fā)揮功能。有證據(jù)暗示旨在刺激腫瘤特異性CTL應答的免疫療法將有效地控制癌癥。例如，已經(jīng)表明人CTL 識別肉瘤(Slovin,S.F.et al.,J.1mmunol., 137:3042-3048, (1987)),腎細胞癌(Schendel, D.J.et al.，J.1mmunol.，151: 4209-4220，(1993))，大腸癌(Jacob，L.et al., Int.J.Cancer, 71:325-332, (1997)),卵巢癌(1annides, C.G.et al., J.1mmunol., 146:1700-1707, (1991))(Peoples, G.E.et al., Surgery, 114:227-234, (1993)),膜腺癌(Peiper，M.et al., Eur.J.1mmunol., 27: 1115-1123, (1997) ；ffolfel, T.et al., Int.J.Cancer, 54:636-644, (1993)),頭頸部的鱗狀腫瘤(Yasumura, S.et al., CancerRes.,53:1461-1468, (1993)),和肺的鱗癌(Slingluff, C.L.Jr et al., CancerRes.，54:2731-2737，(1994) ；Yoshino, 1.et al., Cancer Res.，54:3387-3390，(1994))。對人類腫瘤反應性CTL的最大數(shù)量的報道與癌癥相關(guān)。(Boon，T.et al.,Ann.Rev.Tmmunol., 12:337-365，(1994))。腫瘤特異性 CTL 在人(Rosenberg, S.A.et al., N.Engl.J.Med.，319:1676-1680，(1988))和動物模型(Celluzzi, C.M.et al., J.Exp.Med.，183: 283-287，(1996) ；Mayordomo, J.1.et al., Nat.Med., 1:1297-1302, (1995)；Zitvogel, L.et al., J.Exp.Med., 183:87-97, (1996))中調(diào)節(jié)腫瘤消退的能力，暗示針對增加CTL活性的方法很可能對腫瘤處理具有有益影響。
[0004]為了使CTL殺死癌細胞或響應于癌細胞而分泌細胞因子，所述CTL必須首先識別該細胞正在癌變。這個過程包括位于CTL的表面上的T細胞受體與位于癌細胞表面上的統(tǒng)稱為MHC-肽復合物的相互作用。MHC (主要組織相容性復合體)編碼的分子已經(jīng)被細分為兩類，并且被稱為I類和II類MHC編碼的分子。在人的免疫系統(tǒng)中，MHC分子被稱為人30白細胞抗原(HLA)。在MHC中位于染色體6上的是編碼MHC I類分子的三種不同的基因座。在這些基因座被編碼的MHC分子稱為HLA-A、HLA-B和HLA-C。能夠在每個這些基因座上被編碼的基因是極其多態(tài)的，因此群體中的不同個體在他們的細胞表面上表達不同的MHC I類分子。HLA-Al、HLA-A2、HLA-A3、HLA-B7和HLA-B8是可以從這些基因座表達的不同的MHCI類分子的例子。本公開包括與HLA-A1、HLAA2或HLA-All分子、HLA-Al超型、HLA-A2超型和HLA-All超型關(guān)聯(lián)的肽。超型是呈遞至少一個共同表位的一組HLA分子。本公開包括與HLA分子關(guān)聯(lián)的肽，且包括與衍生這些肽的基因和蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)的肽。
[0005] 與MHC分子關(guān)聯(lián)的肽既可以來自于細胞中制造的蛋白質(zhì)，在這種情況下，它們通常與 MHC I 類分子關(guān)聯(lián)(Rock, K.L.and Golde, U.，Ann.Rev.1mmunol.，17:739-779，(1999))，也可以來自于從細胞外獲得的蛋白質(zhì)，在這種情況下，它們通常與MHC II類分子關(guān)聯(lián)(Watts, C.，Ann.Rev.1mmunol.，15:821-850，(1997))。喚起癌癥特異性 CTL 應答的肽最通常與MHC I類分子關(guān)聯(lián)。與MHC I類分子關(guān)聯(lián)的肽長度通常為9個氨基酸，但可以由8個氨基酸的最小長度到14個氨基酸的最大長度之間變化。MHC I類分子與其相結(jié)合的肽，或者MHC II類分子與其相結(jié)合的肽稱作MHC-肽復合物。
[0006]完整的蛋白質(zhì)被降解成肽的過程稱作抗原加工。抗原加工的兩條主要通路發(fā)生于細胞內(nèi)(Rock, K.L.and Golde, U., Ann.Rev.Tmmunol., 17:739-779，(1999) ；ffatts, C., Ann.Rev.1mmunol.，15:821-850, (1997))。一條通路，其主要局限于抗原呈遞細胞例如樹突狀細胞、巨噬細胞和B細胞的細胞中，所述通路降解通常吞噬或內(nèi)吞進細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。來自于這條通路的肽通常與MHC II類分子結(jié)合。抗原加工的第二條通路存在于體內(nèi)基本上所有的細胞。這條第二通路主要降解制造于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，并且來自于這條通路的肽主要與MHCI類分子結(jié)合。本文所指的 正是來自抗原加工的第二通路的肽。通過后一條通路的抗原加工包括細胞質(zhì)中的多肽合成和蛋白水解作用。生產(chǎn)的肽接著被轉(zhuǎn)運至細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，與新合成的MHC I類分子關(guān)聯(lián)，所得到的MHC-肽復合物接著被轉(zhuǎn)運至細胞表面。來自于膜和分泌蛋白質(zhì)的肽也可以與MHC I類分子關(guān)聯(lián)。在一些情況下，這些肽對應于由信號肽酶切割自蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的信號序列。在其他情況下，認為膜的一些級分和分泌的蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，在那里加工隨后發(fā)生。
[0007]—旦結(jié)合至MHC I類分子并呈現(xiàn)于細胞表面上，所述肽被CTL上的抗原特異性受體識別。如果抗原肽不與MHC I類分子相結(jié)合，僅僅表達MHC I類分子本身不足以觸發(fā)CTL以殺死靶細胞。已經(jīng)開發(fā)了幾種方法以鑒定被CTL識別的肽，每種方法依靠CTL識別和只殺死那些表達肽與其結(jié)合的適當?shù)腗HC I類分子的能力(Rosenberg, S.A., Immunity, 10:281-287, (1999))。這樣的肽可以來自非自源，例如病原體(如在細胞被細菌或病毒感染后)或者來自于細胞內(nèi)自我衍生的蛋白質(zhì)，例如癌細胞。癌細胞中自我衍生的蛋白質(zhì)的來源的例子已被回顧(Gilboa, E.，Immunity, 11:263-270，(1999)；Rosenberg, S.A., Immunity, 10:281-287，(1999))并包括:(i)突變基因；(ii)異常表達的基因例如一種備選的開放讀碼框架或通過內(nèi)含子-外顯子邊界；(iii)選擇性地只在腫瘤和睪丸中表達的正?；?'及(iv)在腫瘤和正常細胞相應物中表達的正常的分化基因。
[0008]Oberg et al., 2011, European Journal of Cell Biology, Vol.90, pp.582-592,描述了通過Toll-樣受體(TLR)配體對T細胞活化的調(diào)控。McKee et al., 2005, Journalof Translational Medicine, Vol.3, p.35,回顧了與T細胞的親和力和腫瘤的識別相關(guān)的影響和治療方案。
[0009]W02011/025572描述了用于癌癥的預防、處理和診斷的誘導CTL的免疫原。
[0010]用于處理腫瘤的基于肽的疫苗療法的設計和開發(fā)的顯著挑戰(zhàn)，是含表位的肽經(jīng)由抗原加工機制的遞送，從而使得所述肽被呈遞結(jié)合至MHCI類分子并由此刺激CTL應答。經(jīng)常的情況是，為了誘導有效的免疫應答，一種或多種佐劑的施用是必要的。許多佐劑被認為毒性太大，例如不適和人類使用。
[0011 ] 雖然許多產(chǎn)品已被開發(fā)用于癌癥的處理，但對與已知的物質(zhì)相比具有改進的特性的物質(zhì)仍有高需求。特別是在免疫接種領(lǐng)域，有必要提供高免疫原性、容易再現(xiàn)并高效的但不引起嚴重副作用的產(chǎn)品。
[0012]W02006/037979描述了包含抗原和佐劑的納米顆粒，及免疫原性結(jié)構(gòu)。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由特定接頭結(jié)合至納米顆粒的肽展現(xiàn)出被抗原呈遞細胞(APC)內(nèi)化和加工的能力，從而使得所述肽結(jié)合至MHC并誘導CTL應答。特別是，經(jīng)由納米顆粒遞送的腫瘤抗原相關(guān)的(TAA)肽能夠刺激高親和力的腫瘤特異性CTL應答，即使在不存在佐劑的情況下。
[0015]相應地，在第一個方面本發(fā)明提供了用于哺乳動物受試者中癌癥的預防性或治療性處理的疫苗，所述疫苗包含多個納米顆粒和藥學可接受的載體、鹽或稀釋劑，所述納米顆粒中的至少一種包含:
[0016](i)包含金屬和/或半導體原子的核心；
[0017](ii)包含共價連接至所述核心的多個配體的冠，其中所述多個中的至少第一配體包含經(jīng)由第一接頭共價連接至所述核心的碳水化合物部分或其中所述多個中的所述第一配體包含谷胱甘肽，并且其中所述多個中的至少第二配體包含經(jīng)由第二接頭共價連接至所述核心的表位肽，所述第二接頭包含:
[0018]肽部分和非肽部分，其中所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中:
[0019]X1為選自A和G的氨基酸；
[0020]X2為選自A和G的氨基酸；和
[0021]Z1為選自Y和F的氨基酸。
[0022]并且其中所述表位肽形成腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的至少一部分或來自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。
[0023]在依照本發(fā)明的一些情況下，第二接頭的非肽部分包含C2-C15烷基和/或C2-C15
二醇，例如乙硫酯基團或硫丙基團。
[0024]在依照本發(fā)明的一些情況下，第一配體和/或所述第二配體經(jīng)由含硫基團、含氨基的基團、含磷酸基團或含氧基團共價連接至核心。
[0025]所述第二接頭的所述肽部分包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成:(i)AAY ;和(ii)FLAAY(SEQ ID N0:91)。在特定情況下，所述第二接頭選自:
[0026](i) HS- (CH2) 2-C0NH-AAY ；
[0027](ii)HS-(CH2)2-C0NH-FLAAY ；
[0028](iii)HS-(CH2)3-CONH-AAY ；
[0029](iv) HS- (CH2) 3-CONH-FLAAY ；
[0030](V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAY ；和[0031 ] (vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2)「CONH-FLAAY，
[0032]其中所述第二接頭經(jīng)由所述接頭的非肽部分的硫醇基團共價連接至所述核心。
[0033]優(yōu)選地，所述表位肽經(jīng)由其N-末端連接至所述第二接頭的所述肽部分。因此，所述第二配體可以選自:
[0034](i) HS-(Ch2)2-CONh-AAYZ2 ；
[0035](ii)HS-(CH2)2-C0NH-FLAAYZ2 ；
[0036](iii)HS-(CH2)3-C0NH-AAYZ2 ；[0037](iv) HS- (CH2) 3-C0NH-FLAAYZ2 ；
[0038](v) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAYZ2 ;和
[0039](vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAYZ2，
[0040]其中Z2代表所述表位肽。
[0041]優(yōu)選地，所述表位肽與主要組織相容性復合體(MHC)I類分子結(jié)合，或者能夠經(jīng)過加工從而與MHC I類分子結(jié)合。
[0042]所述表位肽由8至40個氨基酸殘基的序列組成，例如8至12個氨基酸殘基的序列。所述表位肽能夠被MHC I類分子呈遞從而刺激細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。
[0043]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述TAA是肺癌抗原。所述肺癌可以選自:小細胞肺癌、非小細胞 肺癌和腺癌。
[0044]所述表位肽在一些情況下可以包含選自SEQ ID NO:1至86的氨基酸序列或由選自SEQ ID NO:1至86的氨基酸序列組成。這些表位肽在W02011/025572中詳加描述，其全部內(nèi)容明確通過引用合并入本文。特別地，所述表位肽可以包含選自以下的氨基酸序列和由選自以下的氨基酸序列組成:
[0045]VLVPVLVMV(SEQ ID NO:82)；
[0046]KIYQffINEL(SEQ ID NO:29)；
[0047]KLGEFAKVLEL(SEQ ID NO:33)；
[0048]GMYGKIAVMEL(SEQ ID NO:19)；
[0049]KLIPFLEKL (SEQ ID NO:34);和
[0050]RLLEVPVML(SEQ ID NO:67).[0051]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述第一配體的碳水化合物部分包含單糖和/或二糖。特別地，所述碳水化合物部分可以包含葡萄糖、甘露糖、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。
[0052]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述多個配體包含選自下述的一個或多個配體:葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽，另外還包含所述表位肽的一個或多個配體。
[0053]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述多個配體包含:
[0054](a)葡萄糖；
[0055](b)N-乙酰氨基葡萄糖；
[0056](c)谷胱甘肽；
[0057](d)葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖；
[0058](e)葡萄糖和谷胱甘肽；
[0059](f) N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽；或
[0060](g)葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽，
[0061 ] 除了所述配體包含一種表位肽。
[0062]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述第一接頭包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇。特別地，所述第一配體包含經(jīng)由硫醇硫原子共價附著至核心的2’-硫乙基-β -D-吡喃葡萄糖苷或2’ -硫乙基-a -D-吡喃葡萄糖苷。
[0063]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述納米顆粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50種含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體。[0064]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述納米顆粒包含至少1、至少2、至少3、至少4或至少5種含表位肽的配體。
[0065]在依照本發(fā)明的在一些情況下，含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體與含表位肽的配體的摩爾比的范圍為5:1至100:1，例如的范圍為10:1至30:1。
[0066]所述納米顆粒的核心的直徑的范圍為Inm至5nm。所述納米顆粒包括其配體的直徑的范圍為5nm至20nm,任選地5nm至15nm或8nm至10nm。
[0067]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述至少一種納米顆粒包含至少兩種含表位肽的配體，并且其中至 少兩種含表位肽的配體各自的表位肽不同。所述至少兩種含表位肽的配體的表位肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自來自不同的肺癌TAA。
[0068]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述疫苗包含具有第一含表位肽的配體的第一種類的所述納米顆粒和具有第二含表位肽的配體的第二種類的所述納米顆粒，其中所述第一和第二種類的表位肽不同。特別地，所述第一和第二種類的納米顆粒各自的表位肽可以形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自來自不同的肺癌TAA。
[0069]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述疫苗可以包含至少3個、至少4個、至少5個或至少10個不同種類的納米顆粒的合并庫，各種類具有不同的表位肽。
[0070]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述疫苗可以進一步包含至少一種佐劑。所述佐劑可以共價附著至至少一種納米顆粒的核心。所述佐劑可以包含(S)-(2，3-雙(棕櫚酰氧基)_(2RS)_丙基)-N-棕櫚?；?(R)-半胱氨酸-(S)-絲氨酸(S)-賴氨酸
4-OH( “Pam3Cys”)。
[0071]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述疫苗基本上不含佐劑或由納米顆粒提供唯一的佐劑功效。
[0072]在進一步方面，本發(fā)明提供了依照本發(fā)明的第一個方面所定義的疫苗，其在藥物中使用。所述疫苗可用于在哺乳動物受試者(如人受試者)中癌癥例如肺癌的處理的預防性或治療性方法中使用。
[0073]在進一步方面，本發(fā)明提供了前述權(quán)利要求中任一項所定義的疫苗在制備用于預防性或治療性處理哺乳動物受試者中的癌癥例如肺癌的藥物中的用途。
[0074]本發(fā)明的疫苗可以用于經(jīng)由淋巴攝取的施用
[0075]在進一步方面，本發(fā)明提供了預防性或治療性處理癌癥(例如肺癌)的方法，其包含對有此需要的受試者施用預防或治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的疫苗。
[0076]在進一步方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答的體外或體內(nèi)方法，其包含:
[0077](i)使至少一種抗原呈遞細胞(APC)與根據(jù)本發(fā)明的第一個方面所定義的疫苗接觸，從而使得所述表位肽被呈遞到所述APC的MHC I類分子上；和
[0078](ii)使所述至少一個(i)中的APC與至少一個CTL細胞接觸，從而使得所述CTL細胞由所述APC激活以產(chǎn)生對所述表位肽特異性的CTL應答。
[0079]所述APC可以在所述疫苗存在下進行培養(yǎng)，并且同時或相繼地，與所述CTL細胞共培養(yǎng)。在一些情況下，所述APC在與疫苗接觸后、與所述CTL細胞共培養(yǎng)前接受洗滌步驟。所述方法可以進一步包含對哺乳動物受試者施用CTL細胞。
[0080]在依照本發(fā)明的這一方面的方法的一些情況下，所述至少一個CTL細胞對于包含呈現(xiàn)在MHC I類分子上的所述表位肽的MHC-肽復合物展現(xiàn)出更高的親和力，其中所述更高的親和力與對于由APC所激活的CTL細胞所展現(xiàn)的MHC-肽復合物的親和力相比更高，所述APC已經(jīng)與不連接至納米顆粒的游離肽形式的相同的表位肽接觸。
[0081]本發(fā)明包括所述方面和優(yōu)選特征的組合，除了其中此類組合明顯不允許或陳述為特別避免之外。本發(fā)明的這些和進一步方面和實施方案在下文且就伴隨實施例和附圖而言進一步詳細描述。
[0082]附圖簡述
[0083]圖1顯示了來自GNP的SIINFEKL(SEQ ID NO:87)呈遞:將LKb細胞接種到24孔板中，并使其附著過夜。接著，GNP被脈沖到lug/mL (綠色)、0.lug/mL (藍色)或0.01ug/mL (紅色)當量的肽。兩小時后,洗滌細胞,并用25.Dl.16 (Angel)的抗體標簽而進行(A-D)流式細胞儀，或(E)結(jié)合B3Z CTL過夜共培養(yǎng)。第二天，裂解細胞并測量半乳糖苷酶的活性。
[0084]圖2 =GNP呈遞對比游離肽呈遞:(A-B) GNP8和9用S^hadex柱分離成15個級分，接著用UV吸收就蛋白質(zhì)水平對其分析。圖2Α中的紅線(用圓圈表示)僅代表游離肽。(C-H)以標注濃度的標注的GNP或相應的游離肽脈沖LKb細胞2小時(lug/mL肽(綠色)、0.lug/mL(藍色)或0.01ug/mL(紅色))。用(C-F)流式細胞儀或(G-H)B3Z測定法讀數(shù)。(1-N)以標注的游離肽在冰上(1-K)或在37°C (L-N)脈沖LKb2小時。接著，用流式細胞儀就SIINFEKL(SEQ ID NO:87)的呈遞分析細胞。直方圖的紅色部分代表對比非脈沖細胞的陽性染色。
[0085]圖3:來自缺乏游 離肽的制備物的GNP呈遞:(A-B) GNP8和9的新制備物用Sephadex G_50柱分離成15個級分,接著用UV吸收就蛋白質(zhì)水平對其分析。箭頭指示哪些級分合并以供進一步使用。(C_E，F(xiàn))以標注濃度(lug/mL肽(綠色)或0.lug/mL (紅色))的標注的GNP先前制備物(舊GNP)或來自(A和B)的較新制備物(新GNP)脈沖LKb細胞2小時。用(C-E)流式細胞儀或(F)B3Z測定法讀數(shù)。
[0086]圖4:顯示了由每百萬脾細胞的IFN-Y生產(chǎn)細胞的數(shù)量來測量的，對用GNP并用個體肺癌抗原免疫的HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的CTL應答。
[0087]圖5:顯示了由每百萬脾細胞的IFN-Y生產(chǎn)細胞的數(shù)量來測量的，對用合并的GNP并用三種不同的肺癌抗原免疫的HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的CTL應答。
[0088]圖6:顯示用合并的GNP并用六種不同的肺癌抗原刺激后的每105人PBMC的IFN- Y生產(chǎn)細胞的數(shù)量，與混合的游離肽對照組對比。
[0089]圖7: (A-B)顯示了 IFN-YELISpot測定法結(jié)果，在所述測定法中肺癌抗原(KIY、KLG、GMY)在NP中用Glc、GlcNAc, GSH冠測試在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的體內(nèi)CTL的活化。NP中合并的三種肺肽(KIY、KLG、GMY)連同Glc、GlcNAc, GSH冠或游離合并肽+montanide用來免疫小鼠。3次免疫后，取自經(jīng)免疫的小鼠的脾細胞與各種靶細胞(T2-空HLA-A2+細胞、N肺-HLA-A2+正常肺、HLA-A2+肺腫瘤細胞-H522、5865、5944)混合以在ELISpot測定法中測量IFN- Y分泌。
[0090]圖8:(A_D)顯示了脾細胞中響應于裝載肽的T2細胞以及肺腫瘤細胞，關(guān)于(A)葡萄糖NP、(B)GlcNAc NP、(C)GSH NP和(D)游離肽+佐劑的抗原特異性CTL脫粒標記物CD107a 分析。[0091]發(fā)明詳述
[0092]在描述本發(fā)明中，將采用下述術(shù)語并且意在如下所示定義。
[0093]如本文使用的，“納米顆?！敝妇哂屑{米級別的顆粒，并且不意于表達任何特別形狀限制。特別地，“納米顆粒”包含納米球、納米管、納米盒、納米簇、納米棒等。在特定實施方案中，本文考慮的納米顆粒和/或納米顆粒核心一般具有多面體或球體幾何學。
[0094]包含多個含碳水化合物的配體的納米顆粒已在例如W02002/032404、W02004/108165, W02005/116226, W02006/037979, W02007/015105, W02007/122388,W02005/091704(其各自的完整內(nèi)容特別通過引用合并入本文)中描述，并且此類納米顆?？梢砸勒毡景l(fā)明使用。此外，包含由有機化合物官能化(例如經(jīng)由硫醇-金鍵)的氧化鐵鐵氧體(具有式XFe2O4，其中X = Fe,Mn或Co)的磁核心的金涂布納米顆粒在EP2305310 (其完整內(nèi)容特別通過引用合并入本文)中描述，并且特別考慮作為納米顆粒/納米顆粒核心依照本發(fā)明使用。
[0095]如本文使用的，“冠”指層或涂層，其可以部分或完全覆蓋納米顆粒核心的暴露表面。冠包括多個配體，其包括至少一個碳水化合物部分、一個表面活性劑部分和/或一個谷胱甘肽部分。因此，冠可以視為圍繞或部分圍繞金屬性核心的有機層。在特定實施方案中，冠提供和/或參與納米顆粒的核心的鈍化。因此，在特定情況下，冠可以包括基本上穩(wěn)定化含金屬核心的足夠完全的涂布層。然而，本文特別考慮具有核心的特定納米顆粒，例如那些包括由貴金屬涂布的含金屬氧化物的內(nèi)核心的，其可以包括僅部分涂布核心表面的冠。在特定情況下，冠促進本發(fā)明的納米顆粒的溶解性，如水溶性。
[0096]納米顆粒
[0097]納米顆粒是例如金屬或半導體原子的簇的小顆粒，其可以用作固定化配體的底物。
[0098]優(yōu)選地，所述納米顆粒具有的核心具有0.5-50nm之間的平均直徑，更優(yōu)選0.5-10nm之間，更優(yōu)選0.5_5nm之間，還更優(yōu)選0.5_3nm之間且仍然更優(yōu)選0.5-2.5nm之間。除核心之外還考慮配體時，優(yōu)選地所述顆粒的總平均直徑在5.0-1OOnm之間，更優(yōu)選
5-50nm之間且最優(yōu)選5-10nm之間。平均直徑可以使用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)例如透射電子
顯微鏡測量。
[0099]核心材料可以是金屬或半導體且可以由多于一種類型的原子形成。優(yōu)選地，所述核心材料是選自Au、Fe或Cu的金屬。納米顆粒核心也可由包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd的合金形成,并且可以在本發(fā)明中使用。優(yōu)選的核心材料是Au和Fe，而最優(yōu)選的金屬為Au。納米顆粒的核心優(yōu)選地包含約100 - 500個的原子(例如金原子)以提供在納米范圍內(nèi)的核心直徑。其他特別有用的核心材料摻入一種或多種NMR活性的原子，其允許使用NMR在體外和體內(nèi)檢測所述納米顆粒。NMR活性原子的例子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和鑭系元素+3，或本申請別處所描述的量子點。
[0100] 包含半導體原子的納米顆粒核心可被檢測為能夠充當量子點的納米級別的半導體晶體，即它們可以吸收光從而激發(fā)材料中的電子至更高的能量水平，隨后在材料的頻率特性釋放光的光子。半導體核心材料的一個例子是硒化鎘、硫化鎘和碲化鎘。另外還包括鋅化合物，如硫化鋅。[0101]在一些實施方案中，所述納米顆粒的核心可以是磁性的和包含磁性金屬原子，任選地與鈍態(tài)金屬原子組合。舉例為證，所述鈍態(tài)金屬可以是金、鉬、銀或銅，所述磁性金屬可以是鐵或釓。在優(yōu)選的實施方案中，鈍態(tài)金屬是金而磁性金屬是鐵。在這種情況下，方便起見核心中鈍態(tài)金屬原子與磁性金屬原子的比例在約5:0.1-約2:5之間。更優(yōu)選地，該比例在約5:0.1-約5:1之間。如本文使用的，術(shù)語“鈍態(tài)金屬”指不顯示磁性質(zhì)并且對氧化化學穩(wěn)定的金屬。鈍態(tài)金屬可以是反磁性或超順磁性。優(yōu)選地，此類納米顆粒是超順磁性的。
[0102]具有包含順磁性金屬的核心的納米顆粒的例子包括包含Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和鑭系元素+3的那些。
[0103]其他磁性納米顆?？捎衫鏜nFe (尖晶石鐵素體)的金屬形成或者CoFe (鈷鐵素體)可以形成納米顆粒(磁性流體，其加入或不加入以上定義的核心材料)。用于制造此類納米顆粒的自組裝附著化學的例子在Biotechnol.Prog., 19:1095-100 (2003)、J.Am.Chem.Soc.125:9828-33(2003)和 J.Colloid Interface Sc1.255:293-8 (2002)中給出。
[0104]在一些實施方案中，所述納米顆粒或其配體包含可檢測標簽。該標簽可以是納米顆?；蚺潴w的核心的元素。該標簽可被檢測，是因為納米顆粒的那個元素的固有屬性或可通過與其他可被檢測的部分連接、綴合或關(guān)聯(lián)。標簽的優(yōu)選例子包括的標簽為:熒光基團、放射性核心素、磁性標簽或染料。熒光基團包括熒光素、若丹明或四甲基若丹明、德克薩斯-紅、Cy3、Cy5等，并且可以使用拉曼散射光譜法通過熒光標簽的激發(fā)和發(fā)射光的檢測來檢測(Y.C.Cao, R.Jin, C.A.Mirkin, Science2002, 297:1536-1539)。
[0105]在一些實施方案中，納米顆?？梢园跈z測納米顆粒中使用的放射性核心素，其使用由該放射性核 心素發(fā)射的放射性活度，例如通過使用PET、SPECT、或用于療法，例如用于殺死靶細胞?？扇菀椎剡m應在本發(fā)明中使用的本領(lǐng)域中常用的放射性核心素例子包括"mTc，其存在多種氧化態(tài)，盡管最穩(wěn)定的是TcO4- ；32P或33P ；57Co ；59Fe ;通常用作Cu2+鹽的67Cu ;常用作Ga3+鹽的67Ga,例如檸檬酸鎵；68Ge ；82Sr ；"Mo ； 103Pd ;一般用作In3+鹽的111In ；一般用作碘化鈉的125I或131I ； 137Cs ； 153Gd ； 153Sm ； 158Au ； 186Re ;一般用作Tl.鹽例如氯化鉈的201Tl ；39Y3+ ；71Lu3+ ;和24&2+。放射性核心素作為標簽和示蹤物的一般用途是本領(lǐng)域熟知的且技術(shù)人員可容易地使其適應在本發(fā)明的各方面中使用。所述放射性核心素可以這樣最容易地采用，即通過摻入所述納米顆粒核心或?qū)⑺鼈儼ㄔ谧鳛楣潭ɑ诩{米顆粒上的配體的部分而存在的標簽。
[0106]另外地或備選地，本發(fā)明的納米顆粒，或它們與其他種類相互作用的結(jié)果可使用許多本領(lǐng)域公知的技術(shù)來檢測，所述技術(shù)使用上述與納米顆粒相關(guān)聯(lián)的標簽或通過采用它們的屬性。檢測納米顆粒的這些方法的范圍可以從檢測納米顆粒結(jié)合到其他種類時導致的聚集，例如通過簡單的目視檢查或通過使用光散射(含納米顆粒溶液的透射率)，到使用復雜的技術(shù)如透射電子顯微鏡(TEM)或原子力顯微鏡(AFM)以可視化所述納米顆粒。檢測金屬顆粒的進一步方法是采用等離子共振，該等離子共振是在金屬表面上電子的激發(fā)，其通常由光輻射引起。表面等離子共振(SPR)的現(xiàn)象存在于金屬(例如Ag或Au)與介電材料例如空氣或水的界面。與固定化在納米顆粒表面上的配體結(jié)合的分析物改變所述界面的折射率時，發(fā)生SPR中的變化。SPR的進一步優(yōu)點是它可以用于監(jiān)測實時相互作用。如上所述，如果納米顆粒包括或摻入有NMR活性的原子，那么此項技術(shù)可以在體外或體內(nèi)檢測顆粒時使用，其中使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)。對納米顆粒的檢測也可以使用基于定量信號放大的系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用納米顆粒促進的對銀的還原(I)。如果所述納米顆粒包括作為熒光探針的配體，則可使用熒光光譜法。同樣，對碳水化合物的同位素標簽可以用來方便它們的檢測。
[0107]施用和處理
[0108]本發(fā)明的含納米顆粒的疫苗組合物可以通過任意數(shù)量的不同途徑施用于患者，其包括腸內(nèi)或腸胃外途徑。腸胃外施用包括通過下述途徑的施用:靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、鼻、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)上皮、腹膜內(nèi)和局部(包括皮膚、眼、直腸、鼻、吸入和氣霧劑)，以及直腸全身性途徑。
[0109]施用的執(zhí)行通過例如注射或沖擊地使用遞送槍以加速它們的透皮通道穿過表皮的外層。所述納米顆粒接著可以被例如樹突狀細胞攝取，所述納米顆粒當它們通過淋巴系統(tǒng)遷移時成熟，導致對免疫應答的調(diào)節(jié)和針對表位肽和/或表位肽來自其中或形成其一部分的抗原的免疫接種。納米顆粒也可以以氣霧劑遞送。納米顆粒的小粒度使其成為可能。
[0110]本發(fā)明的納米顆粒的超小尺寸對于遞送至細胞和組織中是很大的優(yōu)勢，因為它們即使當連接至靶向或治療性分子時仍可以被細胞攝取。因此，納米顆粒可被APC內(nèi)化，表位肽被加工和經(jīng)由MHC I類被呈遞。
[0111]本發(fā)明的納米顆?？杀慌渲瞥煽赡苁枪腆w或液體組合物形式的藥物組合物。此種組合物將通常包含某種形式的載體，例如固體載體如明膠或佐劑或惰性稀釋劑，或者液體載體如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。可以包括生理鹽水溶液、或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此種組合物和制備物通常含有至少0.lwt%的化合物。
[0112]對于靜脈內(nèi)，皮膚或皮下注射，或者注射在痛苦部位，活性成分將以不經(jīng)腸道的可接受的水溶液的形式，其是無熱原的并且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員完全能夠使用例如所述化合物或其衍生物的溶液以制備合適的溶液，例如在生理鹽水中，以甘油、液體聚乙二醇或油制備的分散物。
[0113]除了一種或多種化合物，任選地與其他活性成分組合，所述組合物可以包含一種或多種藥學可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑，等滲劑、防腐劑或抗氧化劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他材料。此種材料應該是無毒的，并且不應與活性成分的功效干涉。所述載體或其他材料的確切性質(zhì)可取決于施用的途徑，例如口服或不經(jīng)腸道。
[0114]液體藥學組合物通常配制成具有在約3.0-9.0之間的pH，更優(yōu)選在約4.5-8.5之間并且仍然更優(yōu)選在約5.0-8.0之間。組合物的pH可以通過使用緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、Tris或組氨酸來維持，通常采用的范圍從約lmM-50mM。組合物的pH可以另外通過使用生理學可接受的酸或堿來調(diào)節(jié)。
[0115]防腐劑通常包括在藥物組合物中以延緩微生物生長，延長組合物的保質(zhì)期并且允許多次使用的包裝。防腐劑的例子包括苯酚、間甲酚、芐醇、對羥基苯甲酸及其酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲烴銨氯化物和芐索氯銨。防腐劑通常采用的范圍為約0.1-1.0% (w/v)。 [0116]優(yōu)選地，所述藥學組合物以預防有效量或治療有效量(視情況而定，雖然預防可被視為治療)給個體，這足以顯示出對個體有利。通常，這將引起對個體有利的治療上有用的活性。所施用的化合物的實際量，以及施用的速率和時間過程將取決于所處理的病癥的性質(zhì)和嚴重程度。處理的處方例如劑量決定等在全科醫(yī)生和其它醫(yī)生的責任范圍內(nèi)，并且通?？紤]所處理的病癥、個體患者的情況、遞送位點、施用方法和醫(yī)生已知的其他因素。上述技術(shù)和方案的例子可以在 Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds.M.Ash and 1.Ash),2001 (Synapse Information Resources, Inc.,Endicott, NewYork,USA) ；Remington, s Pharmaceutical Sciences,20th Edition, 2000, pub.Lippincott, ffilliams&ffilkins ；以及 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2ndedition, 1994中找到。舉例為證，組合物優(yōu)選地施用于患者的劑量是每kg體重的活性化合物在約0.01-1OOmg之間，并且更優(yōu)選地在體重的0.5-10mg/kg之間。
[0117]可以理解，就處理腫瘤而言，處理包括醫(yī)師采取任何緩解腫瘤對患者的影響的措施。因此，盡管腫瘤的完全緩解是一個期望的目標，有效的處理將也包括能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的部分緩解，以及減緩腫瘤包括癌轉(zhuǎn)移的生長速率的任何措施。此種措施可有效延長和/或提高生活質(zhì)量以及緩解疾病的癥狀。
[0118]免疫療法
[0119]本發(fā)明的組合物，例如權(quán)利要求中定義的疫苗，可以用于疾病如癌癥的預防和處理，且更特殊地用于免疫療法。
[0120]在本發(fā)明中，術(shù)語“免疫接種”表示主動免疫，即因施用而產(chǎn)生的特異性免疫應答的誘導，該施用為例如經(jīng)由皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、口或經(jīng)鼻途徑的少量的抗原，該抗原被所接種個體識別為外源的，因此在合適的配方中是免疫原性的。因此抗原被用作免疫系統(tǒng)的“觸發(fā)”，以建立針對該抗原的特異性免疫應答。
[0121]依照本發(fā)明，免疫接種可以是治療性或預防性的。舉例為證，也許能夠通過對不患癌癥的個體進行免疫接種而達到針對癌癥疾病的出現(xiàn)的預防性保護?？赡軕么朔N預防性接種疫苗的個體的例子是具有罹患癌癥的風險增加的個體，盡管這種應用不限于此種個體。處于癌癥風險的患 者可以已經(jīng)產(chǎn)生腫瘤，無論是作為原發(fā)腫瘤還是轉(zhuǎn)移灶，或者顯示出癌癥的傾向。
[0122]對于依照本發(fā)明的癌癥患者的主動免疫，納米顆粒通常配制成疫苗。優(yōu)選地，此種藥學制備物含有藥學可接受的載體，舉例，其可進一步包含輔助物質(zhì)、緩沖液、鹽和/或防腐劑。所述藥學制備物可以，例如用于癌癥相關(guān)病況的預防和療法，如癌癥患者中的轉(zhuǎn)移形成。這樣，抗原呈遞細胞在體內(nèi)或也在離體被特別調(diào)制從而產(chǎn)生針對的TAA的免疫應答。
[0123]對于以特定抗原或抗原組合的主動免疫，通常使用含有免疫原的疫苗制劑-免疫原無論是天然的TAA或其表位，模擬物或新表位模擬物，-多半是在低濃度時，例如免疫原性量的范圍從0.01 μ g-10mg，但是劑量范圍可提高到范圍為100-500mg。取決于例如由外來種類的序列或通過衍生化決定的免疫接種抗原的免疫原性，或也取決于分別使用的輔助物質(zhì)或佐劑，所述合適的免疫原性劑量可選擇在例如的范圍為0.01 μ g-lmg，優(yōu)選100yg-500ygo但是，將在一個長時期內(nèi)被遞送至生物體的儲庫疫苗也含有高得多的疫苗抗原量，例如至少Img-1OOmg以上。
[0124]濃度將取決于施用的液體或懸浮疫苗的量。疫苗通常提供在即時可用的注射器或安瓿內(nèi)，具有的體積范圍從0.01-1ml，優(yōu)選0.1-0.75ml。
[0125]疫苗的組分的免疫接種抗原優(yōu)選是以藥學可接受的載體存在，其適合于皮下、肌內(nèi)以及還有皮內(nèi)或透皮施用。施用的進一步模式經(jīng)由粘膜通道例如經(jīng)鼻或經(jīng)口施用的免疫接種發(fā)揮作用。如果采用固體物質(zhì)作為用于疫苗制劑的輔助劑，例如疫苗抗原的被吸附物或懸浮混合物將分別與輔助劑一起施用。在特定的實施方案中，疫苗作為水性溶劑中的溶液或液體疫苗存在。
[0126]優(yōu)選地，腫瘤疫苗的免疫接種單元已在合適的即可使用的注射器或安瓿中提供。所述疫苗的穩(wěn)定制劑可以有利地以即可使用的形式投放市場。盡管并不一定需要防腐劑如硫柳汞或具有改善的耐受性的其他防腐劑的組分，但為了從冷凍溫度升至室溫的儲存溫度下的較長的穩(wěn)定性，它可提供于制劑中。但是依照本發(fā)明的疫苗也可以以冷凍或凍干形式提供，并且也可按要求分別被解凍或重構(gòu)。
[0127]在依照本發(fā)明的特定情況下，本發(fā)明的疫苗的免疫原性可通過采用佐劑而增加。出于這個目的，使用固體物質(zhì)或液體疫苗佐劑，例如氫氧化鋁(Alu-Gel)或磷酸鋁、生長因子、淋巴因子、細胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、Y干擾素或補體因子如C3d，其他脂質(zhì)體制備物，又或者針對其免疫系統(tǒng)已經(jīng)產(chǎn)生強烈的免疫應答的帶有額外抗原的制劑，如破傷風類毒素、細菌毒素如假單胞菌外毒素和脂質(zhì)A及脂多糖的衍生物。
[0128]在特定情況下，不需要采用額外佐劑，特別地，本文所描述的例子顯示了 CTL應答的有效產(chǎn)生通過使用無任何額外佐劑的本發(fā)明的納米顆粒來實現(xiàn)(參見通常與一種或多種佐劑施用的游離肽)。這在特定環(huán)境下是非常有利的，因為一些佐劑被認為是有毒的，或者不適合人類使用。
[0129]表位肽
[0130]在依照本發(fā)明的特定優(yōu)選的情況下，所述表位肽可以包含以下表1中列出的氨基酸序列或由以下表1中列出的氨基酸序列組成。
[0131]
【權(quán)利要求】
1.一種疫苗，其用于在哺乳動物受試者中的腫瘤的預防性或治療性處理，所述疫苗包含多個納米顆粒和藥學可接受的載體、鹽或稀釋劑，至少一種所述納米顆粒包含: (i)包含金屬和/或半導體原子的核心； (ii)包含共價連接至所述核心的多個配體的冠，其中所述多個中的至少第一配體包含經(jīng)由第一接頭共價連接至所述核心的碳水化合物部分或包含谷胱甘肽，并且其中所述多個中的至少第二配體包含經(jīng)由第二接頭共價連接至所述核心的表位肽，所述第二接頭包含: 肽部分和非肽部分，其中所述肽部分包含序列X1X2Z1,其中: X1為選自A和G的氨基酸； X2為選自A和G的氨基酸；和 Z1為選自Y和F的氨基酸。 并且其中所述表位肽形成腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的至少一部分或者來自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其中第二接頭的所述非-肽部分包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的疫苗，其中所述第一配體和/或所述第二配體經(jīng)由含硫基團、含氨基基團、含磷酸基團或含氧基團共價連接至所述核心。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求 中任一項的疫苗，其中所述第二接頭的所述肽部分包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成:
(i)AAY;和
(ii)FLAAY(SEQID NO:9I)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中所述第二接頭選自:
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAy ；
(ii)HS-(CH2)2-C0NH-FLAAY；
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAY；
(iv)HS-(ch2)3-conh-flaay ；
(V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAY ;和
(vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAY， 其中所述第二接頭經(jīng)由接頭的非-肽部分的硫醇基團共價連接至所述核心。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中所述表位肽經(jīng)由其N-末端連接至所述第二接頭的所述肽部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗，其中所述第二配體選自:
(i)HS-(Ch2)2-CONh-AAYZ2 ；
(ii)HS-(CH2)2-C0NH-FLAAYZ2；
(iii)HS-(CH2)3-C0NH-AAYZ2；
(iv)HS-(Ch2)3-Conh-Flaayz2 ；
(V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAYZ2 ;和
(vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAYZ2， 其中Z2代表所述表位肽。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中所述表位肽與主要組織相容性復合體(MHC) I類分子相結(jié)合，或者能夠經(jīng)過加工從而與MHC I類分子相結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗，其中所述表位肽由8至40個氨基酸殘基的序列組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗，其中所述表位肽由8至12個氨基酸殘基的序列組成。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中表位肽能夠被MHCI類分子呈遞從而刺激細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中所述TAA是肺癌抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗，其中所述肺癌選自:小細胞肺癌、非小細胞肺癌和腺癌。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的疫苗，其中所述表位肽包含選自SEQID ΝΟ:1至86的氨基酸序列或由選自SEQ ID NO:1至86的氨基酸序列組成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的疫苗，其中所述表位肽包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成:
VLVPVLVMV(SEQ ID NO:82)；
KIYQffINEL(SEQ ID NO:29)；
KLGEFAKVLEL(SEQ ID NO:33)；
GMYGKIAVMEL(SEQ ID NO:19)；
KLIPFLEKL(SEQ ID NO:34);和
RLLEVPVML(SEQ ID NO:67)。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中: (i)所述第一配體的碳水化合物部分包含單糖和/或二糖；和/或 (ii)所述多個配體包含經(jīng)由谷胱甘肽硫原子共價連接至納米顆粒的核心的至少一個谷胱甘肽配體；和/或 (iii)所述多個配體包含: (a)葡萄糖； (b)N-乙酰氨基葡萄糖； (c)谷胱甘肽； (d)葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖； (e)葡萄糖和谷胱甘肽； (f)N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽；或 (g)葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16(i)的疫苗，其中所述碳水化合物部分包含葡萄糖、甘露糖、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。
18.根據(jù)前述權(quán)利 要求中任一項的疫苗，其中所述第一接頭包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中所述第一配體包含經(jīng)由硫醇硫原子共價附著至核心的2’ -硫乙基-β -D-吡喃葡萄糖苷或2’ -硫乙基-a -D-吡喃葡萄糖苷。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中納米顆粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50種含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中納米顆粒包含至少1、至少2、至少3、至少.4、或至少5種含表位肽的配體。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體與含表位肽的配體的摩爾比的范圍為5:1至100:1。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗，其中含碳水化合物的配體與含表位肽的配體的摩爾比的范圍為10:1至30:1。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中納米顆粒的核心的直徑的范圍為Inm至5nm。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中納米顆粒包括其配體的直徑的范圍為5nm 至 20nm,任選地 5nm 至 1 5nm,或 8nm 至 IOnm0
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗,其中核心包含選自下述的金屬:Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd和Zn或其任何組合。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的疫苗，其中核心包含選自下述的鈍態(tài)金屬:Au、Ag、Pt、Pd和Cu或其任何組合。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的疫苗,其中核心包含選自下述的金屬的組合:Au/Fe、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd 和 Au/Fe/Cu/Gd。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中核心是磁性的。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中核心進一步包含選自下述的NMR活性原子:Mn2+、Gd3+、Eu2+、Cu2+、V2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+ 和鑭系元素 3+。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中核心包含半導體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的疫苗，其中半導體選自:硒化鎘、硫化鎘、碲化鎘和硫化鋅。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或權(quán)利要求32的疫苗，其中核心能夠作為量子點。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中至少一種納米顆粒包含至少兩種含表位肽的配體，并且其中至少兩種含表位肽的配體各自的所述表位肽不同。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的疫苗，其中所述至少兩種含表位肽的配體的表位肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或各自來自不同的肺癌TAA。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中所述疫苗包含具有第一含表位肽的配體的第一種類的所述納米顆粒和具有第二含表位肽的配體的第二種類的所述納米顆粒，其中所述第一和第二種類的表位肽不同。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的疫苗，其中所述第一和第二種類納米顆粒各自的表位肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自來自不同的肺癌TAA。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或權(quán)利要求37的疫苗，其包含至少3、至少4、至少5或至少10個不同種類的納米顆粒的合并庫，各個種類具有不同的表位肽。
39.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其進一步包含至少一種佐劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的疫苗，其中所述佐劑共價附著至至少一個納米顆粒的核心。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或權(quán)利要求40的疫苗，其中所述佐劑包含(S)-(2，3-雙(棕櫚酰氧基)_ (2RS)_ 丙基)-N-掠桐酸基 _ (R) _Cys- (S) -Ser (S) -Lys4-OH ( “Pam3Cys”)。
42.根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一項的疫苗，其中所述疫苗基本上不含佐劑或其中由納米顆粒提供唯一的佐劑功效。
43.前述權(quán)利要求中任一項中所定義的疫苗，用于在藥物中使用。
44.前述權(quán)利要求中任一項所定義的疫苗，其用于在處理哺乳動物受試者中的癌癥的預防性或治療性方法中使用。
45.根據(jù)權(quán)利要求44使用的疫苗，其中所述癌癥包含肺癌。
46.根據(jù)權(quán)利要求45使用的疫苗，其中所述肺癌癥選自:小細胞肺癌、非小細胞肺癌和腺癌。
47.前述權(quán)利要求中任一項中所定義的疫苗在制備藥物中的用途，所述藥物用于在哺乳動物受試者中的癌癥的預防性或治療性處理。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的用途，其中所述癌癥包含肺癌。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的用途，其中所述肺癌選自:小細胞肺癌、非小細胞肺癌和腺癌。
50.根據(jù)權(quán)利要求1至46的疫苗或根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項的用途，其中所述疫苗或藥物用于經(jīng)由淋巴攝取的施用。
51.一種預防性或治療性處理癌癥的方法，其包含對有此需要的哺乳動物受試者施用預防或治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至42中任一項所定義的疫苗。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述癌癥是肺癌。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述肺癌選自:小細胞肺癌、非小細胞肺癌和腺癌。
54.根據(jù)權(quán)利要求51至53中任一項的方法，其中所述疫苗在用于淋巴攝取的位點進行施用。
55.—種產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答的體外或體內(nèi)方法，其包含: (i)使至少一種抗原呈遞細胞(APC)與權(quán)利要求1至42中任一項所定義的疫苗接觸，從而使得所述表位肽被呈遞到所述APC的MHC I類分子上；和 (ii)使所述至少一個(i)中的APC與至少一個CTL細胞接觸，從而使得所述CTL細胞由所述APC激活以產(chǎn)生對所述表位肽特異性的CTL應答。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的體外方法，其中APC是在所述疫苗存在下進行培養(yǎng)，并且同時或相繼地，與所述CTL細胞共培養(yǎng)。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中APC在與疫苗接觸后、與所述CTL細胞共培養(yǎng)前接受洗滌步驟。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其進一步包含對哺乳動物受試者施用CTL細胞。
59.根據(jù)權(quán)利要求55的體內(nèi)方法，其中所述疫苗由選自下述的施用途徑遞送: 在淋巴攝取的位點或其附近向哺乳動物受試者的器官或組織中注射； 經(jīng)由噴霧或凝膠的鼻腔遞送； 經(jīng)由噴霧或凝膠或口服可溶解膜的頰遞送； 經(jīng)由可溶解膜的口腔遞送； 經(jīng)由摻入疫苗的貼片的透皮遞送；和 包含疫苗的組合物的吸入遞送。
60.根據(jù)權(quán)利要求55至59中任一項的方法，其中所述疫苗包含具有不同表位肽的納米顆粒的合并庫。
61.根據(jù)權(quán)利要求55至60中任一項的方法,其中所述CTL應答包含一種或多種細胞因子的生產(chǎn)。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述一種或多種細胞因子包含干擾素Y(IFN-Y)0
63.根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項的方法，其中所述至少一個CTL細胞對于包含呈現(xiàn)在MHC I類分子上的所述表位肽的MHC-肽復合物展現(xiàn)出更高的親和力，其中所述更高的親和力相較于對于由APC所激活的CTL細胞所展現(xiàn)的MHC-肽復合物的親和力更高，所述APC已經(jīng)以不連接至納米顆粒的游離肽的形式與相同的表位肽接觸。
【文檔編號】A61P35/00GK103957943SQ201280052020
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月7日
【發(fā)明者】T·雷德梅徹爾, R·菲利普 申請人:Mida科技有限公司, 伊繆諾托佩股份有限公司