用于抑制經(jīng)由胰島素樣生長因子-1的細胞活化的方法
【專利摘要】抑制有其需要的個體（例如患有癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變或其他疾病的個體）中經(jīng)由胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的細胞活化的方法，其包括向所述個體以有效抑制經(jīng)由IGF-1的細胞活化的量施用抑制IAP與SHPS-1的結合的拮抗劑。還描述了用于實施此類方法的化合物和組合物。
【專利說明】用于抑制經(jīng)由胰島素樣生長因子-1的細胞活化的方法
[0001] 優(yōu)先權聲明 本申請要求享有于2011年8月26日提交的美國申請序列號13/219, 276的優(yōu)先權，其 完整內容通過引用并入本文。
[0002] 政府支持的聲明 本發(fā)明在來自美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)的授權號 AG02331下由政府支持進行。美國政府對本發(fā)明擁有某些權利。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明涉及用于抑制有其需要的個體中的IGF-1活性的方法，所述有其需要的個 體例如患有癌癥、動脈粥樣硬化、腎病和/或視網(wǎng)膜病變的個體。
[0004] 發(fā)明背景 胰島素樣生長因子-I是一般性體細胞生長所必需的，即貫穿兒童期發(fā)生的正常生長 和發(fā)育需要IGF-1。如果IGF-1基因從小鼠中缺失，則小鼠以正常大小的一半出生并且在出 生后生長不良，達到正常成體大小的大約30%。因此，這種生長因子是對于所有已知細胞類 型的重要絲裂原。
[0005] 已出現(xiàn)對抑制細胞中的促有絲分裂的IGF-1活化的興趣，因為已顯示高濃度的 IGF-1與癌癥發(fā)生聯(lián)系，而低濃度的IGF-1看起來是癌癥防護性的。例如，Baserga等人的美 國專利號6, 340, 674描述了通過使癌細胞與寡核苷酸接觸來抑制癌細胞增殖的反義方法， 所述寡核苷酸與IGF-1受體RNA區(qū)域基本上互補，并且其與IGF-1受體RNA特異性雜交。
[0006] 此外，IGF-1在涉及異常細胞修復的幾種疾病中的局部微環(huán)境中合成。這一類型 的重要疾病是動脈粥樣硬化，其為美國的首要死亡原因。動脈粥樣硬化病變中的細胞合 成過量IGF-1，并且因此過量IGF-1信號傳遞導致病變的擴大。幾項研究已顯示如果這種 IGF-1的效應得到抑制，則病變進展遲緩。因此，在抑制血管壁細胞類型例如平滑肌細胞中 的IGF-1作用中存在顯著興趣。
[0007] 抑制IGF-1的常規(guī)方法例如阻斷與IGF-1受體的配體結合由于兩個原因已失 ?。菏紫?，該結合部位是相當大的，并且因此難以設計將有效抑制結合的化合物；其次，在 IGF-1受體和胰島素受體之間存在顯著結構重疊，并且由于胰島素受體的共抑制，已嘗試通 過阻斷受體活性來改變IGF-1受體活性的方法已始終導致毒性。反義技術提出將活性劑遞 送至靶細胞內部的問題。因此，存在關于抑制需要此類治療的個體細胞中的IGF-1活性或 產(chǎn)生的新方法的需要。
[0008] 發(fā)明概沭 本發(fā)明提供了抑制有其需要的個體[例如，患有下述疾病或處于患有下述疾病的增加 風險中的個體：癌癥、腫瘤、動脈粥樣硬化、腎病(例如糖尿病腎?。┖?或視網(wǎng)膜病變(例如 糖尿病視網(wǎng)膜病變）]中經(jīng)由胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)的細胞活化的方法。該方法包 括向個體以有效抑制經(jīng)由IGF-1的細胞活化的量(例如有效治療病況或病癥的量或者治療 有效量）施用抑制IAP與SHPS-1的結合的拮抗劑。
[0009] 本發(fā)明的一個方面是治療個體(例如有其需要的個體）中的腫瘤的方法，其包括向 個體以有效治療腫瘤的量(例如有效抑制IGF-1對腫瘤的作用的量）施用IAP與SHPS-1結 合拮抗劑(例如本發(fā)明的抗體)。本文還包括的是治療個體(例如有其需要的個體)中的癌癥 的方法，其包括向個體施用有效量的IAP與SHPS-1結合拮抗劑(例如本發(fā)明的抗體)。可以 根據(jù)本發(fā)明的方法治療的癌癥的非限制性實例包括乳腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、急性 髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、平滑肌肉瘤、卵巢癌、 成膠質細胞瘤和肝細胞癌。待治療的腫瘤包括與任何上文列出的癌癥相關的腫瘤以及表達 IGF-1受體的任何腫瘤。
[0010] 本發(fā)明的另一個方面是在通過向個體施用治療有效量的抗腫瘤化合物（即化學治 療劑)和/或放射療法來治療有其需要的個體中的腫瘤的方法中的改進，該改進包括向個體 以有效抑制IGF-1介導的腫瘤細胞援救的量（即抑制IGF-1對腫瘤細胞的抗凋亡作用)施用 IAP與SHPS-1結合拮抗劑。
[0011] 本發(fā)明的進一步方面是治療有其需要的個體中的動脈粥樣硬化的方法，其包括向 個體以有效治療動脈粥樣硬化的量施用IAP與SHPS-1結合拮抗劑?？梢灾委熑魏晤愋偷?動脈粥樣硬化病變，例如冠狀動脈、頸動脈和/或股動脈粥樣硬化。一般而言，待治療的動 脈粥樣硬化病變是其中病變細胞表達IGF-1受體的病變。
[0012] 本發(fā)明的進一步方面是治療有其需要的個體中的糖尿病腎病(例如糖尿病腎?。?的方法，其包括向個體以有效治療腎病的量施用IAP與SHPS-1結合拮抗劑。
[0013] 本發(fā)明的進一步方面是治療有其需要的個體中的視網(wǎng)膜病變(例如糖尿病視網(wǎng)膜 病變）的方法，其包括向個體以有效治療視網(wǎng)膜病變的量施用IAP與SHPS-1結合拮抗劑。
[0014] 本發(fā)明的進一步方面是治療有其需要的個體中的冠心病的方法，其包括向個體以 有效治療冠心病的量施用IAP與SHPS-1結合拮抗劑。
[0015] 可以在實施本文描述的方法中使用的拮抗劑，有時在本文中被稱為活性劑，可以 具有任何合適類型，包括蛋白質或肽，例如抗體或其抗原結合片段。可以用于實施本發(fā)明的 拮抗劑的特定實例包括但不限于拮抗IAP與SHPS-1結合的抗體，包含IAP結合結構域、由 IAP結合結構域組成或基本上由IAP結合結構域組成的SHPS-1片段，包含SHPS-1結合結構 域、由SHPS-1結合結構域組成或基本上由SHPS-1結合結構域組成的IAP片段，其類似物和 /或其非肽模擬物或類似物。在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體可以是單克隆抗體B6H12。
[0016] 本發(fā)明的進一步方面是包含在藥學上可接受的載體中的活性劑(例如如本文描述 的抗體或其抗原結合片段的藥物制劑。
[0017] 本發(fā)明的進一步方面是如本文描述的活性劑用于制造用于實施如本文描述的治 療方法的藥劑的用途。
[0018] 本發(fā)明的進一步方面是就下述中的活性篩選化合物的體外方法抑制經(jīng)由胰 島素樣生長因子-I的細胞活化(例如，抑制經(jīng)由IGF-1的細胞生長，Γ?)治療癌癥或腫瘤 (如上所述)，和/或（iii)治療動脈粥樣硬化(如上所述)，該方法包括步驟：（a)將測試化合 物加入體外系統(tǒng)或使測試化合物與體外系統(tǒng)接觸，所述體外系統(tǒng)包含SHPS-1蛋白質和IAP 蛋白質；隨后（b)測定測試化合物是否是IAP與SHPS-1結合的拮抗劑；并且隨后（c)當測 試化合物是IAP與SHPS-1結合的拮抗劑時，將測試化合物鑒定為在下述中是有活性或潛在 有活性的：ου抑制經(jīng)由胰島素樣生長因子-1的細胞活化，Γ?)治療癌癥或腫瘤，和/或 Tiii)治療動脈粥樣硬化。
[0019] 本發(fā)明還提供了單克隆抗體，其特異性結合在人IAP蛋白質(氨基酸編號基于SEQ ID N0:7的氨基酸序列）的氨基酸71-80 (即肽ALNKSTVPTD，SEQ ID N0:6)內的表位，并且是 IAP與SHPS-1結合的拮抗劑。該抗體的進一步特征是它不破壞IAP與β 3蛋白質的結合。 關于人ΙΑΡ的氨基酸編號基于GenBank?數(shù)據(jù)庫登記號ΝΡ_942088 (通過引用并入本文）的 參考氨基酸序列，并且如下，其中第一個氨基酸編號1，并且最后一個氨基酸編號305。氨基 酸殘基71-80在下文序列中是粗體。 MWPLVAALLL GSACCGSAQL LFNKTKSVEiF TFCNDTVV1I> CFVTNMEAQN rf'EVYVKWICF KORDrYTFDG AL.N1CS1*VPTD FSSAK1EVSQ LLKGDASLKM DKSDAVSHTG NYTCEVTELT REGETIIELIC YRVVSWFSPN BNILIVIFPI FA1LLFWGQF GIKTLKYRSCJ CjMDEKTlALL VAGLViTVIVIV GA1LFVPG EYSLKNATGL G1JVTSTC51L ILLHYYVFST AIG LTS F￥IA IL VIQV1ΛΥ l l.AVVGLSLCi AACIPMHGPL LISGLS1LAI. AQLLCiLVYMK FVASNQKTiQ PP11NN (SEQ ΓΝ MO:7)
[0020] 上文描述的單克隆抗體可以是由雜交瘤NPG-1產(chǎn)生的單克隆抗體，或競爭結合與 由通過所述雜交瘤NPG-1產(chǎn)生的單克隆抗體結合的表位相同的表位的單克隆抗體。雜交瘤 NPG-1于2012年8月17日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC ;Manassas，VA)，并且指 定登記號PTA-13161。
[0021] 本文另外提供的是抑制有其需要的個體中的IGF-1作用的方法，其包括向個體施 用本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段。
[0022] 進一步提供的是治療個體(例如有其需要的個體）中的糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病 動脈粥樣硬化、糖尿病腎病和/或冠心病的方法，其包括向個體施用有效量的本發(fā)明的抗 體或其抗原結合片段。在此類方法中，在一些實施方案中，抗體可以通過皮下注射和/或靜 脈內輸注進行施用。
[0023] 附圖簡沭 圖1A-C. IAP與SHPS-1的共沉淀且用抗IAP抗體B6H12破壞。A.將細胞裂解產(chǎn)物用 抗IAP抗體免疫沉淀，并且通過用抗SHPS-1抗血清免疫印跡測定SHPS-1的共沉淀，或用 SHPS-1免疫沉淀，并且通過用抗IAP抗體免疫印跡測定IAP的共沉淀。作為對照，細胞裂 解產(chǎn)物還用無關多克隆抗體（IgG)免疫沉淀，并且用抗IAP抗體免疫印跡。B.將休眠 pSMC 溫育兩小時土抗IAP單克隆抗體B6H12,或無關對照單克隆抗體的添加(兩者均以4 Pg/ ml)。隨后通過用SHPS-1抗體免疫沉淀且用抗IAP抗體免疫印跡來測定IAP與SHPS-1的 共沉淀。每個泳道中的SHPS-1蛋白質的量顯示于下圖中。C. FLAG標記的IAP的表達和與 SHPS-1的結合。上圖：FLAG標記的IAP的表達通過使用抗FLAG抗體免疫印跡來自細胞的 全細胞裂解產(chǎn)物進行測定，所述細胞用IAPcDNA構建體中的每一種轉染。作為掃描單位的 結果是：泳道1:38018、泳道2:39274、泳道3:46779。下圖：細胞裂解產(chǎn)物用抗SHPS-1抗體 免疫沉淀，隨后通過用抗FLAG抗體免疫印跡測定FLAG標記的IAP的共沉淀。在每個泳道 中免疫沉淀的SHPS-1量顯示于下圖中。
[0024] 圖2A-C. A.在通過抗IAP抗體B6H12破壞IAP和SHPS-1之間的結合后，響應 IGF-1的SHPS-1磷酸化和向SHPS-1的SHP-2募集。將休眠細胞溫育兩小時土 B6H12抗體 或無關對照單克隆抗體(兩者均以4 Pg/ml )，隨后如所示的暴露于IGF-1( 100 ng/ml )。細胞 裂解產(chǎn)物用抗SHPS-1抗體免疫沉淀，隨后通過用抗磷酸酪氨酸抗體（p-Tyr)免疫印跡測定 SHPS-1的磷酸化。SHP-2與SHPS-1的結合通過使用抗SHP-2抗體免疫印跡進行顯現(xiàn)。每個 泳道中的SHPS-1蛋白質的量顯示于下圖中。顯示了如通過來自三次分開實驗的蛋白質免 疫印跡的掃描光密度法分析測定的，在IGF-1刺激后的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集中的增 力口。當與B6H12預溫育的細胞與在單獨的SFM中預溫育的細胞相比較時，**p〈0.05。B在 表達突變型IAP的細胞中IAP和SHPS-1之間的結合破壞后，響應IGF-1的SHPS-1磷酸化和 SHP-2募集。使細胞暴露于IGF-1 (100ng/ml)不同時期。細胞裂解產(chǎn)物用抗SHPS-1抗體 免疫沉淀，并且通過用抗磷酸酪氨酸抗體（pTyr)免疫印跡測定SHPS-1的磷酸化。SHP-2的 結合通過使用抗SHP-2抗體免疫印跡進行顯現(xiàn)。每個泳道中的SHPS-1蛋白質的量顯示于 下圖中。顯示了如通過來自三次分開實驗的蛋白質免疫印跡的掃描光密度法分析測定的， 在IGF-1刺激后的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集中的增加。當表達突變型IAP的細胞與表達 IAP fl的細胞相比較時，林p〈0. 05。C.響應TOGF的SHPS-1磷酸化。使細胞暴露于TOGF (10 ng/ml) 5分鐘。在細胞裂解和用抗SHPS-1抗體免疫沉淀后，通過用抗磷酸酪氨酸抗體 (pTyr)免疫印跡測定SHPS-1磷酸化。
[0025] 圖3A-B.在IAP和SHPS-1之間的相互作用破壞后，IGF-1R磷酸化時間過程和 SHP-2募集。A.將休眠細胞溫育土抗IAP抗體B6H12 (4Pg/ml)，隨后暴露于IGF-1 (100 ng/ml)不同時間長度。在裂解和用抗IGF-1R抗體免疫沉淀后，通過用抗磷酸酪氨酸抗體 (pTyr)免疫印跡測定受體的磷酸化。SHP-2的結合通過用抗SHP-2抗體免疫印跡進行測定。 每個泳道中的IGF-1R蛋白質的量顯示于下圖中。顯示了如通過來自三次分開實驗的蛋白 質免疫印跡的掃描光密度法分析測定的，作為檢測到的最大磷酸化百分比的IGF-1R的酪 氨酸磷酸化水平。還顯示了如通過來自三次分開實驗的蛋白質免疫印跡的掃描光密度法分 析測定的，在IGF-1刺激后的SHP-2募集中的增加。當與B6H12預溫育的細胞與在單獨的 SFM中預溫育的細胞相比較時，林p〈0. 05。B使細胞與IGF-1 (100 ng/ml) -起溫育不同 時間。在裂解和用抗IGF-1R抗體免疫沉淀后，通過用抗磷酸酪氨酸抗體（pTyr)免疫印跡 測定受體的磷酸化。SHP-2的結合通過用抗SHP-2抗體免疫印跡進行測定。每個泳道中的 IGF-1R蛋白質的量顯示于下圖中。顯示了如通過來自三次分開實驗的蛋白質免疫印跡的掃 描光密度法分析測定的，在IGF-1刺激后的IGF-1R磷酸化和SHP-2募集中的改變。當表達 IAPc-s的細胞與表達IAP fl的細胞相比較時，林p〈0. 05。
[0026] 圖4A-B. A.響應IGF-1的MAPK磷酸化。在2小時溫育土抗IAP抗體B6H12抗 體或無關對照單克隆抗體(兩者均以4 Pg/ml)前，將細胞鋪平板且生長，并且隨后用IGF-1 (100 ng/ml)處理10分鐘。通過用磷酸特異性MAPK抗體免疫印跡測定p42/44 MAPK磷酸化 水平。通過用MAPK抗體免疫印跡測定每種樣品中的MAPK總量。B.在2小時溫育土B6H12 或無關對照單克隆抗體(兩者均以4 Pg/ml的濃度）前，將細胞鋪平板且生長，并且隨后用 IGF-I (100 ng/ml)處理48小時。隨后測定每個孔中的細胞數(shù)目。每個數(shù)據(jù)點代表三次獨 立實驗的平均值。當在B6H12的存在下溫育的培養(yǎng)物中的細胞數(shù)目與在不存在抗體的情況 下溫育的培養(yǎng)物中的細胞數(shù)目相比較時，**P =〈 〇. 05。
[0027] 圖5. IGF-1在表達全長IAP和IAP C-S的細胞中刺激細胞遷移。使匯合細胞受傷 并且隨后溫育± IGF-1 (lOOng/ml)共48小時。計數(shù)在至少5個預選擇的區(qū)中遷移跨越 創(chuàng)傷邊緣的細胞數(shù)目。每個數(shù)據(jù)點代表三次獨立實驗的平均值土 S.E.M.。當在IGF-1的 存在下的遷移與在單獨的SFM中的溫育相比較時，** p〈0. 05。
[0028] 圖6A-D.使人內皮細胞暴露于抗IAP抗體，并且用抗SHPS-1免疫沉淀裂解產(chǎn)物且 隨后就IAP或She進行免疫印跡。A.單克隆抗體NPG-1可以破壞IAP與SHPS-1的結合。 使細胞與NPG-1預溫育，并且隨后將SHPS-1免疫沉淀且就IAP免疫印跡免疫沉淀物。B. 如果細胞與NPG-1抗體一起預溫育，則必須與內皮細胞中待活化的SHPS-1結合的She通常 不結合。C. NPG-1抗體特異性破壞IAP與SHPS-1的結合，而不破壞IAP與β 3的結合。D. SHPS-1與ΙΑΡ結合在來自對照大鼠（Con)、糖尿病大鼠（D)和用抗ΙΑΡ抗體處理的糖尿病大 鼠（R569) (D + AB)的主動脈勻漿物中進行測定。
[0029] 圖7A-C.毛細血管形成的體外測定。A.基于藍色葡聚糖透過在體外測量的細胞 通透性。IGF-1刺激透過并且這在NPG-1抗體（IAPab)的存在下得到抑制。B.允許內皮細 胞形成通透性屏障的緊密連接蛋白質閉鎖蛋白（occludin)在IGF-1的存在下被破壞，導致 閉鎖蛋白離開通常形成的連接復合物，并且擴散到細胞內。在NPG-1抗體的存在下，IGF-1 的這種效應被完全抑制。C.內皮細胞管形成的顯微照片。在IGF-1處理的細胞中，可見管 形成(右上圖)，其中毛細血管細胞由毛細管彼此連接。在NPG-1抗體的存在下，如下面兩個 小圖和在其中顯示管數(shù)目/ cm2的條形圖上所示，這被完全破壞。
[0030] 圖8A-B.大鼠內皮細胞在25mM葡萄糖中進行培養(yǎng)。在SFM細胞中過夜后連同（AB) 或不連同（Con )抗IAP抗體（R569 )-起溫育，使用大鼠 IAP序列NKNSTTREQN (SEQ ID N0:8 ) 制備，其為大鼠 IAP序列的氨基酸71-80 ;編號基于NCBI參考序列登記號NP_062068的氨 基酸序列[MWPLAAALLL OSCi-:CGSAQL LLSKV1CSVEF TSC+NDTVVIP C，K乳NVEAQS 丁DEMFV，KL NKNSTTREQN FTSAKJSVSD LLKGIASLTM DTHEAVVGNY TCRVTELSRE GKTV1ELKMR PVSWfSTNEK IIJVIFPIi.A ILLfWClKFGl L；i'l.KYKSSHT NKW1LLLVA GLALTLIVVV GAILFIPGEK PVKNASGLGL IVISTGIUL. I.Q^VFMTAF GMTSFTIAIL ITQVLGYV1.A VV(jMCI,CIMA CEfVHGPLL! SGLGHALAE L1.GLVYMKFV ASNQRTIQPP RNN《SEQ ID NCW)]。對于抗體生產(chǎn)，這個序列根據(jù)已知方法與KLH連 接作為免疫原。A.對照抗體對IAP/SHPS-1結合沒有作用，而抗大鼠 IAP抗體完全破壞這種 結合。B.在IGF-1刺激后，存在SHPS-1的酪氨酸磷酸化、AKT的刺激和MAPK活化。這些在 抗大鼠 IAP抗體的存在下被抑制。
[0031] 圖9.血管通透性。非糖尿病大鼠作為對照顯示（N=5)。糖尿病大鼠用對照IgG (N=12)或通過蛋白A瓊脂糖層析由抗血清純化的IgG進行處理，所述抗血清含有本文描述 的抗大鼠 IAP抗體（N=14)。在三周后，將動物麻醉且隨后測量血管通透性?？勾笫?IAP IgG 顯著抑制視網(wǎng)膜靜脈血管通透性，其為在糖尿病視網(wǎng)膜病變中發(fā)生的首批改變之一。
[0032] 發(fā)明詳沭 本發(fā)明在下文更詳細地說明。這個說明書并不旨在是其中可以實現(xiàn)本發(fā)明的所有不同 方法，或可以添加到本發(fā)明中的所有特點的詳細目錄。例如，就一個實施方案而言舉例說明 的特點可以摻入其他實施方案內，并且就特定實施方案而言舉例說明的特點可以從該實施 方案中刪除。此外，對本文建議的多個實施方案的眾多變化和添加在本公開內容的教導下 對于本領域技術人員將是顯而易見的，其不會背離本發(fā)明。因此，以下詳述旨在舉例說明本 發(fā)明的一些特定實施方案，而不是詳盡說明其所有排列、組合和變化。
[0033] 可以通過本發(fā)明治療的個體包括用于醫(yī)學目的的人個體和用于獸醫(yī)學以及藥物 篩選和開發(fā)目的的動物個體。一般而言，其他合適的動物個體是哺乳動物個體例如人、靈長 類動物、牛、綿羊、山羊、豬、馬、貓、犬、兔類動物、嚙齒類動物(例如大鼠和小鼠）等。人個體 是最優(yōu)選的。人個體包括胎兒、新生兒、嬰兒、青少年和成年個體。
[0034] 如本文使用的"IGF-1"意指胰島素樣生長因子-1。
[0035] 如本文使用的"IGF-1R"意指IGF-1受體。
[0036] 如本文使用的"IAP"意指整聯(lián)蛋白相關蛋白質。IAP可以具有任何類型，但優(yōu) 選是哺乳動物IAP (例如人、小鼠、大鼠、兔、猴、豬等)，并且最優(yōu)選是人ΙΑΡ。IAP (有時也 稱為CD47)是已知的，并且在例如下述中描述：E. Brown等人/化#沿111:2785-94 (1990) ;C. Rosales 等人遞149:2759-64 (1992) ;D. Cooper 等人 92:3978-82 (1995);P. Jiang 等人/沿274:559-62 (1999);P. Oldenborg 等人 288:2051-4 (2000) ;Μ· Seiffert 等人財94:3633-43 (1999) ;Ε· Vernon-Wilson 等人及/r/J遞30:2130-2137 (2000) ;Η· Yoshida 等人遞 168:3213-20 (2002);和 I. Babic 等人//遞κ//?ο7 164:3652-8 (2000)。
[0037] 如本文使用的"SHPS-1"意指含有src同源區(qū)2結構域的蛋白質酪氨酸磷酸酶底 物1。SHPS-1可以具有任何類型，但優(yōu)選是哺乳動物SHPS-U例如人、小鼠、大鼠、兔、猴、豬 等)，并且最優(yōu)選是人SHPS-1。SHPS-1(有時也稱為P84)是已知的，并且在例如下述中描述： T. Noguchi 等人，/沿271,27652-8 (1996) ;Y. Fujioka 等人，16， 6887-99 (1996) ;Α· Kharitonenkov 等人，Tfeitfre 386，181_6 (1997) ;Μ· Stofega 等人，/ 沿273,7112-7 (1998);和 T. Takada 等人，/沿273,9234-42 (1998)。
[0038] 如本文使用的"SHP-2"意指含有src同源區(qū)2的蛋白質酪氨酸磷酸酶-2。
[0039] 如本文使用的"治療（Treat)"、"治療（treating)"或"治療（treatment)"指對個 體賦予利益的任何類型的活動，所述個體患有疾病或病癥或者處于發(fā)生疾病或病癥的風險 中，所述利益包括個體病況中（例如一種或多種癥狀中）的改善，疾病進展中的延遲，癥狀發(fā) 作中的延遲和/或癥狀進展的減慢等。像這樣，在一些實施方案中，術語"治療（treating)" 可以包括個體的預防治療，以防止癥狀的發(fā)作。如本文使用的，術語"治療（treat)"或"治 療（treatment)"不必意欲暗示癥狀的治愈或完全取消。
[0040] 如本文使用的"治療有效量"、"有效治療的量"、"有效量"等等意指足以對個體產(chǎn) 生希望和/或有益作用的拮抗劑(例如抗體或其抗原結合片段)的量，所述個體患有癌癥、腫 瘤、動脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病變、腎病或其中IGF-1誘導異常細胞生長的其他不希望有的醫(yī) 學病況。這包括患者病況中(例如一種或多種癥狀中）中的改善，疾病進展中的延遲等。
[0041] 如本文使用的"藥學上可接受的"意指化合物或組合物適合于按照疾病或病癥的 嚴重性和治療的必要性施用于個體，以實現(xiàn)如本文描述的有益和/或治療有效結果，而無 過度的有害副作用。
[0042] 申請人:特別旨在本文引用的所有專利、專利公開、國際專利公開和非專利參考文 獻均以其整體通過引用并入本文。
[0043] Α·抗體。
[0044] 如本文使用的術語"抗體"指免疫球蛋白的所有類型，包括IgG、IgM、IgA、IgD和 IgE。術語"免疫球蛋白"包括這些免疫球蛋白的亞型，例如1861、1862、186 3、1864等。在這 些免疫球蛋白中，IgM和IgG是優(yōu)選的，并且IgG是特別優(yōu)選的?？贵w可以具有任何物種的 起源，包括(例如）小鼠、大鼠、兔、馬或人，并且可以是嵌合抗體。參見例如，M. Walker等人 J遞《//?〇乂 26,403-11 (1989)。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。此 類抗體依照已知技術產(chǎn)生。如本文使用的術語"抗體"還包括保留與靶抗原結合的能力的 抗體片段(例如其抗原結合片段，例如Fab、F (ab') 2和Fv片段，和得自除IgG外的抗體的 相應片段。此類片段也通過已知技術產(chǎn)生。
[0045] 在本發(fā)明的范圍內包括的抗體片段包括例如Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段；域抗 體、雙抗體；疫苗體、線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。此類片 段可以通過已知技術產(chǎn)生。例如，F(xiàn) (ab')2片段可以通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生， 并且Fab片段可以通過還原F (ab')2片段的二硫鍵生成?；蛘?，可以構建Fab表達文庫， 以允許具有所需特異性的單克隆Fab片段的快速和簡單鑒定（Huse等人似:1275 (1989))。
[0046] 單克隆抗體可以是根據(jù)例如Reading的美國專利號4, 474, 893,或Cabilly等人的 美國專利號4, 816, 567中公開的方法產(chǎn)生的重組單克隆抗體。抗體還可以通過根據(jù)Segel 等人的美國專利號4, 676, 980中公開的方法制備的特異性抗體進行化學構建。
[0047] 單克隆Fab片段可以通過本領域技術人員已知的重組技術在大腸桿菌 中產(chǎn)生。參見例如，W. Huse，5bie/?ce 246:1275-81 (1989)。
[0048] 用于本發(fā)明的抗體以相對高的結合親和力與其靶特異性結合，例如具有約1(Γ6或 10'最高達ΚΓ12或ΚΓ 13的解離常數(shù)。
[0049] 其為ΙΑΡ與SHPS-1結合的拮抗劑的人源化單克隆抗體是本發(fā)明的進一步方面。本 發(fā)明的人源化抗體可以通過任何合適技術由如本文描述的抗體產(chǎn)生，使用如例如ΕΡ0公開 號0239400以及美國專利號6, 407, 213 ;6, 180, 370 ;和5, 693, 762中公開的常規(guī)互補決定 區(qū)（CDR)移植方法，其全部均以其整體通過引用并入本文?；蛘撸嗽椿贵w可以通過下述 產(chǎn)生：直接修飾抗體可變區(qū)，而不縮小結構域對于抗原的天然親和力，同時降低其關于異源 物種的免疫原性(參見例如，以其整體通過引用并入本文的美國專利號5, 766, 886)。
[0050] 使用⑶R移植方法，人源化抗體一般通過組合人構架區(qū)（FR)與來自非人(通常為 小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一個或多個CDR來產(chǎn)生，所述非人免疫球蛋白能夠與預定抗原結 合。
[0051] 通常，人源化抗體包含基本上全部至少一個且通常兩個可變結構域（Fab、Fab'、F (ab'）2、Fabc、Fv)，其中⑶R的全部或基本上全部對應于非人免疫球蛋白的那些，并且FR的 全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體最佳地還包含免疫球蛋白 恒定區(qū)（Fc)的至少一部分，通常為人免疫球蛋白的。通常，抗體含有輕鏈以及至少重鏈的 可變結構域?？贵w還可以包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CH4區(qū)。
[0052] 人源化抗體可以選自免疫球蛋白的任何種類，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及 任何同種型包括]^6 1、]^62、]^63和IgG4。通常，恒定結構域是補體固定恒定結構域，其中希 望人源化抗體顯示出細胞毒性活性，并且種類通常為Igh。當此類細胞毒性活性是不希望 的時，恒定結構域可以具有IgG2種類。人源化抗體可以包含來自超過一個種類或同種型的 序列，并且選擇特定恒定結構域以優(yōu)化所需效應子功能在本領域的普通技術內。
[0053] 人源化抗體的FR和CDR無需精確對應于親本序列。至少約75%的人源化抗體殘 基可以對應于親本FR和⑶R序列的那些，在一些實施方案中，約90%，并且在一些實施方案 中，大于約95%。
[0054] 本發(fā)明的抗體可以改變或突變用于與除在其中產(chǎn)生抗體的物種外的物種的相容 性。例如，抗體可以是人源化或駱駝化（camelized)的。人源化形式的非人(例如鼠）抗體 是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F (ab'）2或抗體的其他 抗原結合子序列)，其含有來源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括這樣的人 免疫球蛋白（受者抗體（recipient antibody))，其中來自受者的互補決定區(qū)（⑶R)的殘基 替換為來自非人物種(供者抗體（donor antibody))(例如小鼠、大鼠或兔）的CDR的具有 所需特異性、親和力和能力的殘基。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架殘基替換為相 應的非人殘基。人源化抗體還可以包含在受者抗體和輸入CDR或構架序列中均未發(fā)現(xiàn)的 殘基。通常，人源化抗體將包含基本上全部至少一個且通常兩個可變結構域，其中⑶R區(qū) 的全部或基本上全部對應于非人免疫球蛋白的那些，并且構架（FR)區(qū)（S卩，⑶R區(qū)之間的序 列）的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體最佳地還將包含免 疫球蛋白恒定區(qū)（Fc)的至少一部分，通常為人免疫球蛋白的（Jones等人，忽7 :522 (1986) ;Riechmann 等人323 (1988);和 Presta，^!//·/·· φ· 乂 之：593 (1992))。
[0055] 用于人源化非人抗體的方法是本領域眾所周知的。一般地，人源化抗體具有從非 人來源引入其內的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為"輸入"殘基， 其通常取自"輸入"可變結構域。通過用嚙齒類動物CDR或CDR序列取代人抗體的相應序 列，人源化可以基本上根據(jù)Winter和同事的方法實施（Jones等人，yVaiare :522( 1986); Riechmann 等人，323 (1988);Verhoeyen 等人,5^(9/7((9^^9:1534 (1988))。相 應地，此類"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利號4, 816, 567)，其中基本上小于一個完整的 人可變結構域已由來自非人物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體通常為這樣的人 抗體，其中一些CDR殘基(例如CDR的全部或其部分)和可能的一些FR殘基由來自嚙齒類動 物抗體中的類似位點的殘基取代。
[0056] 人抗體還可以使用本領域已知的多種技術產(chǎn)生，包括噬菌體展示文庫 (Hoogenboom 和 Winter，J #〇乂 忽廠:381 (1991) ;Marks 等人，/· #〇乂 乂 2泛:581 (1991))。Cole等人和Boerner等人的技術也可用于制備人單克隆抗體（Cole等 Α?Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,第 77 頁（1985)和 Boerner 等人，7； J遞2^7:86 (1991))。類似地，人抗體可以通過將人免疫球蛋白基因座引 入轉基因動物內進行制備，所述轉基因動物例如其中內源免疫球蛋白基因已部分或完全失 活的小鼠。在攻擊后，觀察到人抗體產(chǎn)生，其在所有方面緊密類似于在人中可見的，包括基 因重排、裝配和抗體譜。這種方法例如在美國專利號5, 545, 807 ;5, 545, 806 ;5, 569, 825 ; 5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;5, 661，016和下述科學出版物中描述：Marks等人，沿〇/7^&7〇/〇燈 70:779 (1992);Lonberg 等人，yVaiareJ你：856 (1994);Morrison，M?itfreJ你：812 (1994); Fishwild ^ Α? Nature Biotechnol. 14:845 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 74:826 (1996) ;Lonberg 和 Huszar, Jflier/?· TfeF. Immunol. 7J:65 (1995)。
[0057] 用于實施本發(fā)明的多克隆抗體可以依照已知程序通過下述產(chǎn)生：用抗原(針對靶 的單克隆抗體與之結合）免疫合適動物(例如兔、山羊等)，收集來自動物的免疫血清，且從 免疫血清中分離多克隆抗體。
[0058] 用于實施本發(fā)明的單克隆抗體可以根據(jù)Kohler和Milstein，Tfeiare ^^5:495 (1975)的技術在雜交瘤細胞系中產(chǎn)生。例如，含有適當抗原的溶液可以注射到小鼠內，并 且在足夠時間后，將小鼠處死且獲得脾細胞。脾細胞隨后通常在聚乙二醇的存在下，通過 使其與骨髓瘤細胞或與淋巴瘤細胞融合進行永生化，以產(chǎn)生雜交瘤細胞。雜交瘤細胞隨后 在合適培養(yǎng)基中生長，并且在上清液中篩選具有所需特異性的單克隆抗體。單克隆Fab片 段可以通過本領域技術人員已知的重組技術在大腸桿菌中產(chǎn)生。參見例如，Huse， 施：1275 (1989)。
[0059] 對于靶多肽特異性的抗體還可以通過本領域已知的噬菌體展示技術獲得。
[0060] 單克隆抗體可以是依照已知技術產(chǎn)生的嵌合或"人源化"抗體。例如，嵌合單克隆 抗體可以是依照已知技術產(chǎn)生的互補決定區(qū)-移植抗體(或"CDR移植抗體")。
[0061] 本發(fā)明的抗體的實例是單克隆抗體B6H12 (例如指定ATCC登記號HB-9771的 B6H12. 2)。
[0062] 本發(fā)明還提供了單克隆抗體，其特異性結合在人IAP蛋白質(編號基于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列)的氨基酸71-80內的表位，并且是IAP與SHPS-1結合的拮抗劑。例如， 抗體可以結合包含SEQ ID N0:7的氨基酸序列的氨基酸 71- 73, 71-74, 71-75, 71-76, 71^77, 71-78? 71-80, 72-74, 72-75? 72^76, 72- 77, 72?78; 72^79, 72-80, 73-75, 73-76, 73-77, 73^78, 73-79, 73^80, 74^76, 74-77f 74-78, 74-79? 74-80, 75-77, 75-78, 75-79, 75-80, 76*78, 76-79, 76^80, 77-79, 77- 80 或78-80的表位。
[0063] 本發(fā)明另外提供了由雜交瘤NPG-1產(chǎn)生并且在本文中被稱為單克隆抗體NPG-1的 單克隆抗體。這種雜交瘤根據(jù)如本領域眾所周知的用于單克隆抗體生產(chǎn)的標準方案產(chǎn)生。 施用于小鼠的免疫原是肽ALNKSTVPTDC (SEQ IDN0:10)，其代表如本文提供的人IAP氨基 酸序列的氨基酸殘基71-80 (編號基于SEQ ID N0:7的氨基酸序列）（即ALNKSTVPTD，SEQ ID NO: 6 )，具有在羧基末端處添加的半胱氨酸殘基，其用于使肽與匙孔槭血藍蛋白（KLH)連接。 因此，實際免疫原是通過半胱氨酸連接的活性肽和KLH的綴合物。將小鼠免疫接種且隨后 收獲脾用于與骨髓瘤細胞融合。使用與BSA連接的免疫原包被板，通過ELISA篩選骨髓瘤 細胞上清液。隨后在選擇產(chǎn)生高親和力抗體的最終克隆前，將陽性上清液再分開克隆四次。 關于人IAP的氨基酸編號基于GenBank?數(shù)據(jù)庫登記號NP_942088 (通過引用并入本文）的 參考氨基酸序列，并且如下，其中第一個氨基酸編號1，并且最后一個氨基酸編號305。氨基 酸殘基71-80在下文序列中是粗體。 MWPLVAALLL GSACCGSAQL LFNKTKSVEF TFCNDTVVIP CFVTNMEAQN TTEVYVKWKF KGRD1YTFD0 ALNKSTVPTD FSSAK1EVSQ LLKGIMSIXM DKSDAVSHTG NYTCEVTELT RECiETHELK YRVVSWFSPN ENIL1VIFP1 FAILLFWGQF (3IKTLKYRSG GMDEKT1ALL VAGLV1TVIVIV GAILFVPG EYSLKNATOL GLiVTSTGIL ll.LHYYVFST AIGLTSFVIA ILVIQVIAYI LAVVCLSLCI AACIPMHOPL IJSGLSILAL AQLLGLVYMK FVASNQKTIQ PPRNN (SEQ ?Μ NO:?).,
[0064] 在一些實施方案中，抗體是（a)由雜交瘤NPG-1產(chǎn)生的單克隆抗體，或（b)競爭結 合與由通過所述雜交瘤NPG-1產(chǎn)生的單克隆抗體結合的表位相同的表位的單克隆抗體（即 特異性結合由通過雜交瘤NPG-1產(chǎn)生的單克隆抗體結合的表位的單克隆抗體)。
[0065] 雜交瘤NPG-1于2012年8月17日由美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏于Manassas， Virginia,并且指定登記號PTA-13161。這種雜交瘤產(chǎn)生如本文描述的本發(fā)明的抗體。
[0066] 單克隆抗體NPG-1與人IAP蛋白質結合且破壞IAP與SHPS-1的結合，而不破壞 IAP與@3蛋白質的結合。@3整聯(lián)蛋白亞基是ανβ3整聯(lián)蛋白的組分。它在血管內皮細 胞的表面上豐富表達。破壞α νβ3整聯(lián)蛋白功能的試劑已顯示導致內皮細胞功能中的改變 以及內皮細胞生長的抑制。此外，因為這種整聯(lián)蛋白亞基在血小板上表達，所以已顯示抑制 其在血小板中的功能的試劑已顯示刺激血小板聚集，這可以導致血栓形成。這是這種單克 隆抗體的重要區(qū)別特點。與人ΙΑΡ反應的許多抗體還與α νβ 3整聯(lián)蛋白結合。破壞ΙΑΡ與 β 3的結合可以導致副作用，使得此類抗體的治療用途是不希望的。NPG-1抗體具有出乎意 料的益處：與人ΙΑΡ結合且破壞其與SHPS-1的結合，而不破壞ΙΑΡ與β 3的結合。
[0067] 本文進一步提供的是人源化單克隆抗體NPG-1。人源化形式的抗體可以使用體外 誘變進行制備。互補決定區(qū)（⑶R)保持完整，除非必須改變這些區(qū)的單個氨基酸，以避免或 最小化免疫原性。類似地，構架區(qū)就可能賦予免疫原性的區(qū)域進行掃描，并且將適當?shù)男∈?氨基酸殘基改變?yōu)槿税被釟埢?。隨后使用由來自20種HLA單倍型每一種的人HLA供體 制備的淋巴細胞，測定整個抗體的免疫原性。
[0068] 多種免疫測定可以用于篩選，以鑒定對于本發(fā)明的多肽具有所需特異性的抗體。 競爭結合或者使用具有確定特異性的多克隆或單克隆抗體的免疫放射測定的眾多方案是 本領域眾所周知的。此類免疫測定通常涉及抗原及其特異性抗體之間的復合物形成(例如 抗原/抗體復合物形成)的測量?？梢允褂秒p位點、基于單克隆的免疫測定以及競爭結合測 定，所述免疫測定利用與本發(fā)明的多肽或肽上的兩個非干擾表位反應的單克隆抗體。
[0069] 抗體可以依照已知技術綴合至固體載體(例如由諸如膠乳或聚苯乙烯的材料形成 的珠、板、載玻片或孔)?？贵w可以同樣依照已知技術綴合至可檢測基團，例如放射性標記 (例如353、 1251、1311)、酶標記(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶）和熒光標記(例如熒光素)。 如本領域眾所周知的，在本發(fā)明的方法中抗體/抗原復合物形成的測定可以是通過例如沉 淀、凝集、絮凝、放射性、顯色或變色、熒光、發(fā)光等的檢測。
[0070] 在多個實施方案中，本發(fā)明的抗體是與ΙΑΡ特異性結合的抗體或其片段(例如單 克隆抗體)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體是與SHPS-1特異性結合的抗體或其片段(例 如單克隆抗體)。
[0071] 在一個實施方案中，抗體是由雜交瘤細胞系NPG-1 (ATCC保藏號PTA-13161 ;于 2012年8月17日保藏)產(chǎn)生的單克隆抗體。在進一步的實施方案中，抗體是單克隆抗體或 其片段，其競爭結合由通過雜交瘤細胞系NPG-1 (ATCC保藏號PTA-13161 ;于2012年8月 17日保藏）產(chǎn)生的單克隆抗體特異性結合的相同表位。在另一個實施方案中，抗體是單克 隆抗體或其片段，其特異性結合由通過雜交瘤細胞系NPG-1 (ATCC保藏號PTA-13161 ;于 2012年8月17日保藏)產(chǎn)生的單克隆抗體特異性結合的相同表位。在某些實施方案中，單 克隆抗體或其片段是嵌合抗體或人源化抗體。在另外的實施方案中，嵌合或人源化抗體包 含NPG-1 (ATCC保藏號PTA-13161 ;于2012年8月17日保藏)的至少一部分。如本文使用 的，⑶R的"部分"定義為來自構成⑶R (例如來自⑶R的1-6)的輕鏈和重鏈每一個的三個 環(huán)中的一個或多個，或包含至少三個鄰接氨基酸、基本上由至少三個鄰接氨基酸組成或由 至少三個鄰接氨基酸組成的環(huán)的一個或多個部分。例如，嵌合或人源化抗體可以包含1、2、 3、4、5或6個⑶R環(huán)，1、2、3、4、5或6個⑶R環(huán)的部分，或其混合物。
[0072] B.蛋白質/肽拮抗劑及其他拮抗劑。
[0073] IAP的氨基末端Ig結構域和SHPS-1的胞外Ig可變結構域對于其物理相互作用 是足夠的，并且這些區(qū)可以充當IAP與SHPS-1結合的蛋白質或肽拮抗劑。因此，本發(fā)明的 進一步方面是活性劑，其為包含IAP的SHPS-1結合結構域(例如IAP片段；IAP的氨基末端 Ig結構域)、由其組成或基本上由其組成的蛋白質或肽。具體實例包括但不限于由小鼠 IAP 的氨基酸1-140組成的多肽；由小鼠 IAP的氨基酸1-135組成的多肽；由小鼠 IAP的氨基 酸5-135組成的多肽；由小鼠 IAP的氨基酸5-95組成的多肽；由小鼠 IAP的氨基酸19-95 組成的多肽；由小鼠 IAP的氨基酸1-140組成的多肽；由大鼠 IAP的氨基酸1-135組成的 多肽；由大鼠 IAP的氨基酸5-135組成的多肽；由大鼠 IAP的氨基酸5-95組成的肽；由大 鼠 IAP的氨基酸19-95組成的多肽；由人IAP的氨基酸1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、 1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、1-120、1-130、1-135 和 / 或 1-140 組成 的肽；由人 IAP 的氨基酸 5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-60、5-70、5-80、 5-95、5-100、5-110、5-120和/或5-135組成的肽；由人^^的10-20、10-30、10-35、10-40、 10-45、10-50、10-60、10-70、10-80、10-95、10-100、10-110、10-120 和 / 或 10-135 組成的肽； 由人 IAP 的氨基酸 19-30、19-35、19-40、19-45、19-50、19-60、19-70、19-80、19-95、19-100、 19-110、19-120 和 / 或 19-135 組成的肽，和由人 IAP 的氨基酸 30-50、30-60、30-70、30-80、 30-90、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-60、50-70、50-60、60-70、60-80、 70-80、80-90、70-90、50-80、50-90和/或50-100組成的肽。本文還提供的是本發(fā)明的抗 體，其特異性結合本文描述的任何IAP肽和/或在任何IAP肽內的表位。
[0074] 小鼠、人和大鼠 IAP如上所述均為已知的，并且本文編號指對全長蛋白質中的 氨基酸殘基指定的標準編號。關于人IAP的氨基酸編號基于GenBank?數(shù)據(jù)庫登記號 NP_942088 (通過引用并入本文）的參考氨基酸序列，并且如下，其中第一個氨基酸編號1， 并且最后一個氨基酸編號305 : MWPI.VAALLL C3SACCGSAQL LFNKTKSVEF TfCNDTVVIP CFVTMMEAQN TTEVYVKWKf KGRD1YTFDG ALNKSTVPTD FSSAK1EVSQ LLKGDASLKM DKSDAVSHTG NYTCEVTELT REGET1IEJ,K YRWSWFSPN ENILIVIFPI l;AILU:WG〇f GIKTLKYRSG GMDEKTIALL VAGLV1TVIVIV GAILFVPCi EYSLKLNATGL GLIVTSTC1L ILLHYYVFST A1C1LTSFVIA ILVIQVJAYI LA V VG LSIXI A AC 1P M HGPL LISGLSILAL AQLLGLVYMK FVASNQKTIQ Pi?RNN(SEQ[DNO:7).-.
[0075] 在一些實施方案中，IAP肽可以包含下述、基本上由下述組成或由下述 組成：具有氨基酸序列 FVTNMEAQNTTEVYKWK (aa 42-59, SEQ ID N0:11)的肽、具 有氨基酸序列KWKFKGRWYTFDGALNK (aa 57-74, SEQ ID NO: 12)的肽、具有氨基酸 序列 STVPTDFSSAKIEVSQLLK⑶（aa 75-95, SEQ ID N0:13)的肽、具有氨基酸序列 YTFDGALNKSTVPTDFS (aa 66-92, SEQ ID N0:14)的肽及其任何組合。
[0076] 本發(fā)明的還進一步方面是活性劑，其為包含SHPS-1的IAP結合結構域(例如 SHPS-1片段；SHPS-1的胞外Ig可變結構域)、由其組成或基本上由其組成的蛋白質或肽。
[0077] 具體實例包括但不限于由小鼠 SHPS-1的氨基酸1-160組成的多肽；由小鼠 SHPS-1的氨基酸5-150組成的多肽；由小鼠 SHPS-1的氨基酸29-150組成的多肽；由大 鼠 SHPS-1的氨基酸1-160組成的多肽；由大鼠 SHPS-1的氨基酸5-150組成的多肽；由大 鼠 SHPS-1的氨基酸29-150組成的多肽；由人SHPS-1的氨基酸1-10、1-15、1-20、1-25、 1-30、1-35、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、1-120、1-130、1-135 和 / 或 1-140 組成的肽；由人 SHPS-1 的氨基酸 5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、 5-60、5-70、5-80、5-95、5-100、5-110、5-120 和 / 或 5-135 組成的肽；由人 SHPS-1 的 10-20、 10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-60、10-70、10-80、10-95、10-100、10-110、10-120 和 / 或 10-135 組成的肽；由人 SHPS-1 的氨基酸 19-30、19-35、19-40、19-45、19-50、19-60、 19-70、19-80、19-95、19-100、19-110、19-120 和 / 或 19-135 組成的肽；由人 SHPS-1 的氨 基酸 30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-60、 50-70、50-80、50-90 和 / 或 50-100 組成的肽，和由人 SHPS-1 的氨基酸 100-120、100-130、 100-140、100-150、120-140、120-130、120-150、130-140 和 / 或 130-150 組成的肽。本文還 提供的是本發(fā)明的抗體，其特異性結合本文描述的任何SHPS-1肽和/或在任何SHPS-1肽 內的表位。
[0078] 小鼠、人和大鼠 SHPS-1如上所述均為已知的，并且本文編號指對全長蛋白質中的 氨基酸殘基指定的標準編號。關于人SHPS-1的氨基酸編號基于GenBank?數(shù)據(jù)庫登記號 BAA12974 (通過引用并入本文）的參考氨基酸序列，并且如下，其中第一個氨基酸編號1，并 且最后一個氨基酸編號503 : MEPAOPAPGR LGPLLCLLLA ASCAWSGVAG EEELQVIQPD KSVSVAAGES AILHCTYTSL IPVGPIQWFR CiAGPARELIY NQKEGHFPRV TTVSESTKRE NMDFSIS1SN ITPADAC+Π?Υ CVKFRKCjSH) TEFKSGAGTE LSVRAKPSAP VVSGPAARAT PQIITVSFTCE SHGPSPRDIT LKWFKNONiSl. SDFQTNVDPV OESVSYSIHS TAKWLTREE) VHSQV1CEVA HVTLQGDPLR GTANLSETIR VPPTLEVTQQ PVRAENQVNV I'CQVRKFYPQ RLQLTWLCNG NVSRTETAST VTENKDGTYN WMSWLLVNVS AHRDDVKLTC QVEHDGQPAV SKSHDLKVSA HPKEQGSNTA AENTGSNERM fYIVVGWCT LLVAI.LMAAI, YLVRm〇IOCA QQSTSSTRLH EPEKNAREH' QDTNDITYAD LHLPKGKKPA PQAAEPNNHT EYASIQTSPQ PASEDTLTYA DLDMVI1LNRT PKQPAPKPEP SFSEYASVQV PRK (SEQ ID NO:lS)〇
[0079] 在一些實施方案中，SHPS-1肽可以包含下述、基本上由下述組成或由下述組成： 具有氨基酸序列RELIYNQKEGHFPRVTTVS (aa76-93, SEQ ID N0:16)的肽、具有氨基酸序列 VTSLIPVGPIQWFRG (aa57-71，SEQ ID N0:17)的肽、具有氨基酸序列 VKFRKGSP (aa 122-129， SEQ ID NO: 18)的肽及其任何組合。
[0080] 可以充當活性劑的IAP和SHPS-1片段包括其類似物。"類似物"是這樣的化學化 合物，其在結構中與第一化合物相似，并且具有與第一化合物相似或相反的生理學作用。具 體參考本發(fā)明，肽類似物是這樣的化合物，其雖然不具有相應蛋白質或肽的氨基酸序列，但 能夠拮抗IAP與SHPS-1結合。此類類似物可以是肽或非肽類似物，包括但不限于核酸類似 物，如下文進一步詳細描述的。
[0081] 在與受體(例如在IAP或SHPS-1上)相互作用的蛋白質或肽分子中，在蛋白質或肽 和受體之間的相互作用一般在穩(wěn)定的三維分子中的表面可接近位點處發(fā)生。通過將關鍵結 合位點殘基安排在合適構象中，模擬本文描述的肽的基本表面特點的肽類似物可以依照已 知技術生成且合成。用于測定肽三維結構的方法和關于其的類似物是已知的，并且有時被 稱為"合理藥物設計技術"。參見例如Geysen的美國專利號4, 833, 092 ;Nest〇r的美國專 利號 4, 859, 765 ;Pantoliano 的美國專利號 4, 853, 871 ;Blalock 的美國專利號 4, 863, 857 ; ( 申請人:特別旨在本文引用的所有美國專利參考文獻的公開內容均以其整體通過引用并入 本文）。還參見 Waldrop，5bi<9/?c<9 247,28029 (1990) ;Rossmann，7feitfr<9 333,392 (1988); Weis 等人，yVaiare 333,426 (1988) James 等人，260,1937 (1993)(基于四肽配 體的結構和功能的苯二氮卓擬肽化合物的開發(fā))。
[0082] 一般而言，本領域技術人員將知道可以對本發(fā)明的蛋白質或肽的氨基酸序列作出 較小缺失或取代，而不會過度不利影響其活性。因此，含有此類缺失或取代的肽是本發(fā)明 的進一步方面。在含有氨基酸取代或替換的肽中，肽序列的一個或多個氨基酸可以替換為 一個或多個其他氨基酸，其中此類替換不影響該序列的功能。此類改變可以通過氨基酸之 間在物理特點中的已知相似性加以指導，所述物理特點例如電荷密度、疏水性/親水性、大 小和構型，使得氨基酸由具有基本上相同的功能性質的其他氨基酸取代。例如：Ala可以由 Val或Ser替換；Val可以由Ala、Leu、Met或lie,優(yōu)選Ala或Leu替換；Leu可以由Ala、 Val或lie,優(yōu)選Val或lie替換；Gly可以由Pro或Cys，優(yōu)選Pro替換；Pro可以由Gly、 Cys、Ser 或 Met,優(yōu)選 Gly、Cys 或 Ser 替換；Cys 可以由 Gly、Pro、Ser 或 Met,優(yōu)選 Pro 或 Met替換；Met可以由Pro或Cys，優(yōu)選Cys替換；His可以由Phe或Gln，優(yōu)選Phe替換；Phe 可以由His、Tyr或Trp，優(yōu)選His或Tyr替換；Tyr可以由His、Phe或Trp，優(yōu)選Phe或Trp 替換；Trp可以由Phe或Tyr，優(yōu)選Tyr替換；Asn可以由Gin或Ser，優(yōu)選Gin替換；Gin可 以由 His、Lys、Glu、Asn 或 Ser,優(yōu)選 Asn 或 Ser 替換；Ser 可以由 Gln、Thr、Pro、Cys 或 Ala 替換；Thr可以由Gin或Ser，優(yōu)選Ser替換；Lys可以由Gin或Arg替換；Arg可以由Lys、 Asp或Glu，優(yōu)選Lys或Asp替換；Asp可以由Lys、Arg或Glu，優(yōu)選Arg或Glu替換；并且 Glu可以由Arg或Asp，優(yōu)選Asp替換。一旦制備，就可以照常規(guī)篩選改變，以測定其對酶功 能的作用。
[0083] 本發(fā)明的蛋白質或肽的非肽模擬物（即非肽IAP與SHPS-1結合拮抗劑）也是本 發(fā)明的方面。非蛋白質模擬物可以依照已知技術生成，例如使用計算機圖形建模以設計能 夠拮抗IAP與SHPS-1結合的非肽有機分子。參見例如，Knight，8:105 (1990) ;Itzstein等人yVaiare 363:418 (1993)(流感病毒酶、唾液酸酶的擬肽抑制劑)。 Itzstein等人yVaiare 363:418 (1993)使用來自X射線晶體學研究的數(shù)據(jù)建模唾液酸酶 受體蛋白質的晶體結構，并且開發(fā)將附著至模型的活性位點的抑制劑；用于建模的核磁共 振（NMR)數(shù)據(jù)的使用也是本領域已知的，并且此類技術可以用于實施本發(fā)明。關于生物可 用的非肽環(huán)脲(其充當HIV蛋白酶抑制劑）的合理設計，還參見Lam等人263:380 (1994)。Lam等人使用來自HIV蛋白酶抑制劑復合物的X射線晶體結構研究的信息，以設計 非肽抑制劑。
[0084] 類似物或拮抗劑還可以通過利用化合物文庫的高流通量篩選進行開發(fā)，如下文進 一步詳細討論的。應當指出此類化合物文庫可以是完全隨機的文庫，或者基于信息生成和 /或選擇的文庫，所述信息基于如上所述的抗體活性劑、IAP片段活性劑或SHPS-1片段活性 劑。
[0085] 可以用于實施本發(fā)明的前述的拮抗劑或類似物還可以通過下述開發(fā)：生成分子 文庫，選擇充當拮抗劑的那些分子，并且鑒定且擴增所選拮抗劑。參見例如，Kohl等人 Sbimce 260:1934 (1993)(法呢基蛋白質轉移酶的抑制劑的四肽的合成和篩選，以抑制 ras癌蛋白依賴性細胞轉化)。Eldred等人〇； ifei/ae?· 37:3882 (1994))描述了模擬 Arg-Gly-Asp序列的非肽拮抗劑。同樣地，Ku等人(7； 38:9 (1995))進一步舉 例說明了一系列此類化合物的合成。用于構建且篩選寡聚生物分子的組合文庫以鑒定與給 定受體蛋白質特異性結合的那些的技術是已知的。合適的寡聚物包括肽、寡核苷酸、碳水化 合物、非寡核苷酸(例如硫代磷酸酯寡核苷酸；參見CXe?. ?，第20頁， 1994年2月7日)和非肽聚合物(參見例如，Simon等人他以.JcatZ 5bi."別89:9367 (1992)的"類肽（p印toids)")。還參見 Schatz 的美國專利號 5, 270, 170 ;Scott 和 Smith, 249:386-390 (1990);Devlin 等人249:404406 (1990);Edgington，沒/〇/ 11:285(1993)。肽文庫可以在固體載體上合成，或在細菌噬菌體病毒(噬菌體 展示文庫）的表面上表達。已知篩選方法可以由本領域技術人員使用，以篩選組合文庫以 鑒定拮抗劑。這樣的技術是本領域已知的，其用于篩選合成的分子以選擇具有所需活性的 那些，且用于標記文庫的成員，使得可以鑒定所選活性分子。參見例如，Brenner和Lerner， /￥oc.他以.JcatZ 5bi. ?/說89:5381 (1992)(使用遺傳標簽以標記組合文庫中的分子）； Berger等人的PCT US93/06948 (使用由病毒反式激活元件轉化的重組細胞，以篩選能夠 抑制病毒轉錄起始的潛在抗病毒分子）；Simon等人yVai/. XcatZ 5bi. 89:9367 (1992)(生成和篩選"類肽"，寡聚N取代甘氨酸，以鑒定生物學受體的配體）；Fields等人 的美國專利號5, 283, 173 (使用遺傳改變的釀酒酵母cererisiae)，以就相 互作用篩選肽)。
[0086] 如本文使用的，"組合文庫"指不同序列的多種寡聚生物分子的集合，其可以同時 篩選作為特定靶的配體的活性。組合文庫還可以被稱為"形狀文庫（shape libraries)"，即 其為潛在配體的隨機化的聚合物群體。分子的形狀指支配其與其他分子的相互作用的那些 分子特點，包括范德華（Van der Waals)、疏水、靜電和動態(tài)的?？梢耘c此類文庫結合使用的 篩選程序在下文更詳細地討論。
[0087] C.制劑和施用。
[0088] 對于施用，本發(fā)明的活性劑(例如抗體或其抗原結合片段）一般將在施用前與無 毒的藥學上可接受的載體物質(例如生理鹽水或磷酸緩沖鹽溶液）混合，并且將使用任何 醫(yī)學上合適的程序例如諸如經(jīng)由靜脈內或動脈內注射的腸胃外施用（例如注射）進行施 用。在一些實施方案中，施用可以是通過注射到眼內（例如眼內、視網(wǎng)膜內和/或內臟內 (intravisceral)注射)。在一些實施方案中，施用可以通過直接注射到治療部位內，例如直 接注射到腫瘤內。在一些實施方案中，本發(fā)明的活性劑可以連接到或綴合至載體(例如聚乙 二醇)，以改變活性劑的半衰期或其他性質。
[0089] 上文描述的活性劑可以依照已知技術配制用于在藥物載體中施用。參見例如， Remington，?e (第 9 版 1995)。在根據(jù)本發(fā)明的藥物制 劑的制造中，活性化合物(包括其生理學上可接受的鹽）通常尤其與可接受的載體混合。載 體當然必須在與制劑中的任何其他成分相容的意義上是可接受的，并且必須對患者是無害 的。載體可以是液體并且優(yōu)選與化合物一起配制為單位劑量制劑，其可以含有〇. 01或〇. 5 重量％至95重量％或99重量％的活性化合物。
[0090] 本發(fā)明適合于腸胃外施用的制劑包含活性化合物的無菌含水和非含水注射溶液， 所述制劑優(yōu)選與預期接受者的血液等滲。這些制劑可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶 質，其致使制劑與預期接受者的血液等滲。
[0091] 活性劑可以通過任何醫(yī)學上合適的程序例如正常靜脈內或動脈內施用進行施用。 在某些情況下，可能希望對動脈粥樣硬化血管的直接施用。
[0092] 活性劑可以以在滅菌的無菌容器中的凍干形式提供，或可以在與藥學上可接受的 載體組合的藥物制劑中提供，所述藥學上可接受的載體例如滅菌無熱原水或滅菌無熱原生 理鹽水溶液。
[0093] 其中，活性劑的劑量將依賴個體的病況、待治療病癥或癌癥的特定類別或類型、施 用途徑、采用的治療劑的性質、和腫瘤對特定治療劑的敏感性。例如，劑量范圍可以是約 0. 02至約5000微克/千克個體體重。本發(fā)明的抗體或其抗原片段的具體劑量不是關鍵的， 只要它有效導致在受疾病侵襲群體內的一些個人中的一些有益效應。在一些實施方案中， 劑量可以低至約〇. 02、0. 05、0. 1、0. 5、1、5、10、20或50微克/千克個體體重，或更低，并且 高至約 60、75、90、100、250、500、1000、2000、3000、4000 或 5000 微克 / 千克個體體重，或甚 至更高。
[0094] 本發(fā)明的活性劑可以任選與其他不同的細胞毒素劑結合施用，所述細胞毒素劑例 如在本文描述的病癥或病況的治療中有用的化學治療或抗腫瘤化合物或放射療法(例如化 學治療劑或抗腫瘤化合物)。其他化合物可以并行施用。如本文使用的，單詞"并行"意指 在時間上足夠緊密以產(chǎn)生組合效應（即，并行可以是同時，或它可以是在彼此之前或之后發(fā) 生的兩次或更多次施用）。如本文使用的，短語"放射療法"包括但不限于X射線或Y射 線，其從外部應用的源例如束或通過小型放射性源的植入來釋放。可以與如本文描述的 活性劑并行施用的其他合適的化學治療劑的實例包括但不限于：烷化劑(包括但不限于氮 芥類（nitrogen mustards)、氮丙陡衍生物、燒基磺酸鹽、亞硝脲類和三氮烯）：尿啼陡氮芥、 氮芥（Chlormethine)、環(huán)磷酰胺（Cytoxan?)、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、 三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星、達卡巴嗪和替 莫唑胺；抗代謝物(包括但不限于葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物和腺苷脫氨酶抑制 齊IJ):甲氨蝶呤、5-氟尿嘧陡、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱、噴 司他?。≒entostatine)和吉西他濱；天然產(chǎn)物及其衍生物(例如長春花生物堿、抗腫瘤抗 生素、酶、淋巴因子和表鬼白毒素）：長春堿、長春新堿、長春地辛、博來霉素、更生霉素、柔紅 霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、阿糖胞苷、紫杉醇(紫杉醇作為Taxol?商購可得)、光 輝霉素、脫氧柯福霉素、絲裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、干擾素類(尤其是IFN-a)、依托泊苷 和替尼泊苷；其他抗增殖細胞毒素劑是諾維本（navelbene)、伊立替康（CPT-11 )、阿那曲唑 (anastrazole)、來曲唑（letrazole)、卡培他濱、雷洛昔芬（reloxafine)、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷 酰胺和屈洛昔芬（dro 1 oxafine )。
[0095] 另外的抗增殖細胞毒素劑包括但不限于美法侖、六甲基三聚氰胺、噻替 派（thiotepa)、阿糖胞苷（cytarabin)、依達曲沙（idatrexate)、三甲曲沙、達卡巴 嗪、L-天冬酰胺酶、喜樹堿、托泊替康、比卡魯胺、氟他胺、亮丙瑞林、吡啶并苯并吲哚 (pyridobenzoindole)衍生物、干擾素和白細胞介素。優(yōu)選抗增殖細胞毒素劑種類是EGFR 抑制劑、Her-2抑制劑、⑶K抑制劑和Herceptin? (曲妥珠單抗)。（參見例如美國專利號 6, 537, 988 ;美國專利號6, 420, 377)。此類化合物可以依照目前已知用于其施用的技術給 予。
[0096] D.篩選程序。
[0097] 如上所述，本發(fā)明提供了篩選程序，其可以單獨利用或與關于上述多種活性劑的 信息組合利用，以生產(chǎn)還另外的活性劑。
[0098] 例如，如本文描述的，活性劑還可以這樣開發(fā)，通過生成分子文庫，選擇充當關于 指定靶的配體的那些分子，并且鑒定且擴增所選配體。
[0099] 核酸分子還可以充當關于受體蛋白質的配體。參見例如，Edgington，似6/ 11:285(1993)。Gold和Tuerk的美國專利號5, 270, 163描述了通過從具有隨 機化序列的RNA分子文庫中選擇與靶分子特異性結合的那些分子，用于鑒定關于給定靶分 子的核酸配體的方法。用于與特定肽免疫學交叉反應的RNA分子的體外選擇的方法公開于 Tsai，Kenan 和 Keene，5bi. 89:8864 (1992)以及 Tsai 和 Keene， 7； 150:1137 (1993)中。在該方法中，針對肽生成的抗血清用于從RNA分子文 庫中選擇RNA分子；所選RNA分子和肽競爭抗體結合，指示RNA表位充當抗體-抗原相互作 用的特異性抑制劑。
[0100] 如上所述，如所述的潛在活性劑或候選化合物可以就下述中的活性進行容易地篩 選：0抑制經(jīng)由胰島素樣生長因子-I的細胞活化(例如，抑制經(jīng)由IGF-1的細胞生長)， Γ?)治療癌癥或腫瘤(如上所述)，和/或（iii)治療動脈粥樣硬化(如上所述）和/或糖尿 病神經(jīng)病變和/或視網(wǎng)膜病變和/或特征在于IGF-1誘導的細胞增殖的任何其他不希望有 的病癥。該方法包括步驟：（a)將測試化合物加入體外系統(tǒng)或使測試化合物與體外系統(tǒng)接 觸，所述體外系統(tǒng)包含SHPS-1蛋白質和IAP蛋白質(這個術語包括其足以與其他結合的結 合片段）;隨后（b)測定測試化合物是否是IAP與SHPS-1結合的拮抗劑；并且隨后（c)當測 試化合物是IAP與SHPS-1結合的拮抗劑時，將測試化合物鑒定為在下述活性中是有活性或 潛在有活性的抑制經(jīng)由胰島素樣生長因子-1的細胞活化，Γ?)治療癌癥或腫瘤，和/ 或(iii)治療動脈粥樣硬化(或特征在于IGF-1誘導的細胞增殖的其他病癥)。體外系統(tǒng)可 以以任何合適的形式，例如表達SHPS-1蛋白質和IAP蛋白質的細胞。在替代形式中，體外 系統(tǒng)可以是無細胞系統(tǒng)，例如SHPS-1和IAP或其結合片段的含水制劑。接觸、測定和鑒定 步驟可以以任何合適的方式進行，所述方式例如手動、半自動或通過高通量篩選儀器。測定 步驟可以通過任何合適的技術進行，所述技術例如通過沉淀、通過用可檢測基團例如放射 性基團標記片段之一等，其所有均可以依照本領域技術人員眾所周知的程序進行。
[0101] 本發(fā)明在下述非限制性實施例中更詳細地說明，其中使用下述縮寫：達爾伯克改 良培養(yǎng)基（DMEM-H)、胎牛血清（FBS)、胰島素樣生長因子-I (IGF-1)、IGF-1受體（IGF-1R)、 免疫球蛋白（Ig)、整聯(lián)蛋白相關蛋白質（IAP)、無血清培養(yǎng)基（SFM)、平滑肌細胞（SMC)、含 有Src同源區(qū)2結構域的蛋白質酪氨酸磷酸酶底物1 (SHPS-1)、含有src同源區(qū)2的蛋白 質酪氨酸磷酸酶-2 (SHP-2)。
[0102] 實施例1 整聯(lián)蛋白相關蛋白質和SHPS-1之間的結合調節(jié)血管平滑肌細胞中的IGF-1受體信號 傳遞 胰島素樣生長因子-I (IGF-1)是平滑肌細胞（SMC)遷移和增殖的有效刺激物（Jones 等人?/說93:2482-7 (1996))。越來越多的證據(jù)顯示IGF-1起始胞內 信號傳遞的能力不僅由其與其自身跨膜受體的結合調節(jié)，還由其他跨膜蛋白質例如《VB3 整聯(lián)蛋白調節(jié)（Β· Zheng 和 D. 95:11217-22 (1998) ;L. Maile 和 D. Clemmons/沿277:8955-60 (2002))、整聯(lián)蛋白相關蛋白質（IAP (L. Maile等人/歷277:1800-5 (2002)))和含有Src同源區(qū)2結構域的蛋白質酪氨 酸磷酸酶底物1 (SHPS-1) (Maile和Clemmons，同上)。
[0103] SHPS-1鑒定為酪氨酸磷酸化蛋白質，其與v-SRC轉化的成纖維細胞（T. Noguchi 等人/沿〇7泛￡? 271:27652-8 (1996))和胰島素刺激的中國倉鼠卵巢細胞（Y. Fujioka等 人#〇/ 沿〇/ 16:6887-99 (1996))中的SHP-2結合。SHPS-1的細胞質區(qū)含有2個基 于免疫受體酪氨酸的抑制基序（A. Kharitonenkov等人yVaiare 386:181-6 (1997))，其響 應多種促有絲分裂刺激(參見例如，M. Stofega等人/沿273:7112-7 (1998))和整 聯(lián)蛋白介導的細胞附著(參見例如，T. Takada等人/沿o/CXe? 273:9234-42 (1998))而磷 酸化。這種磷酸化生成用于Src同源區(qū)2結構域酪氨酸磷酸酶（SHP-2)的募集和活化的結 合位點，其依次又使SHPS-1去磷酸化。
[0104] 在穩(wěn)定附著的平滑肌細胞（SMC)中，SHP-2位于接近于細胞膜的位點，在IGF-1 刺激的SHPS-1磷酸化后，它在其中轉移到SHPS-1 (L. Maile和D. Clemmons /沿CXe? 277:8955-60(2002))。這種SHP-2募集隨后為SHPS-1的去磷酸化和SHP-2轉移至IGF-1R， 在其中它隨后使這種底物去磷酸化。SHPS-1磷酸化在調節(jié)IGF-1R去磷酸化中的重要性在 表達截短形式的SHPS-1的細胞中加以證實，在所述截短形式的SHPS-1中，SHP-2結合位點 已被缺失。在這些細胞中，SHP-2至SHPS-1和IGF-1R的轉移被阻斷，并且兩種分子的持續(xù) 磷酸化是顯而易見的。
[0105] IAP 首先通過其與 κ\?3 結合（E. Brown 等人/CfeB 沿·〇/ 111 :2785-94( 1990))和 增加整聯(lián)蛋白對于其配體的親和力（E. Brown等人，/化#沿W 111:2785-94 (1990))的 能力得到鑒定。IAP由下述組成：N末端(胞外)Ig可變型結構域，隨后為五個跨膜疏水螺旋 和胞質尾區(qū)（C. Rosales 等人遞149:2759-64 (1992) ;D. Cooper 等人 AcadSci USA 92:3978-82 (1995))〇
[0106] IAP 已顯示結合 SHPS-1 (P. Jiang 等人/沿CXe? 274:559-62 (1999) ;P. Oldenborg 等人288:2051-4(2000);M. Seiffert 等人財94:3633-43(1999); E. Vernon-Wilson 等人，及/r/J遞30:2130-2137 (2000) ;H. Yoshida 等人/J遞 168:3213-20 (2002);I. Babic 等人，//遞164:3652-8 (2000))。IAP 的氨基末端 Ig 結構域和SHPS-1的胞外Ig可變結構域對于其物理相互作用是足夠的。IAP與SHPS-1結合 對生長因子刺激的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集的作用仍未得到報道。這些研究的目的是 測定IAP與SHPS-1結合對IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化和后續(xù)SHP-2募集的作用，和研究 這如何改變IGF-1R依賴性SMC作用。
[0107] 實驗程序。
[0108] 人 IGF-1 得自 Genentech (South San Francisco，CA，USA);聚二氟乙烯膜 (IMM0BIL0NP?)購自 Millipore Corporation (Bedford，MA，USA)。放射自顯影膠片得自 Eastman Kodak (Rochester, NY, USA)。胎牛血清、達爾伯克改良培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素 購自 Life Technologies, (Grand Island，NY，USA)。IGF-1R β 鏈抗體和單克隆憐酸酪氨 酸抗體（？￥99)購自33拉3〇1^(53拉3〇1^，04，化4)。多克隆5即-2和5即5-1抗體購自 Transduction Laboratories (Lexington，KY，USA)。針對ΙΑΡ 的單克隆抗體 Β6Η12 由購自 美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)的B細胞雜交物（B cell hybrid)純化，并且抗FLAG單克 隆抗體購自Sigma Chemical Company (St Louis,M0，USA)。針對雙重磷酸化(活性）形式的 p42/p44 MAP激酶（MAPK)的抗體和針對總p42/p44 MAPK蛋白質的抗體購自Cell Signaling Technology(Beverley，MA，USA)。除非另有說明，否則所有其他試劑均購自Sigma Chemical Company (St Louis，M0, USA)。
[0109] 豬主動脈 SMC (pSMC)如先前描述的（A. Gockerman 等人 136:4168-73 (1995))分離，并且維持在 10cm 組織培養(yǎng)板（Falcon Laboratory，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中的達爾伯克改良培養(yǎng)基中，所述達爾伯克改良培養(yǎng)基補充有葡萄糖（4.5 gm/ 升)、青霉素（1〇〇單位/ml)、鏈霉素（lOOPg/ml) (DMEM-H)和10%胎牛血清（FBS)。使用在 第5到16代之間的細胞。
[0110] 表達載體的生成 具有C末端FLAG表位的全長豬IAP (IAPfl)。通過RT-PCR從⑶R文庫中克隆全 長豬ΙΑΡ，所述cDNA文庫已來源于已如先前描述的（A. Gockerman等人 136:4168-73 (1995))分離的 pSMC。5' 引物序列 5'ATGTGGCCCTGGTGGTC (SEQ ID N0:1)對 應于豬序列的核苷酸121-139。3'引物序列與核苷酸1005-1030互補，具有編碼FLAG序列 的堿基(加下劃線的）和終止密碼子的添加。序列為： 5, Tf:ATTT?TCCiTCyrrCGTC丁T+rGTACjrCGCiTTOTATAG'rCr 3* (SEQ ID NO:B。
[0111] 在測序后，將 cDNA 克隆到 pcDNA V5 his 3· 1 載體（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA) 內。
[0112] 具有在殘基135處的胞外結構域截短且含有C末端FLAG表位的IAP (IAPcyto)。 將含有IAPf 1 cDNA序列的pcDNA V5 his 3. 1載體線性化，并且通過使用PCR生成突變型 IAP，使用編碼堿基 527-556 的 5' 寡核苷酸（5, TCTCCAAATGAAAAATCCTCATTGTTATT 3'）（SEQ ID NO:3)和用于生成IAPfl的相同3'寡核苷酸。將PCR產(chǎn)物克隆到pcDNA V5 his 3.1內。
[0113] 其中半胱氨酸33和261由絲氨酸殘基取代的含有C末端FLAG表位的IAP (IAPc-s)。將IAPfl cDNA亞克隆到pRcRSV表達載體內，并且它用作模板以實施單鏈誘 變，以摻入兩個取代。pRcRSV載體含有新霉素衍生物（G418)抗性基因和細菌噬菌體復制 起點（F1)基因，其允許cDNA的直接單鏈誘變。使用編碼堿基取代的兩條寡核苷酸。它 們?yōu)椋篊33S :除了堿基取代以編碼絲氨酸(加下劃線的）之外與核苷酸204-225互補5' GTAACAGTTGTATTGGAAACGGTGAATTCTA 3'（SEQ ID N0:4)和 C261S :除了堿基取代以編碼絲氨 酸(加下劃線的）之外與核苷酸888-918互補： 5, CCATGCACTGC1GOTAriACTCrGAGACGC：AG (SEQ ID NO:.5)。
[0114] 在測序后，將DNA構建體亞克隆到pMEP4表達載體（Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)內。
[0115] pSMC的轉染。將已生長至70%匯合的細胞用如先前描述的（24)三種IAP cDNA構 建體之一進行轉染。如先前描述的（Υ· Imai等人，100,2596-605 (1997))， 選擇潮霉素抗性pSMC且維持在含有15%FBS和100 Pg/ml潮霉素的DMEM-H中。如本文描 述的，通過制備全細胞裂解產(chǎn)物且通過免疫印跡顯現(xiàn)FLAG蛋白質表達，評估蛋白質表達水 平。將得自獨立實施的兩次轉染的經(jīng)轉染的PSMC用于后續(xù)實驗中，并且獲得的結果在兩組 細胞之間是一致的。
[0116] 細胞裂解。將細胞以5 xlO5的密度鋪至10 cm皿（Falcon # 3003)中，并且隨后生 長至90%匯合(大約5 X 106細胞)。細胞在具有0. 5%牛血清白蛋白（SFM)的無血清培養(yǎng)基 中溫育過夜，并且隨后在需要時，用單克隆抗IAP抗體（B6H12)或無關對照單克隆抗體預處 理2小時（4 Pg/ml )，并且隨后在下述冰冷的裂解緩沖液中裂解前，用100 ng/ml IGF-1或10 ng/ml PDGF 處理適當長的時間：50mM Tris HC1 (pH 7. 5)、150mM NaCl、l%NP40、0. 25% 脫氧膽 酸鈉 、ImM EGTA加上ImM原釩酸鈉、ImM氟化鈉 、ImM PMSF、1 Pg/ml胃酶抑素 A、1 Pg/ml亮抑 酶肽、1 Pg/ml抑肽酶。裂解產(chǎn)物通過以14, 000 x g離心10分鐘進行澄清。
[0117] 免疫沉淀。將細胞裂解產(chǎn)物在4°C下與適當抗體（IGF-1R、SHPS-1或B6H12,使用 1:500稀釋度)溫育過夜。隨后通過添加蛋白A瓊脂糖且在4°C下溫育進一步的2小時來沉 淀免疫復合物。隨后將樣品以14, 000 X g離心10分鐘，并且將團塊用裂解緩沖液洗滌4次。 將團塊重懸浮于45 μ?還原或非還原Laemmeli緩沖液，煮沸5分鐘，并且通過SDS-PAGE，8% 凝膠分離蛋白質。
[0118] p42/p44 MAP激酶活化的評估。將pSMCS以1 X 106細胞/孔在六孔板中具有 0. 5%FBS的DMEM-H中鋪平板，并且在37°C下溫育48小時。隨后將板沖洗，并且在具有 0. 5%FBS的新鮮DMEM-H中溫育進一步的2小時。隨后在暴露于IGF-1 (100 ng/ml)前20 分鐘，使細胞在含或不含4 Pg/ml B6H12或無關對照單克隆抗體的SFM中溫育2小時。細胞 隨后用200 μ? Laemelli緩沖液裂解，并且隨后通過SDS-PAGE (8%凝膠)分離40 μ?細胞裂 解產(chǎn)物中的蛋白質。如本文描述的，通過用對于雙重磷酸化(蘇氨酸2°2和酪氨酸 2°4)蛋白質 特異性的抗體（以1:1000的稀釋度）免疫印跡測定Ρ42/44 MAPK的活化。為了控制蛋白質 水平中的差異，將來自每種樣品的等體積的細胞裂解產(chǎn)物裝載到另外的8%凝膠上。在分離 和轉移后，使用多克隆ρ42/ρ44 ΜΑΡΚ抗體（以1:1000的稀釋度）測定總ρ42/ρ44蛋白質水 平。
[0119] 蛋白質免疫印跡。在SDS-PAGE后，將蛋白質轉移至ImmobilonP膜。該膜在具有 0. l%Tween的Tris緩沖鹽水（TBST)中的1%BSA中在室溫下封閉2小時，并且隨后與六種一 抗（IGF-1R、SHP-2、SHPS-1、PY99、B6H12 或 FLAG、1:500 稀釋度）之一在 4°C下溫育過夜，并 且在TBST中洗滌三次。根據(jù)制造商的說明書（Pierce，Rockford IL，USA)，使用增強化學發(fā) 光顯現(xiàn)過氧化物酶標記的二抗的結合，并且通過暴露于放射自顯影膠片或使用GeneGnome CO)顯像系統(tǒng)（Syngene Cambridge, UK Ltd)檢測免疫復合物。
[0120] 使用DuoScan T1200 (AGFA Brussels, Belgium)掃描獲得的化學發(fā)光圖像，并且使 用NIH Image,版本1. 61分析掃描圖像的條帶強度。Student' s t檢驗用于比較處理之間 的差異。所示結果代表至少三次分開的實驗。
[0121] 細胞受傷和遷移測定。將細胞在六孔板中鋪平板，并且經(jīng)過七天生長至匯合，伴隨 一次培養(yǎng)基更換。受傷如先前描述的（J. Jones等人/93:2482-7 (1996))實施。簡言之，將剃刀刀片用于刮取細胞區(qū)域，留下剝蝕區(qū)域和尖銳的可見創(chuàng)傷線。 選擇沿著創(chuàng)傷邊緣的六個1 mm區(qū)域且記錄每種處理。受傷的單層隨后與具有或不具有100 ng/ml IGF-1或PDGF (10 ng/ml)的SFM (加上0· 2% FBS) -起溫育。隨后將細胞固定且染 色（Diff Quick, Dade Behring, Inc.，Newark, DE)，并且計數(shù)遷移到受傷區(qū)域內的細胞數(shù)目。 對于每個數(shù)據(jù)點計數(shù)在創(chuàng)傷邊緣處的先前選擇的1 _區(qū)域中的至少五個。
[0122] 細胞增殖的評估。將細胞以5000細胞/cm2鋪在24孔板中具有2%FBS的DMEM-H 中，并且在將培養(yǎng)基更換為DMEM-H加上0. 2%人貧血小板血漿前，允許附著且擴展24小時。 在進一步的24小時溫育后，在添加 IGF-1 (100 ng/ml)前，使細胞在B6H12或無關對照單克 隆抗體（4 Pg/ml)的存在或不存在下預溫育2小時。每種處理一式三份設置。隨后將細胞 溫育48小時，并且測定每個孔中的最終細胞數(shù)目。Student's t檢驗用于比較處理之間的 差異。所示結果代表來自三次分開實驗的平均值（±SEM)。
[0123] 結果 IAP經(jīng)由其胞外結構域與穩(wěn)定附著的pSMC中的SHPS-1結合。圖1A顯示如通過使用抗 IAP和抗SHPS-1抗體兩者用于免疫沉淀的免疫共沉淀實驗測定的，在穩(wěn)定附著的休眠 SMC 中，存在可檢測的在IAP和SHPS-1之間的結合。
[0124] 為了研究IAP與SHPS-1結合在IGF-1R信號傳遞中的作用，開發(fā)了其中IAP和 SHPS-1之間的結合被破壞的兩種實驗模型。第一種方法使用抗IAP單克隆抗體B6H12,以 干擾兩種蛋白質的結合。圖1B顯示休眠 pSMC與抗IAP單克隆抗體（B6H12)溫育后，IAP和 SHPS-1之間的相互作用降低（75 ± 7. 5%降低(平均值土 S. Ε. Μ η = 3))。與無關對照單克 隆抗體的預溫育對兩種蛋白質之間的結合沒有作用。
[0125] ΙΑΡ和SHPS-1之間的結合特別需要在ΙΑΡ中在胞外結構域中的半胱氨酸33 和假定跨膜結構域內的半胱氨酸261之間的完整二硫鍵（R. Rebres等人，泛6? 276:7672-80 (2001))。如果這個鍵被誘變破壞，則IAP與的相互作用保留，但與 SHPS-1的結合被消除。生成且表達其中IAP和SHPS-1之間的結合將預期被破壞的兩種 突變型IAP。圖1C (上圖）顯示在后續(xù)實驗中使用的三種形式的IAP的表達水平。這些包 括a)加上FLAG標簽的突變型IAP，其中完整的胞外結構域已在氨基酸殘基135處被缺失 (IAPcyto)，b)加上FLAG標簽的突變型IAP，其中兩個半胱氨酸殘基33和261已由絲氨酸 取代（IAPc-s)，和c)加上FLAG標簽的全長IAP (IAPfl)。
[0126] 圖1C (下圖)中所示的代表性實驗顯示IAP的胞外結構域的破壞改變其與SHPS-1 結合的能力。與表達IAPfl的細胞中的結合相比較，IAPcyto的表達導致IAP與SHPS-1結 合中的88 ± 6. 4% (平均值土 SEM n=3)降低。因為IAP的胞外結構域的截短也破壞其與 ?通3的結合，所以在表達IAPc-s突變的細胞中分析SHPS-1/IAP相互作用。在表達IAPc-s 的細胞中，與表達IAPfl的細胞相比較，在IAP與SHPS-1結合中存在81 ± 4. 5% (平均值 土 SEMn=3)降低。對照免疫印跡顯示相似水平的SHPS-1被免疫沉淀。
[0127] 阻斷IAP-SHPS-1結合抑制IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集。為了測定 在IAP和SHPS-1之間的物理結合喪失的功能后果，進行研究以檢查在用抗IAP單克隆抗體 B6H12預處理的野生型細胞中響應IGF-1的SHPS-1磷酸化。代表性實驗顯示于圖2A中， 并且可見與對照中響應IGF-1的SHPS-1磷酸化中的4. 1 ± 0. 9 (平均值土 SEM η = 3)倍 數(shù)增加不同，用Β6Η12預處理的細胞顯示IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化中的增加中的顯著降 低（0. 93 ± 0. 12 (平均值土 SEM η = 3 ρ〈0. 05)。在與無關對照單克隆抗體一起預溫育的 細胞中，IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化與對照細胞并無顯著不同。另外如圖2Α中可見的，在 Β6Η12的存在下SHPS-1磷酸化中的這種降低與IGF-1刺激的SHP-2至SHPS-1的募集中的 顯著降低相關(與對照細胞中的14 ± 1. 5倍增加相比較，在Β6Η12的存在下SHP-2結合中 的1. 8 ± 1. 1倍增加（平均值土 SEM η = 3 ρ〈 0. 05)。再次，在與無關對照單克隆抗體一起 預溫育的細胞中，不存在對IGF-1刺激的SHP-2至SHPS-1募集的顯著作用。
[0128] ΙΑΡ的胞外結構域是IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化和SHP-2募集所必需的。為了證 實暗示阻斷ΙΑΡ與SHPS-1結合抑制IGF-1刺激的SHPS-1磷酸化的先前觀察，將表達突變 型ΙΑΡ的細胞中IGF-1刺激SHPS-1磷酸化的能力與表達野生型ΙΑΡ的細胞的相比較。來 自代表性實驗的結果顯示于圖2Β中，并且可見與表達IAPfl的細胞中響應IGF-1的SHPS-1 磷酸化中的3. 6 ± 0. 8 (平均值土 SEM η = 3)增加不同，在表達IAPcyto突變型或IAPc-s 突變型的細胞中，無法檢測到響應IGF-1的SHPS-1磷酸化中的顯著增加。
[0129] 與使用B6H12獲得的結果一致，在表達突變型IAP的細胞中觀察到的SHPS-1磷酸 化的缺乏與響應IGF-1的SHP-2至SHPS-1募集的抑制相關（圖2B)。
[0130] 因為SHPS-1已顯示響應幾種生長因子而磷酸化，所以進行研究以調查IAP與 SHPS-1結合的需要的特異性。圖2C顯示在表達IAPfl的細胞中的5分鐘暴露后，TOGF誘 導SHPS-1磷酸化中的顯著增加。然而，與IGF-1不同，PDGF還刺激IAPc-s細胞中的SHPS-1 磷酸化。
[0131] IAP的胞外結構域和SHPS-1之間的結合經(jīng)由其調整SHP-2募集來調節(jié)IGF-1R磷 酸化的持續(xù)時間。SHPS-1的磷酸化是SHP-2轉移至IGF-1R所必需的，并且從而調節(jié)IGF-1R 磷酸化的持續(xù)時間（T. Noguchi等人/份泛￡? 271:27652-8( 1996));因此，進行研究以檢 查在用B6H12預處理的細胞和表達突變型IAP的細胞中SHP-2的IGF-1R募集和IGF-1R磷 酸化的持續(xù)時間。在對照細胞中，在用IGF-1的10分鐘處理后，IGF-1刺激SHP-2至IGF-1 受體的募集中的3. 3 ± 0. 4 (平均值土 SEM η = 3)倍增加。然而，在用B6H12預處理的細 胞中的SHP-2至IGF-1R的募集，在SHP-2至IGF-1R的募集中不存在可見的顯著增加（圖 3Α)。與先前結果（L. Maile 和 D. Clemmons，/沿277:8955-60(2002))-致，SHP-2 至IGF-1R的募集在20分鐘IGF-1刺激后觀察到的受體磷酸化中的降低之前。然而，在與 Β6Η12預溫育的細胞中，與SHP-2募集的缺乏一致，在20分鐘時間點無法檢測到IGF-1R磷 酸化中的降低。為了證實在用Β6Η12預處理的細胞中SHP-2至IGF-1R募集的缺乏是由于 IAP/SHPS-1之間的特異性破壞，在表達IAPc-s的細胞中檢查IGF-1R磷酸化。圖3Β顯示 在這些細胞中，在響應IGF-1的SHP-2至IGF-1R的募集中不存在增加，并且再次這與在表 達全長IAP的細胞中用IGF-1的20分鐘刺激后觀察到的IGF-1R去磷酸化的量中的降低相 關。
[0132] IGF-1刺激的MAPK活性在SHP-2轉移破壞后得到抑制。先前研究已顯示無活性形 式的SHP-2的表達導致IGF-1刺激的MAPK的抑制（S. Manes等人#〇/化#沿4:3125-35 (1999))。為了檢查在IAP-SHPS-1結合破壞后SHP-2轉移缺乏的后果，分析在B6H12的存 在下響應IGF-1的MAPK活化。
[0133] 圖4A顯示如通過p42/p44 MAPK的雙重磷酸化評估測定的，10分鐘的IGF-1處理 刺激MAPK活化中的顯著增加（70 ± 5%S.E.Mn = 4)。然而，當細胞與B6H12 -起預溫育時， IGF-1不能刺激p42/p44 MAPK磷酸化中的持續(xù)增加。MAPK是IGF-1刺激細胞增殖所必需 的。
[0134] 為了檢查IAP-SHPS-1結合中的破壞對SMC中的IGF-1作用的后果，測定B6H12對 IGF-1刺激的細胞增殖的作用。圖4B顯示IGF-1刺激細胞增殖中的2. 2 ± 0. 2(平均值土 SEM η = 3)倍增加。然而，與在不存在B6H12的情況下溫育的細胞相比較，當細胞與B6H12 一起溫育時，在IGF-1刺激的細胞增殖中存在顯著降低（1. 03 ± 0. 01平均值土 SEM η = 3 ρ 〈0. 05。細胞增殖中的抑制與IGF-1刺激的MAPK活化的抑制一致。
[0135] IAP與SHPS-1相互作用的破壞抑制IGF-1刺激的細胞遷移。pSMC與B6H12預溫育 部分通過改變IAP和a仰3之間的相互作用來抑制IGF-1刺激的遷移（L. Maile等人/沿 泛￡? 277:1800-5 (2002))。為了測定至少部分B6H12的效應是否也是由于IAP與SHPS-1 結合的抑制，在表達IAPfl和IAPc-s突變體的細胞中比較響應IGF-1的細胞遷移。在圖5 中，在表達IAPfl的細胞中可見IGF-1刺激pSMC遷移中的顯著增加。然而，在表達IAPc-s 突變體的細胞中，IGF-1刺激的遷移顯著降低。相比之下，PDGF刺激的IAPc-s細胞的細胞 遷移與表達全長IAP的細胞的并無顯著不同。
[0136] 討論 SHPS-1在胞內信號傳遞中的作用在很大程度上已歸因于SHP-2募集至在SHPS-1的 胞質尾區(qū)中的ITIM基序內含有的磷酸化的酪氨酸，和SHP-2磷酸酶活性的后續(xù)活化（L. Maile 等人/沿277:1800-5 (2002) ;Τ· Takada 等人/沿273:9234-42 (1998) ;J. Ti_s 等人，Q/rrSio/ 9:927-30 (1999))?；罨?SHP-2 轉移至生長因子例 如IGF-1的下游信號傳遞分子以刺激其生理學作用的需要已由這樣的研究強烈暗示，所述 研究顯示顯性陰性形式的SHP-2的表達導致不能適當活化生長因子刺激的MAP激酶（T. Noguchi 等人14:6674-82 (1994);K. Milarski 和 A. Saltiel /沿〇7泛6? 269:21239-43 (1994) ;S. Xiao 等人/沿269:21244-8 (1994) ;K. Yamauchi 等人 92:664-8 (1995) ;G. Pronk 等人14:1575-81 (1994); T. Sasaoka 等人/沿269:10734-8 (1994))和 PI-3 激酶（C. Wu 等人伽co供《e 20:6018-25 (2001) ;S. Ugi 等人/沿271:12595-602 (1996) ;S. Zhang 等人#〇/ W 22:4062-72(2002))中的增加，以及不能將SHP-2募集至下游信號傳遞分子。對 于IGF-1，特別顯示顯性陰性SHP-2突變體的表達導致不能活化MAP激酶或響應IGF-1的細 胞遷移（S. Manes等人#〇/化#歷4:3125-35 (1999))。來自這項研究的結果已證實在 IAP和SHPS-1之間的相互作用是IGF-1信號傳遞的關鍵調節(jié)物，因為這些數(shù)據(jù)已顯示相互 作用是SHP-2募集和轉移所必需的。使用兩種獨立方法破壞兩種蛋白質之間的相互作用導 致SHP-2募集至SHPS-1和后續(xù)轉移至IGF-1R的喪失，其在延長的IGF-1R磷酸化中反映。 SHP-2募集和轉移缺乏的后果在IGF-1刺激MAPK活化和后續(xù)細胞增殖或細胞遷移的無能性 (inability)中是顯而易見的。
[0137] SHPS-1和IAP之間的相互作用首先由實驗暗示，所述實驗證實抗IAP單克隆抗 體阻斷小腦神經(jīng)元、紅細胞（erthyrocytes)和胸腺細胞與含有P84 (SHPS-1的腦同系物） 的基底的附著（P. Jiang 等人/沿o/CXe? 274:559-62 (1999) ;M. Seiffert 等人，財ο〇?/ 94:3633-43(1999))。這種相互作用可能在細胞與細胞附著中起作用在實驗中得到證明，所 述實驗證實在SIRP陰性細胞中的S〖RP?胞外結構域的表達支持原代造血細胞的粘附，并且 這種相互作用再次通過抗IAP單克隆抗體而被抑制（E. Vernon-Wilson等人及/r / J遞 30:2130-2137 (2000))。
[0138] 介導與胞外基質的細胞附著的細胞粘附分子例如整聯(lián)蛋白和細胞與細胞粘附分 子例如鈣粘蛋白，不僅對于細胞附著而且對于細胞增殖、存活和分化的調節(jié)是重要的。通過 整聯(lián)蛋白受體的生長因子信號傳遞調節(jié)已得到充分證明。先前已報道ccVfl3的配體占據(jù)是 IGF-1刺激的受體信號傳遞所必需的，并且在ctVIM和roGF受體之間的相似協(xié)作關系已得 到描述（s. Miyamoto 等人7； 沿〇乂 135:16633-1642(1996))。IGF-1 已顯示為多種 嗜同種細胞與細胞粘附分子的調節(jié)物。Guvakova等人報道IGF-1R與E- |丐粘蛋白共定位， 且通過增加 Z0-1的表達來增加 MCF-7細胞的細胞粘附，所述Z0-1與E-鈣粘蛋白結合且穩(wěn) 定其與細胞骨架的相互作用（L. Mauro等人J沿〇乂泛￡皿276:3982-39897)。相反，還已 顯示在人結腸腫瘤細胞中，IGF-1經(jīng)由其刺激E-鈣粘蛋白磷酸化的能力導致降低的E-鈣粘 蛋白膜水平和細胞粘附中的相關降低。IGF-1也已報道下調T-鈣粘蛋白表達，再次這與細 胞粘附中的降低相關。盡管細胞與細胞粘附受體在調節(jié)細胞功能中的明顯作用，但關于其 調節(jié)生長因子作用的能力存在很少數(shù)據(jù)。先前已顯示神經(jīng)細胞粘附分子與成纖維細胞生長 因子受體的相互作用導致通過自磷酸化的受體活化。VEGF已顯示導致CEACAM表達中的增 力口，并且VEGF效應中的至少一些通過CEACAM-1介導。來自這些實驗的結果證實細胞與細胞 粘附分子IAP和SHPS-1的相互作用，除了介導細胞粘附，還在生長因子信號傳遞中起重要 的調節(jié)作用?？紤]到細胞與細胞粘附分子在調節(jié)細胞功能中的重要性，得出結論通過細胞 與細胞粘附分子的生長因子信號傳遞調節(jié)是用于調節(jié)生長因子作用的一般機制是合理的。 TOGF信號傳遞不受IAP-SHPS-1相互作用破壞的影響。
[0139] 因為在不存在IAP與SHPS-1結合的情況下，PDGF仍可以刺激SHPS-1磷酸化，所以 這暗示TOGF和IGF-1可以經(jīng)由兩種不同激酶刺激SHPS-1磷酸化。SHPS-1已顯示直接通過 胰島素受體激酶磷酸化（Y. Fujioka等人，#〇/化#沿16,6887-99 (1996))?？紤]到胰 島素中的酪氨酸激酶結構域和IGF-1R之間的同源性(例如84%)，可能SHPS-1也是IGF-1R 激酶的直接底物。IAP與SHPS-1結合可以通過將SHPS-1緊密接近地定位于受體激酶來調 節(jié)這個過程，或者IAP與SHPS-1結合可以改變SHPS-1胞質結構域的構象，使得它的酪氨酸 對IGF-1R激酶是可接近的。
[0140] 由于其刺激SMC遷移和增殖的能力，IGF-1可能是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要 成因（J. Jones 等人93:2482-7 (1996)) ;M. Khorsandi 等人 J. Clin, Invest. 90 :1926-1931 (1992);B. Cerek 等人 C/rc. Tfes. 66 :1755-1760 (1990); P. Hayry等人，柯5挪/· 9 :1336-1344 (1995))。在其中IGF-1在SMC中過表達的小鼠中， 在頸動脈損傷后存在新生內膜（neointimal)形成速率中的增加，所述頸動脈損傷看起來已 產(chǎn)生于增加的SMC增殖和遷移。盡管與對照動物相比較在血漿中的血清IGF-1的等同水 平，但該效應是明顯的，暗示局部產(chǎn)生的IGF-1的旁分泌效應（B. Zhu等人 142:3598-3666 (2001))?？紤]到IGF-1在動脈粥樣硬化發(fā)生中的明顯作用和這種相互作 用對IGF-1信號傳遞的作用，可能這種系統(tǒng)可以在動脈粥樣硬化的發(fā)生中起作用，并且相 互作用的破壞可能代表特異性抑制IGF-1作用的新治療策略。靶向IGF-1信號傳遞的目前 方法已集中于使用抗體或肽阻斷受體自身的活性。破壞特異性抑制生長因子信號傳遞的細 胞與細胞粘附分子相互作用提供新治療策略。
[0141] 實施例2 用破壞IAP與SHPS-1結合的單克隆抗體（NPG-1)治療糖尿病視網(wǎng)膜病變 血管通透性的體內測量 大鼠用戊巴比妥（Nembutal) (80 mg/kg) (Southern Anesthesia)進行注射。一旦已 實現(xiàn)深度麻醉，就經(jīng)由尾靜脈注射加溫的伊文思藍（45 mg/kg) (Fisher Scientific)溶液。 在2小時后，施用致死劑量的麻醉劑（100 mg/kg)。打開胸腔并且將針插入左心室內。將右 心房夾住且將血液以12,000 X g離心5分鐘。將大鼠用在檸檬酸鹽中的1%多聚甲醛灌注， 隨后取出眼且置于PBS中。取出視網(wǎng)膜，凍干且隨后重懸浮于甲酰胺中，且在70°C下溫育。 在18小時后，將視網(wǎng)膜/甲酰胺以13, 000 X g離心10分鐘。
[0142] 使用伊文思藍（30 mg/ul)的系列稀釋物生成標準曲線。分別使用620和740 nm 的激發(fā)和發(fā)射波長，使用Nanodrop分光光度計（Thermo-Scientific)測量標準曲線以及每 個視網(wǎng)膜的吸光度。使用下式計算來自每個視網(wǎng)膜的伊文思藍透過的量：
【權利要求】
1. 單克隆抗體，其特異性結合在人IAP蛋白質的氨基酸71-80內的表位，并且是IAP與 SHPS-1結合的拮抗劑。
2. 權利要求1的抗體，其與可檢測基團偶聯(lián)。
3. 權利要求1的抗體，其與治療性基團偶聯(lián)。
4. 權利要求1的抗體，其中所述抗體不破壞ΙΑΡ與β 3蛋白質的結合。
5. 藥物制劑，其包含在藥學上可接受的載體中的權利要求1的抗體。
6. 權利要求1的抗體，其中所述抗體選自（a)由雜交瘤NPG-1產(chǎn)生的單克隆抗體，和 (b)競爭結合與由通過所述雜交瘤NPG-1產(chǎn)生的單克隆抗體結合的表位相同的表位的單克 隆抗體。
7. 權利要求6的抗體，其與可檢測基團偶聯(lián)。
8. 權利要求6的抗體，其與治療性基團偶聯(lián)。
9. 藥物制劑，其包含在藥學上可接受的載體中的權利要求6的抗體。
10. 抑制有其需要的個體中IGF-1作用的方法，其包括向所述個體施用權利要求1的抗 體。
11. 抑制有其需要的個體中IGF-1作用的方法，其包括向所述個體施用權利要求6的抗 體。
12. 治療個體中視網(wǎng)膜病變的方法，其包括向所述個體施用有效量的權利要求1或權 利要求6的抗體。
13. 治療個體中動脈粥樣硬化的方法，其包括向所述個體施用有效量的權利要求1或 權利要求6的抗體。
14. 治療個體中腎病的方法，其包括向所述個體施用有效量的權利要求1或權利要求6 的抗體。
15. 治療個體中冠心病的方法，其包括向所述個體施用有效量的權利要求1或權利要 求6的抗體。
16. 治療個體中癌癥的方法，其包括向所述個體施用有效量的權利要求1或權利要求6 的抗體。
【文檔編號】A61K38/30GK104053452SQ201280052718
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2012年8月24日 優(yōu)先權日:2011年8月26日
【發(fā)明者】D.R.克萊蒙斯, L.A.邁爾 申請人:北卡羅來納-查佩爾山大學