含有順序發(fā)酵或同時(shí)發(fā)酵的提取物的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種含有來(lái)自同時(shí)發(fā)酵或順序發(fā)酵的發(fā)酵提取物的局部用組合物。當(dāng)局部涂敷皮膚時(shí)，本發(fā)明的組合物可有效刺激皮膚細(xì)胞中的透明質(zhì)酸、CD44和半胱天冬酶14蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
【專利說(shuō)明】含有順序發(fā)酵或同時(shí)發(fā)酵的提取物的組合物
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及適合用于個(gè)人護(hù)理和治療應(yīng)用的組合物，更具體地，本發(fā)明涉及含有雙重發(fā)酵提取物的這種組合物。
[0003]【背景技術(shù)】
[0004]通過(guò)諸如酵母菌(Saccharomyces sp.)或乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)之類的單一微生物發(fā)酵得到的提取物是已知的并已經(jīng)被用于局部用組合物。最近，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2010/0021532號(hào)表明來(lái)源于微生物與植物的多酚的發(fā)酵已經(jīng)作為產(chǎn)生對(duì)皮膚具有有益效果的代謝物的方法公開(kāi)。
[0005]已在食品工業(yè)范圍內(nèi)，特別是在釀酒工藝中探索了多種發(fā)酵劑培養(yǎng)物微生物的使用和共培養(yǎng)的多種微生物的構(gòu)思(參見(jiàn)例如，Toro M.E等，World Journal ofMicrobiology and B iotechnologyl8:347 - 354.(2002)和 Herrero M.等，Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology22:48 - 51 (1999))。據(jù)建議，多種發(fā)酵劑酒的味道和生化概貌可優(yōu)于單一培養(yǎng)接種的酒的味道和生化概貌，由于在多種發(fā)酵劑微生物釀酒過(guò)程中微生物的相互作用對(duì)增強(qiáng)的味道起關(guān)鍵的影響作用，Ciani M.等，International Journal of Food Microbiologyl08:239 - 245(2006) ? 然而，不建議將多種發(fā)酵劑培養(yǎng)物用于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品。
[0006]最近，酵母菌及其衍生物的使用在美容應(yīng)用中越來(lái)越受歡迎。這由如下事實(shí)引起:作為真核生物的酵母菌具有與人體細(xì)胞相似的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，并且已知其在應(yīng)激下引發(fā)有益蛋白的產(chǎn)生。同時(shí)還有使用酵母菌衍生物及其在局部皮膚施用中提高攝氧量的益處的大量歷史證據(jù)。例如，美國(guó)專利第4，540，571號(hào)公開(kāi)了酵母菌衍生物促進(jìn)皮膚呼吸作用。還報(bào)道了酵母細(xì)胞衍生物刺激皮膚細(xì)胞中的膠原和彈性蛋白的生成。
[0007]最近的研究表明酵母細(xì)胞提取物能夠產(chǎn)生刺激傷口愈合的‘生長(zhǎng)因子’。例如，美國(guó)專利第7，217，417號(hào)公開(kāi)了將酵母細(xì)胞衍生物加入用于傷口愈合的基于凝膠的制劑的方法。
[0008]本領(lǐng)域還沒(méi)有報(bào)道同時(shí)使用發(fā)酵提取物或按順序使用發(fā)酵提取物獲得新的活性物質(zhì)。
[0009]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]一方面，本發(fā)明提供含有從至少兩種微生物的同時(shí)發(fā)酵或順序發(fā)酵過(guò)程中取出的發(fā)酵提取物的局部用組合物。
[0011]另一方面，本發(fā)明提供一種含有從至少兩種微生物的同時(shí)發(fā)酵或順序發(fā)酵過(guò)程中取出的發(fā)酵提取物、足以對(duì)所述發(fā)酵提取物起滅菌或生物靜態(tài)作用的防腐劑以及皮膚病學(xué)上可接受的載體的局部用組合物。
[0012]本發(fā)明提供的一種示例性局部用組合物含有第一微生物和第二微生物的雙重發(fā)酵提取物，所述第一微生物為謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii),所述第二微生物為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。
[0013]本發(fā)明提供的另一示例性局部用組合物含有第一微生物和第二微生物的雙重發(fā)酵提取物，所述第一微生物為微藻，所述第二微生物為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。
[0014]本發(fā)明還提供一種含有以下加工步驟的制備發(fā)酵提取物的方法:使用通過(guò)化學(xué)方法定義的第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基使第一微生物生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期以生成含有第一微生物和由第一微生物表達(dá)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基；使第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基與第二微生物接觸；使第一微生物和第二微生物在第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中同時(shí)發(fā)酵以生成含有水溶性部分和水不溶性部分的發(fā)酵混合物；從發(fā)酵混合物中分離水不溶性部分，由此隔離水溶性部分并生成雙重發(fā)酵提取物。
[0015]本發(fā)明的另一方面為通過(guò)對(duì)需要用含有雙重發(fā)酵提取物的局部用組合物治療的使用者的皮膚施用局部用組合物來(lái)刺激皮膚細(xì)胞中透明質(zhì)酸和CD44的產(chǎn)生的方法。
[0016]本發(fā)明的另一方面為通過(guò)對(duì)需要用含有雙重發(fā)酵提取物的局部用組合物治療的使用者的皮膚施用局部用組合物來(lái)刺激皮膚細(xì)胞中透明質(zhì)酸和半胱天冬酶-14的產(chǎn)生的方法。
[0017]在閱讀本發(fā)明的具體描述時(shí)，本發(fā)明的上述這些方面和其它方面將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。
[0018]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是用于比較的乳桿菌科發(fā)酵提取物的GC-MS圖譜。
[0020]圖2是用于比較的丙酸桿菌科發(fā)酵提取物的GC-MS圖譜。
[0021]圖3是來(lái)自乳桿菌科和丙酸桿菌科同時(shí)發(fā)酵的雙重發(fā)酵提取物的GC-MS譜。
[0022]圖4表示用乳桿菌科發(fā)酵提取物、丙酸桿菌科發(fā)酵提取物和來(lái)自乳桿菌科和丙酸桿菌科同時(shí)發(fā)酵的雙重發(fā)酵提取物處理的全層組織中的HASl表達(dá)。
[0023]圖5表示用乳桿菌科發(fā)酵提取物、丙酸桿菌科發(fā)酵提取物和來(lái)自乳桿菌科和丙酸桿菌科同時(shí)發(fā)酵的雙重發(fā)酵提取物處理的全層組織中的CD44表達(dá)。
[0024]圖6A、6B和6C分別表不未經(jīng)處理的體外角質(zhì)層破壞模型中的透明質(zhì)酸表達(dá)。
[0025]圖6B表示用視黃醇處理的體外角質(zhì)層破壞模型中的透明質(zhì)酸表達(dá)。
[0026]圖6C表示用來(lái)自乳桿菌科和微藻的同時(shí)發(fā)酵的雙重發(fā)酵提取物處理的體外角質(zhì)層破壞模型中的透明質(zhì)酸表達(dá)。
[0027]圖7A表示未經(jīng)處理的處理的體外角質(zhì)層破壞模型中的半胱天冬酶-14表達(dá)。
[0028]圖7B表示用視黃醇處理的體外角質(zhì)層破壞模型中的半胱天冬酶-14表達(dá)。
[0029]圖7C表示用來(lái)自乳桿菌科和微藻的同時(shí)發(fā)酵的雙重發(fā)酵提取物處理的體外角質(zhì)層破壞模型中的半胱天冬酶-14表達(dá)。
[0030]圖8A和SB顯示施用微藻和乳桿菌科雙重發(fā)酵物后，通過(guò)皮膚彈性測(cè)量?jī)x(cutometer)對(duì)皮膚彈性的體內(nèi)評(píng)價(jià)。
[0031]圖9A和9B顯示施用微藻和乳桿菌科雙重發(fā)酵物后，對(duì)細(xì)紋和皺紋的體內(nèi)評(píng)價(jià)。
[0032]圖1OA和IOB顯示施用微藻和乳桿菌科雙重發(fā)酵物后，對(duì)眼周部位的細(xì)紋和皺紋的體內(nèi)Silflo評(píng)價(jià)。
[0033]【具體實(shí)施方式】 [0034]目前本發(fā)明出乎意料地發(fā)現(xiàn)含有從至少兩種微生物的同時(shí)發(fā)酵或順序發(fā)酵過(guò)程中取出的發(fā)酵提取物的局部用組合物在用于個(gè)人護(hù)理和治療用途的局部用組合物中具有有益性質(zhì)。所述有益性質(zhì)包括，例如，當(dāng)含有所述發(fā)酵提取物的組合物局部施用于皮膚時(shí)，發(fā)現(xiàn)該組合物在刺激皮膚細(xì)胞中的透明質(zhì)酸、CD44和半胱天冬酶14的蛋白的生成方面是有效的。
[0035]在不受任何理論束縛的條件下，相信同時(shí)發(fā)酵或順序發(fā)酵使一種微生物可與另一微生物競(jìng)爭(zhēng)。在存在來(lái)自第一微生物的代謝產(chǎn)物的條件下，第二微生物的競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境使第二微生物開(kāi)始表達(dá)使其在該競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中生長(zhǎng)旺盛的代謝產(chǎn)物。具體而言，第二微生物可代謝來(lái)自第一微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物和細(xì)胞因子，反之，第一微生物也可代謝來(lái)自第二微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物和細(xì)胞因子。因此，發(fā)酵提取物變成含有獨(dú)特的代謝活性物質(zhì)的新組合物，而所述獨(dú)特的代謝活性物質(zhì)不能在上述微生物單獨(dú)發(fā)酵時(shí)得到。
[0036]為了制備本發(fā)明的發(fā)酵提取物，在一種實(shí)施方式中，使第一微生物在通過(guò)化學(xué)方法定義的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。如本文所使用的“通過(guò)化學(xué)方法定義的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基”是指含有用于微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的特定化學(xué)來(lái)源的培養(yǎng)基，例如氮、碳的化學(xué)來(lái)源等。通過(guò)化學(xué)方法定義的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基一般不含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物來(lái)源，例如酵母菌或動(dòng)物/植物組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。第一微生物通過(guò)表達(dá)次級(jí)代謝產(chǎn)物改良營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。次級(jí)代謝產(chǎn)物包括蛋白、細(xì)胞因子、多糖、核酸等。接著，第二微生物可接種于含有第一微生物和來(lái)自第一微生物的代謝產(chǎn)物的改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。然后，使第一微生物和第二微生物在改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中同時(shí)發(fā)酵以生成發(fā)酵混合物?？蛇x地，在第一微生物發(fā)酵之后，使第二微生物在改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵。一般而言，所述發(fā)酵會(huì)含有水溶性部分和水不溶性部分。可從發(fā)酵混合物中除去水不溶性部分，由此分離水溶性部分(本發(fā)明的發(fā)酵提取物)。本文使用的“水溶性”是指溶于I克水中的I克雙重發(fā)酵提取物。所述提取物還可溶于水/有機(jī)溶劑混合物，所述水/有機(jī)溶劑混合物例如，但不限于，水性乙二醇和水性丙三醇。
[0037]如本文使用的“發(fā)酵提取物”是指來(lái)自兩種或兩種以上微生物的發(fā)酵的組合物。本發(fā)明的發(fā)酵提取物含有來(lái)自兩種微生物的細(xì)胞質(zhì)成分和細(xì)胞外成分，包括，但不限于，營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth)、細(xì)胞蛋白物質(zhì)、細(xì)胞核物質(zhì)、細(xì)胞原生質(zhì)物質(zhì)和/或細(xì)胞壁成分
坐寸ο
[0038]當(dāng)兩種微生物同時(shí)或按順序生長(zhǎng)時(shí)，該過(guò)程在本文中稱作為“雙重發(fā)酵”。來(lái)自雙重發(fā)酵的發(fā)酵提取物在本文中稱作為“雙重發(fā)酵提取物”。如本文所述的，實(shí)例涉及用于制備雙重發(fā)酵提取物的雙重發(fā)酵；然而，預(yù)期額外的微生物可同時(shí)或按順序進(jìn)行發(fā)酵。[0039]一般而言，為了制備雙重發(fā)酵提取物，使第一微生物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。如本文使用的“對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期”是指微生物培養(yǎng)物的指數(shù)生長(zhǎng)的最后階段。指數(shù)生長(zhǎng)的特征為指數(shù)的細(xì)胞生長(zhǎng)或加倍的細(xì)胞生長(zhǎng)。指數(shù)生長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間取決于在給定時(shí)間存在的微生物的種群數(shù)量以及培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可用性。典型地，使第一微生物生長(zhǎng)直至600nm下的光密度為至少約6。使第一微生物在規(guī)定的溫度范圍下生長(zhǎng)持續(xù)規(guī)定的時(shí)間段。在無(wú)菌轉(zhuǎn)移罐中收集得到的改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基?？蛇M(jìn)一步純化改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以除去第一微生物?？蛇x地，在添加諸如乳桿菌之類的第二微生物的過(guò)程中，可使第一微生物保留在改良的培養(yǎng)基中。通過(guò)光密度和活菌數(shù)^OOnm下光密度至少為6 ;或者活菌數(shù)約為IO9菌落形成單位/ml)的改變監(jiān)測(cè)第二微生物的生長(zhǎng)。
[0040]基本上任何營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基均可用于本發(fā)明，其沒(méi)有特別限制。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且對(duì)本發(fā)明有用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的生成沒(méi)有特別限制。典型的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基可在例如“Handbook of Microbiological Media，，CRC Press 出版(Boca Raton, FL)中找到。例如，用于本發(fā)明發(fā)酵過(guò)程的合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為通過(guò)化學(xué)方法限定的培養(yǎng)基，不含任何動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)物，含有明確定義的且充足的碳源、氮源和磷源。
[0041]在發(fā)酵過(guò)程中，使流加培養(yǎng)物一般在約20至30°C下，在補(bǔ)充有碳源(丙三醇、乳糖)；氮源(肽和氨基酸)以及磷的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。PH—般通過(guò)滴加2M NH4OH保持恒定為5.0±1.5。發(fā)酵氧條件通過(guò)可滅菌的氧探針時(shí)刻監(jiān)測(cè)，發(fā)酵環(huán)境一般通過(guò)在發(fā)酵罐中以最低限度攪拌維持，所述攪拌的最大速度為介于IOOrpm至150rpm之間。氮?dú)獾倪M(jìn)給速度一般設(shè)定為0.01至0.5VVM(體積空氣/容器體積/每分鐘)?？刹捎闷渌鼩怏w或可不采用其它氣體，可施加額外的外部壓力或者可不施加額外的外部壓力，例如，使用氧化壓力(stress)促進(jìn)技術(shù)(例如添加臭氧或UV光)或者使用壓力相關(guān)技術(shù)(例如，加熱)。
[0042]發(fā)酵工藝可以在任何類型的攪拌生物反應(yīng)器或波型生物反應(yīng)器中實(shí)施。對(duì)本發(fā)明有用的生物反應(yīng)器包括，但不限于，可獲自New Brunswick Scientif ic (新澤西州愛(ài)迪生)或Applikon Biotechnology (加州福斯特城)的分批補(bǔ)料反應(yīng)器。
[0043]第一微生物和第二微生物菌兩者可在有氧條件下生長(zhǎng)或在無(wú)氧條件下生長(zhǎng)，或者在有氧和無(wú)氧條件下生長(zhǎng)以刺激次級(jí)代謝產(chǎn)物。任選地，在發(fā)酵過(guò)程中，可將微生物暴露在壓力源下，所述壓力源例如，諸如過(guò)氧化氫和臭氧之類的化學(xué)品，諸如超聲、UV、紅外輻射或熱之類的能量。
[0044]可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。一種特別有效的技術(shù)包括與質(zhì)譜結(jié) 合的色譜分析法(LC/MS或GC/MS)。檢測(cè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的另一有效方法為通過(guò)使用商售的微生物基因組陣列。這種陣列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且諸如酵母和乳桿菌之類的微生物的陣列可購(gòu)買得到。用于檢測(cè)次級(jí)代謝產(chǎn)物表達(dá)的其它方法可包括流式細(xì)胞術(shù)?？墒褂脷庀嗌V和質(zhì)譜分析(GC/MS)檢測(cè)次級(jí)代謝物表達(dá)。這些儀器的實(shí)例包括來(lái)自 Skyray Instrument 公司和 Thermo-Scientific 公司的儀器。
[0045]可通過(guò)從第一微生物和第二微生物的胞外分泌物中分離生物質(zhì)和提取活性成分得到發(fā)酵提取物?？蛇x地，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法溶解細(xì)胞得到雙重發(fā)酵提取物的溶解物。在這些方法中,通過(guò)化學(xué)方式、酶解方式或物理方式或者通過(guò)這些方式的組合使細(xì)胞壁破裂?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方式進(jìn)一步純化雙重發(fā)酵提取物，包括但不限于，色譜法、溶劑萃取、離心、傾析、過(guò)濾或活性炭處理。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式進(jìn)一步濃縮雙重發(fā)酵提取物，包括但不限于，蒸發(fā)、噴霧干燥、低壓升華干燥、帶式或轉(zhuǎn)鼓式干燥。
[0046]用于本發(fā)明的同時(shí)或順序發(fā)酵的合適的微生物可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種不同的微生物科屬，包括，但不限于:脈孢菌屬(Neurospora),長(zhǎng)_殼屬(Ceratostomella),麥角菌屬(Claviceps),炭角菌屬(Xylaria),座堅(jiān)殼屬(Rosellinia),柔膜菌屬(Helotium),核盤(pán)霉屬(Sclerotinia),柄灰包屬(Tulostoma),須腹菌屬(Rhizopogon),耳柱干真菌類(Truncocolumella)，毛霉菌屬(Mucor),根霉屬菌(Rhizopus),蟲(chóng)霉屬(Entomophthora),網(wǎng)柱菌屬(Dictostylium),芽枝莓屬(Blastocladia),壺菌屬(synchytrium)，水霉屬(Saprolegnia)，霜霉屬(Peronospora),白銹菌屬 Albugo,腐霉屬(Pythium),喇卩入菌屬(Craterellus),皮特瑞菌屬(Pterygellus)，疫霉屬(Phytophthora)，根腫菌屬(Plasmodiophora)，塊菌屬(Tuber)，齒菌屬(Hydnum)，荼潰屬(Lecanora)，染料衣屬(Roccella)，雞皮衣屬(Pertusaria)，松蘿屬(Usnea)，扁枝衣屬(Evernia)，樹(shù)花屬(Ramalina)，樹(shù)發(fā)屬(Alectoria)，石蕊屬(Cladonia)，梅衣屬(Parmelia)，冰島衣屬(Cetraria)，傘菌屬(Agaricus)，雞油菌屬(Cantharellus)，類胳燕屬(Omphalotus)，鬼傘屬(Coprinus)，乳燕屬(Lactarius)，皮傘屬(Marasmius)，側(cè)耳屬(Pleurotus)，鱗傘屬(Pholiota)，紅燕屬(Russula)，球蓋燕屬(Stropharia)，粉紅孢子傘菌類(Entoloma)，環(huán)柄燕科(Lepiotaceae)，伏革菌屬(Corticium)，薄膜革菌屬(Pellicularia)，口蘑屬(Tricholoma)，臺(tái)蕈屬(Volvaria)，杯傘屬(Clitocybe)，火燕屬(Flammulina)，酵母屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，曲霉菌屬(Eurotium)，曲霉屬(Aspergillus)，梭孢殼屬(Thielavia)，盤(pán)菌屬(Peziza)，普拉塔暗盤(pán)菌屬(Plectania)，羊肚菌屬(Morchella)，叢耳菌屬(Wynnea)，馬鞍菌屬(Helvella)，鹿花菌屬(Gyromitra)，鬼筆目(Phallales)，狄克提歐菌屬(Dictyophera)，蛇頭菌屬(Mutinus)，籠頭菌屬(Clathrus)，三叉鬼筆屬(Pseudocolus)，馬勃菌屬(Lycoperdon，馬勃屬(Calvatia)，地星屬(Geastrum)，根灰包菌屬(Radiigera)，阿斯特斯菌屬(Astreus)，鳥(niǎo)巢菌屬(Ni dularia)，伽氏灰燕屬(Gastrocybe)，地紅燕屬(Macowanites)，腹牛肝菌屬(Gastroboletus)，地花菌屬(Albatrellus)，新香郝屬(Neolentinus)，黑孔菌屬(Nigroporus)，褐腐干酪屬(Oligoporus)，多孔菌屬(Polyporus)，牛排菌屬(Fistulina)，層孔菌屬(Fomes)，牛肝菌屬(Boletus)，褐小牛肝菌屬(Fuscoboletinus)，撫柄牛肝菌屬(Leccinum)，糟孔牛肝菌屬(Phylloporus)，乳牛肝菌屬(Suillus)，松塔牛肝菌屬(Strobilomyces)，牛肝菌(Boletellus)，銀耳屬(Tremella)，木耳屬(Auricularia)，花耳屬(Dacrymyces)，柵鎊菌屬(Melampsora)，柱鎊菌屬(Cronartium)，柄銹屬(Puccinia)，膠銹菌屬(Gymnosporangium)，腥黑粉菌屬(Tilletia)，條黑粉菌屬(Urocystis)，隔擔(dān)菌屬(Septobasidium)，濕傘屬(Hygrocybe)，錯(cuò)傘屬(Hygrophorus)，濕菌髓(Hygrotrama)，新錯(cuò)傘屬(Neohygrophorus)，絲膜菌屬(Cortinarius)，裸傘屬(Gymnopilus)，發(fā)癬菌屬(Trichophyton)，小孢霉屬(Microsporum)，串珠霉屬(Monilia)，念珠菌屬(Candida)，小尾抱屬(Cercosporella)，青霉菌屬(Penicillium)，芽生菌屬(Blastomyces)，尾孢屬(Cercospora)，綠核菌屬(Ustilaginoidea)，瘤座孢屬(Tubercularia)，德抱菌屬(Fusarium)，絲核菌(Rhizoctinia)，束絲菌屬(Ozonium)，菌核屬(Sclerotium)，地舌菌(Geoglossum)，或松蕈屬(Armillaria);類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)，氣微菌屬(Aeromicrobium);弗萊德門(mén)菌屬(Friedmanniella)，撲科研菌屬(Kribbella)，大理石雕菌屬(Marmoricola);微白霜菌屬(Micropruina)，類諾卡氏菌屬(Nocardioides)，脂肪肝菌屬(Pimelobacter)，丙酸胞菌屬(Propionicicella)，丙酸單胞菌屬(Propionicimonas)，熱孔菌屬(Thermasporomyces)，布魯克勞尼亞菌屬 Brooklawnia，黃絡(luò)球菌屬(Luteococcus)，丙酸桿菌屬(Propionibacterium)，微丙酸菌屬(Propionimicrobium)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，夏普氏菌屬(Sharpea)，兩性囊霉屬(Ambispora)，無(wú)梗囊霉菌屬(Acaulospora)，恩氏孔菌屬(Enthrophospora)，殘孔菌(Abortiporus)，阿米露孔菌屬(Amylocystis)，薄孔菌屬(Antrodia)，似薄孔菌屬(Antrodiella)，深黃孔菌屬(Aurantiporus)，黃孔菌屬(Auriporia)，牛舌草孔菌屬Buglossoporus，錯(cuò)孔菌屬(Ceriporia)，擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)，齒毛菌屬(Cerrena)，克里歐孔菌屬(Criolopsis),隱孔菌屬(Cryptoporus),迷孔菌屬(Daedalea),擬迷孔菌屬(Daedaleopsis),丹特羅亞菌屬(Dantronia), 二絲孔菌屬(Diplomitoporus),董氏孔菌(Donkioporia)，擬孔菌屬(Fomitopsis)，彩孔菌屬(Hapalopilus)，硫色絢孔菌屬(Laetiporus)，拉氏孔菌 Laeptoporus,大孔菌屬(Megasporoporia),灰黑孔菌(Melanoporia),亞灰樹(shù)花菌屬(Meripilus),黑孔菌屬(Nigroporus),少孔菌屬(Oligoporus),歐式孔菌屬(Ossicaulis),銳孔菌屬(Oxyporus),帕氏孔菌屬(Parmastomyces)，皮拉孔菌屬(Pilatoporus)，剝管菌屬(Piptoporus)，臥孔菌屬(Poria),波斯特孔菌屬(Postia),硬孔菌屬(Rigidoporus),苔芝屬(Taiwanofungus),紅木色孔菌屬(Tinctoporellus)，栓菌屬(Trametes)，干酪菌屬(Tyromyces),獲茶菌屬(Wolf iporia),古老球菌屬(Palaeococcus),火球菌屬(Pyrococcus),高溫球菌屬(Thermococcus)，絲衣霉屬(Byssochlamys)，毛薩托菌屬(Chaetosartorya)，克勞姆菌屬(Chromocleista),雙叉菌屬(Dichotomomyces),埃德菌屬(Edyuillia),翅抱霉屬(Emericella)，艾里斯菌屬(Erythrogymnotheca)，正青霉屬(Eupenicillium)，散囊菌屬(Eurotium),芬尼菌屬(Fennellia),鉤囊菌屬(Hamigera),半內(nèi)果菌屬(Hemicarpenteles),新石座菌屬(Neopetromyces),新薩托菌屬(Neosartorya),擬青霉屬(Penicilliopsis),石座菌屬(Petromyces),西格菌屬(Segenoma),裸節(jié)菌屬(Talaromyces),嗜熱子囊菌屬(Thermoascus),特里希菌屬(Thrichocoma),沃卡菌屬(Warcupiella),曲菌屬(Aspergillus),梅 _ 霉屬(Merimbla),擬青霉(Paecilomyces),菲亞羅霉屬Phialosimplex,賽捷羅霉屬(Sagenomella),隔梭孢屬(Septofusidium),綴霉屬(Thysanophora),撫青霉(Geosmithia),乳酸桿菌科,丙酸桿菌科,放線菌目，馬拉色菌屬(Malasezzia),和微藻和其它類似種類。還應(yīng)理解的是,原核生物、藻類細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞也可與一種或一種以上上述微生物共同發(fā)酵。上述微生物/生物(mirobe/organism)酵母屬,裂殖酵母屬，丙酸胞菌屬，丙酸單胞菌屬,熱孔菌屬，丙酸桿菌科，微丙酸菌屬，乳酸桿菌科，彩孔菌屬(Hapalopilus),革菌科(Coriolaceae),半知發(fā)菌科(Mitosporic Trichocomaceae),馬拉色菌科(Malasseziaceae),乳酸桿菌科,丙酸桿菌科，放線菌目(Actinomycetales)和微藻尤其優(yōu)選。
[0047]在一種實(shí)施方式中，使用屬于乳酸桿菌科和丙酸桿菌科的微生物培養(yǎng)物制備雙重發(fā)酵提取物。分別使乳酸桿菌和丙酸桿菌生長(zhǎng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。典型地，屬于乳酸桿菌門(mén)和丙酸桿菌門(mén)的細(xì)菌為喜歡在沒(méi)有氧的條件下生長(zhǎng)的專性厭氧菌或微嗜氣的細(xì)菌。一些種類可忍受存在少量氧的條件。
[0048]為了制備雙重發(fā)酵提取物，使第一微生物(例如丙酸桿菌屬)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。優(yōu)選地，使第一微生物生長(zhǎng)直至600nm下的光密度至少為6。在一種實(shí)施方式中，在25°C至30°C下使第一微生物生長(zhǎng)約16小時(shí)至約18小時(shí)。在無(wú)菌的轉(zhuǎn)移罐中收集得到的改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基?？蛇M(jìn)一步純化改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以除去第一微生物。可選地，可在添加諸如乳酸桿菌之類的第二微生物的過(guò)程中，使第一微生物保留在改良的培養(yǎng)基中。通過(guò)光密度和活菌數(shù)(600nm下光密度至少為6 ;或者活菌數(shù)為109菌落形成單位/ml)的改變監(jiān)測(cè)第二微生物的生長(zhǎng)。
[0049]在另一實(shí)施方式中，使用屬于微藻科吾肯氏壺菌屬(Ulkenia sp.)和乳桿菌科的培養(yǎng)物制備雙重發(fā)酵提取物。使吾肯氏壺菌和乳桿菌分別生長(zhǎng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。 典型地，屬于吾肯氏壺菌和乳桿菌門(mén)的細(xì)菌為專性厭氧菌或微嗜氣的細(xì)菌，并且這種細(xì)菌喜歡在含有無(wú)機(jī)鹽的富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
[0050]為了制備雙重發(fā)酵提取物，使第一微生物(例如微藻)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。在一種實(shí)施方式中，在20°C至24°C下使第一微生物生長(zhǎng)持續(xù)約96小時(shí)至約388小時(shí)。在無(wú)菌轉(zhuǎn)移罐中收集得到的改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基?？蛇M(jìn)一步純化改良的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以除去第一微生物?？蛇x地，可在添加諸如乳酸桿菌之類的第二微生物的過(guò)程中，使第一微生物保留在改良的培養(yǎng)基中。通過(guò)光密度和活菌數(shù)^OOnm下光密度至少為6 ;或者活菌數(shù)為IO9菌落形成單位/ml)的改變監(jiān)測(cè)第二微生物的生長(zhǎng)。
[0051]可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)封裝雙重發(fā)酵提取物，所述技術(shù)包括，但不限于，形成脂質(zhì)體或其它脂質(zhì)封裝物、對(duì)雙重發(fā)酵提取物進(jìn)行噴霧干燥、將雙重發(fā)酵提取物封裝在聚合物膠囊中、將雙重發(fā)酵提取物吸收或吸附在惰性基質(zhì)上等。
[0052]所述雙重發(fā)酵提取物可用于局部用組合物。所述局部用組合物可通過(guò)次級(jí)代謝產(chǎn)物的表達(dá)向皮膚細(xì)胞提供保護(hù)，所述次級(jí)代謝產(chǎn)物在單一微生物的發(fā)酵過(guò)程中不表達(dá)。通過(guò)施用含有雙重發(fā)酵提取物的局部用組合物，其可提供抗老化、皮膚增白、皮膚細(xì)胞更新、皮膚細(xì)胞保護(hù)、皮膚屏障保護(hù)、皮膚保濕以及其它療效的益處。
[0053]本發(fā)明的局部用組合物可含有基于所述局部用組合物的重量的約0.01wt%至高達(dá)約10wt%的發(fā)酵提取物。一般而言，所述局部用組合物可含有基于所述局部用組合物的重量的約0.1wt%至5wt%，典型地，約0.5wt%至約2￥丨％的發(fā)酵提取物。
[0054]除了發(fā)酵提取物，所述局部用組合物可優(yōu)選含有防腐劑?？蓪⒎栏瘎┘又了霭l(fā)酵提取物或局部用組合物中以保持發(fā)酵提取物的環(huán)境并保護(hù)發(fā)酵提取物不被不期望的空氣傳播的微生物污染。如本文使用的“防腐劑”是指使發(fā)酵提取物無(wú)菌或?qū)Σ黄谕奈⑸锉３稚锓€(wěn)定的成分。防腐劑包括酸、醇、乙二醇、對(duì)羥基苯甲酸酯、含四氮的化合物、異噻唑啉酮、釋放甲醛的化合物和鹵代化合物以及酶。示例性的醇包括苯氧乙醇、異丙醇和芐醇；示例性的乙二醇包括丙二醇、丁二醇和戊二醇；示例性的對(duì)羥基苯甲酸酯(paraben或parahydroxybenzioc acid)包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯；示例性的含四氮化合物包括苯扎氯銨、季銨鹽(Quaternium) 15 ;示例性的異噻唑類包括甲基異噻唑啉、甲基氯代異噻唑啉；示例性的醛釋放劑包括DMDM乙內(nèi)酰脲、咪唑烷基脲和雙咪唑烷基脲；示例性的抗氧化劑包括丁羥甲苯、生育酚，示例性的鹵代化合物包括三氯生和氯己定二葡糖酸鹽。示例性的酶包括葡萄糖氧化酶和乳過(guò)氧化酶?？捎糜诒景l(fā)明的目的的防腐劑的實(shí)例可在 Steinberg, D.“Frequency of Use of Preservatives2007”.Cosmet.Toilet.117,41 - 44 (2002)和“Preservative Encyclopedia”Cosmet.Toilet.117，80 - 96 (2002)中找到。此外，諸如“Cosmetic and Drug Microbiology”, OrthDS ed., Francis&Taylor, Boca Raton, Fla.(2006)中的 Ciccognani D.的文章 CosmeticPreservation Using Enzymes中描述的那些防腐劑之類的酶防腐體系也可有效用于局部用組合物中。
[0055]一般而言，優(yōu)選地，防腐劑的量至少為局部用組合物的總重量的約0.01wt%，至少為約0.lwt%，高達(dá)約10wt%。典型地，使用所需防腐劑的最小量，典型地，所述防腐劑以少于局部用組合物的重量的約5wt%存在，更典型地，所述防腐劑以基于局部用組合物的重量的約0.^^%至約2.0wt%的范圍存在。[0056]局部用組合物還可含有皮膚病學(xué)上可接受的載體。如本文使用的短語(yǔ)“皮膚病學(xué)上可接受的載體”是指所述載體適于局部施用于具有良好的美學(xué)特性的皮膚、毛發(fā)、指甲等，與發(fā)酵提取物和任何其它成分相容，并且不會(huì)引起任何不期望的安全性問(wèn)題或毒性問(wèn)題。皮膚病學(xué)上可接受的載體也是一般美容和/或藥學(xué)上可接受的。
[0057]所述皮膚病學(xué)上可接受的載體或“載體”可為多種不同形式的載體。例如，乳劑載體，包括，但不限于，水包油、油包水、水包油包水和硅樹(shù)脂包水包油乳劑在本文中是有用的。這些乳劑可包括較大的粘性范圍，所述粘性范圍例如約IOOcps至約200000cps。這些乳劑也可使用機(jī)械泵容器或使用常規(guī)推進(jìn)劑的加壓氣溶膠容器以噴霧形式遞送。這些載體還可以奶油凍(mousse)的形式遞送。其它合適的局部用載體包括無(wú)水液體溶劑，例如油、醇和硅樹(shù)脂(例如礦物油、乙醇、異丙醇、二甲聚硅氧烷、環(huán)甲硅油等)；基于水性的單相液體溶劑(例如含氫的醇溶劑體系)；這些無(wú)水和基于水性的單相液體溶劑的增稠形式(例如，其中通過(guò)添加適當(dāng)?shù)哪z、樹(shù)脂、蠟、聚合物、鹽等增大溶劑的粘性以形成固體或半固體)?？捎糜诒景l(fā)明的局部用載體體系的實(shí)例在以下四篇文獻(xiàn)中描述:"Sun ProductsFormulary^Cosmetics&ToiIetries,第 105 卷，第 122 - 139 頁(yè)(1990 年 12 月)；"SunProducts Formulary", Cosmetics&Toiletries,第 102 卷，第 117 - 136 頁(yè)(1987 年 3 月)；美國(guó)專利第4，960，764號(hào)；和美國(guó)專利第4，254，105號(hào)。
[0058]所述載體可含有局部用組合物的重量的約50wt%至約99wt%，一般而言，所述載體的量為基于所述局部用組合物的總重量的約75wt%至約99wt%。典型地，所述載體占所述組合物的總重量的約85wt%至約95wt%。
[0059]示例性的載體包括含氫的醇體系和水包油乳劑。當(dāng)所述載體為含氫的醇體系時(shí)，所述載體可含有約0%至約99%的乙醇、異丙醇或者其混合物，以及約1%至約99%的水。更優(yōu)選的是含有約5%至約60%的乙醇、異丙醇或其混合物，以及約40%至約95%的水的載體。尤其優(yōu)選的是含有約20%至約50%的乙醇、異丙醇或者其混合物，以及約50%至約80%的水的載體。當(dāng)所述載體為水包油乳劑時(shí)，所述載體可包括用于制備這些乳劑的常規(guī)賦形劑成分中的任何一種。對(duì)合適載體的更加詳細(xì)的討論可在美國(guó)專利第5，605，894號(hào)和美國(guó)專利第5，681，852號(hào)中找到。
[0060]任選地，局部用組合物可含有其它功能性成分，例如，水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)節(jié)劑、軟化劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、濕潤(rùn)劑、保濕劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、溶劑和芳香劑。此外，個(gè)人護(hù)理組合物還可含有活性成分，例如植物萃取物、營(yíng)養(yǎng)素、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑止癢劑、抗痘成分、遮光劑、防腐劑等。
[0061]含有所述發(fā)酵提取物的局部用組合物可用于各種不同類型的美容制劑，包括，但不限于乳液、軟膏、霜齊?、噴霧、針齊?、水性凝膠或水-醇混合物凝膠、奶油凍、貼齊?、護(hù)具、罩、濕潤(rùn)的面膜、擦拭巾、固體棒、清潔棒、唇膏、氣溶膠霜?jiǎng)?、無(wú)水粉末、滑石、補(bǔ)劑、油、乳劑和浴鹽。這些美容制劑可通過(guò)局部施加在皮膚上使用。
[0062]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明還提供組合物的濃縮物，所述組合物的濃縮物含有(a)發(fā)酵提取物；(b)足以對(duì)成分(a)起滅菌作用或生物靜態(tài)作用的防腐劑，其中，成分(a)的量為所述組 合物的重量的約90%至約99.9%，成分(b)的量為所述組合物的重量的約0.1%至10%。一般而言，所述發(fā)酵提取物為所述組合物的重量的約98%至約99.5%，成分(b)的量為所述組合物的重量的0.5%至2%。諸如溶劑或載體之類的其它額外的成分也可存在于所述濃縮物中。
[0063]下列實(shí)施例意于舉例說(shuō)明本發(fā)明的范圍，對(duì)本發(fā)明的范圍不構(gòu)成任何限制。除非另有明確說(shuō)明，所有部分和百分?jǐn)?shù)為重量部分和重量百分?jǐn)?shù)，所有溫度的單位為攝氏度。
[0064]實(shí)施例
[0065]實(shí)施例1
[0066]微生物和培養(yǎng)基
[0067]從乳清粉提取物中分離細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，特別優(yōu)選屬于乳桿菌科和丙酸桿菌科的微生物培養(yǎng)物。嚴(yán)格根據(jù)生長(zhǎng)速率選擇第一微生物(乳桿菌科vs.丙酸桿菌科)。丙酸桿菌科由于其具有更快的生長(zhǎng)速率而被選擇，因?yàn)槔硐肭闆r是代謝并富集培養(yǎng)基中的大多數(shù)初級(jí)成分。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，使兩種微生物在缺氧條件下生長(zhǎng)或在微嗜氣的條件下(沒(méi)有氧氣或有限的氧氣)生長(zhǎng)。將原種培養(yǎng)物保持在含有胰蛋白胨、酵母 提取物、過(guò)濾的乳清提取物(PH7.0)和瓊脂(Sigma，St.Louis, MO)的培養(yǎng)基中。使母種培養(yǎng)物在含有培養(yǎng)基的震蕩燒瓶中生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基包含酵母提取物10%、大豆胰蛋白胨肉湯5%、磷酸二氫鉀2.5%、磷酸氫二鉀1.5%、乳糖10%、丙三醇5% (SigmaSt.Louis, MO)。除了上述培養(yǎng)基成分，向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加諸如氨基酸、微生物混合物和礦物質(zhì)之類的補(bǔ)充生長(zhǎng)因子(Sigma，St.Louis, MO)。在整個(gè)過(guò)程中使用阻沫劑σ -乳劑B (Sigma, St.Louis, MO)。
[0068]生物反應(yīng)器
[0069]在通過(guò)震蕩燒瓶試驗(yàn)優(yōu)化處理之后，將工藝按比例增加至2L和15L發(fā)酵階段(2L:新澤西州愛(ài)迪生的New Brunswick Scientific和15L:加州福斯特城的ApplikonBiotechnology) 0使兩種微生物在缺氧條件下生長(zhǎng)，通過(guò)溶氧檢測(cè)器監(jiān)測(cè)氧濃度。將氮?dú)鈬娙肷锓磻?yīng)器中以控制氧的濃度并用于次級(jí)代謝產(chǎn)物表達(dá)。通過(guò)可滅菌的DO探針時(shí)刻監(jiān)測(cè)缺氧條件，并通過(guò)在發(fā)酵罐中以最低限度攪拌保持缺氧環(huán)境，所述攪拌的最大速度為100至150rpm。氮速率設(shè)為0.01至0.5VVM (體積空氣/容器體積/每分鐘)。為了制備本發(fā)明的雙重發(fā)酵提取物，使謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)細(xì)胞培養(yǎng)物在25°C至30°C下生長(zhǎng)；最優(yōu)選地，在27°C下生長(zhǎng)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，使兩種微生物同時(shí)在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)(第二微生物植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)在存在第一微生物的條件下生長(zhǎng))。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基有限時(shí)，在特定時(shí)間點(diǎn)(接種第一微生物后16至18小時(shí)；600nm下光密度> 5)接種植物乳桿菌；由此引起封閉環(huán)境中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)。在營(yíng)養(yǎng)受限階段引入第二微生物植物乳桿菌導(dǎo)致在兩種微生物之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性的、‘生存型’反應(yīng)，尤其當(dāng)生長(zhǎng)在諸如生物反應(yīng)器之類的封閉體系中時(shí)。連續(xù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)消耗(通過(guò)在線監(jiān)測(cè)、光密度檢測(cè))。在引入第二微生物之前，由營(yíng)養(yǎng)限制和第一微生物對(duì)氧的消耗引起壓力。
[0070]通過(guò)從雙重微生物的胞外分泌物中分離生物質(zhì)和提取活性成分獲得最終雙重發(fā)酵提取物?？赏ㄟ^(guò)過(guò)濾進(jìn)一步純化所述雙重發(fā)酵提取物?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的選擇性分子量膜過(guò)濾方法進(jìn)一步濃縮該雙重發(fā)酵提取物。水性培養(yǎng)基中雙重發(fā)酵提取物的最終濃縮物至少為0.01%。更優(yōu)選地，雙重發(fā)酵提取物的濃度至少為0.1 %。使用濃度為0.5至1.1 %的苯氧乙醇作為防腐劑(密蘇里州圣路易斯的Sigma)。
[0071]兩種單一微生物對(duì)照(乳桿菌科與丙酸桿菌科)在與上述相同的條件下生長(zhǎng)。微生物對(duì)照樣品的區(qū)別參數(shù)為沒(méi)有第二微生物且沒(méi)有誘導(dǎo)次級(jí)代謝產(chǎn)物。使用上述選擇性分子量膜過(guò)濾技術(shù)純化單一微生物的提取物。
[0072]實(shí)施例2:通過(guò)GC/MS進(jìn)行代謝物分析
[0073]在實(shí)施例1中的雙重發(fā)酵結(jié)束之后進(jìn)行GC-MS以分析不同代謝物的表達(dá)。三種樣品如下分析:
[0074]發(fā)酵對(duì)照1-乳桿菌科
[0075]發(fā)酵對(duì)照2-丙酸桿菌科
[0076]雙重發(fā)酵提取物
[0077]對(duì)水性樣品(1、2和3)進(jìn)行特定的酸提取；其中，分離酸部分，用重氮甲烷試劑進(jìn)行甲基化，對(duì)有機(jī)酸的相應(yīng)甲酯進(jìn)行GC-MS分析。將測(cè)試樣品直接注入GC中，通過(guò)揮發(fā)性成分頂部空間分析(頂部空間GC-MS)還對(duì)低分子量酸進(jìn)行分析。圖1和圖2為對(duì)照樣品微生物I和微生物2的GC-MS分析。圖3表示雙重發(fā)酵提取物的GC-MS分析，說(shuō)明兩種微生物的競(jìng)爭(zhēng)誘導(dǎo)新代謝物的表達(dá)，否則所述新代謝物不表達(dá)(如果微生物單獨(dú)生長(zhǎng))。
[0078]實(shí)施例3人皮膚細(xì)胞微陣列分析
[0079]使用人基因組微陣列(Agilent Technologies)檢測(cè)如實(shí)施例1所述制備的雙重發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)兩種皮膚細(xì)胞系(纖維母細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞)的影響。用來(lái)自實(shí)施例1的1%的雙重發(fā)酵物處理細(xì)胞24小時(shí)。離心得到的處理過(guò)的皮膚細(xì)胞，用RNA Later(Ambion)重懸含有細(xì)胞核物質(zhì)的小粒并在4°C下保存。使用RiboPure RNA提取試劑盒(Ambion)提取來(lái)自人細(xì)胞的總RNA，隨后使用Message AMP aRNA試劑盒(Ambion)擴(kuò)增mRNA。對(duì)于該陣列，使用MicroMax陣列標(biāo)記試劑盒(Perkin Elmer)用Cy_3或Cy_5對(duì)aRNA的樣品進(jìn)行突光標(biāo)記。然后將標(biāo)記的aRNA施加至表皮纖維母細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的皮膚細(xì)胞DNA微陣列芯片并雜交過(guò)夜(Agilent Technologies)。第二天,洗漆芯片并用Axon4100A DNA微陣列掃描
儀掃描，使用Axon Genepix-Pro?軟件分析。用于基因微陣列分析的方法可在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第US2006/0110815號(hào)中找到。
[0080]從獲自人體表皮角質(zhì)細(xì)胞和人體皮膚纖維母細(xì)胞基因微陣列的感興趣的基因中篩選與重要的特定皮膚功能有關(guān)的基因。對(duì)與多種不同的皮膚新陳代謝功能有關(guān)的幾個(gè)基因的上調(diào)(與中等水平的比率> 1.3)或下調(diào)(與中等水平的比率< 0.7)進(jìn)行分析。為了進(jìn)行基因微陣列分析，術(shù)語(yǔ)“上調(diào)”是指RNA過(guò)表達(dá)的基因。術(shù)語(yǔ)“下調(diào)”是指RNA低表達(dá)。結(jié)果在表1中報(bào)道。
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種局部用組合物，所述組合物含有從至少兩種微生物的同時(shí)發(fā)酵或順序發(fā)酵中取出的發(fā)酵提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的局部用組合物，其中，所述發(fā)酵提取物含有第二微生物的代謝物，所述第二微生物的代謝物在存在第一微生物的代謝物的條件下生長(zhǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的局部用組合物，其中，所述第二微生物的代謝物與所述第一微生物的代謝物同時(shí)生長(zhǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的局部用組合物，所述組合物還含有數(shù)量足以對(duì)所述發(fā)酵提取物起滅菌作用或生物靜態(tài)作用的防腐劑和皮膚病學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，每一微生物選自:脈孢菌屬，長(zhǎng)_殼屬，麥角菌屬，炭角菌屬，座堅(jiān)殼屬，柔膜菌屬，核盤(pán)霉屬，柄灰包屬，須腹菌屬，耳柱干真菌類，毛霉菌，根霉屬菌，蟲(chóng)霉屬，網(wǎng)柱菌屬，芽枝莓屬，壺菌屬，水霉屬，霜霉屬，白銹菌屬，腐霉屬，喇叭菌屬，皮特瑞菌屬，疫霉屬，根腫菌屬，塊菌屬，齒菌屬，茶潰屬，染料衣屬，雞皮衣屬，松蘿屬，扁枝衣屬，樹(shù)花屬，樹(shù)發(fā)屬，石蕊屬，梅衣屬，冰島衣屬，傘菌屬，雞油菌屬，類臍菇屬，鬼傘屬，乳菇屬，皮傘屬，側(cè)耳屬，鱗傘屬，紅菇屬，球蓋菇屬，粉紅孢子傘菌類，環(huán)柄菇科，伏革菌屬，薄膜革菌屬，口蘑屬，臺(tái)蕈屬，杯傘屬，火菇屬，酵母屬，裂殖酵母屬，曲霉菌屬，曲霉屬，梭孢殼屬，盤(pán)菌屬，普拉塔暗盤(pán)菌，羊肚菌屬，叢耳菌屬，馬鞍菌屬，鹿花菌屬，鬼筆目，狄克提歐菌屬，蛇頭菌屬，籠頭菌屬，三叉鬼筆屬，馬勃菌屬，馬勃屬，地星屬，根灰包菌屬，阿斯特斯菌屬，鳥(niǎo)巢菌屬，伽氏灰菇屬，地紅菇屬，腹牛肝菌屬，地花菌屬，新香菰屬，黑孔菌屬，褐腐干酪屬，多孔菌屬，牛排菌屬，層孔菌屬，牛肝菌屬，褐小牛肝菌屬，疣柄牛肝菌屬， 褶孔牛肝菌屬，乳牛肝菌屬，松塔牛肝菌屬，牛肝菌，銀耳屬，木耳屬，花耳屬，柵銹菌屬，柱銹菌屬，柄銹屬，膠銹菌屬，腥黑粉菌屬，條黑粉菌屬，隔擔(dān)菌屬，濕傘屬，蠟傘屬，濕菌髓，新蠟傘屬，絲膜菌屬，裸傘屬，發(fā)癬菌屬，小孢霉屬，串珠霉屬，念珠菌屬，小尾孢屬，青霉菌屬，芽生菌屬，尾孢屬，綠核菌屬，瘤座孢屬，鐮孢菌屬，絲核菌，束絲菌屬，菌核屬，地舌菌，或松蕈屬；類諾卡氏菌科，氣微菌屬；弗萊德門(mén)菌屬，撲科研菌屬，大理石雕菌屬；微白霜菌屬，類諾卡氏菌屬，脂肪肝菌屬，丙酸胞菌屬，丙酸單胞菌屬，熱孔菌屬，布魯克勞尼亞菌屬，黃絡(luò)球菌屬，丙酸桿菌屬，微丙酸菌屬，乳桿菌屬，夏普氏菌屬，兩性囊霉屬，無(wú)梗囊霉菌屬，恩氏孔菌屬，殘孔菌屬，阿米露孔菌屬，薄孔菌屬，似薄孔菌屬，深黃孔菌屬，黃孔菌屬，牛舌草孔菌屬，蠟孔菌屬，擬蠟菌屬，齒毛菌屬，克里歐孔菌屬，隱孔菌屬，迷孔菌屬，擬迷孔菌屬，丹特羅亞菌屬，二絲孔菌，董氏孔菌，擬孔菌屬，彩孔菌屬，硫色絢孔菌屬，拉氏孔菌，大孔菌屬，灰黑孔菌，亞灰樹(shù)花菌屬，黑孔菌屬，少孔菌屬，歐式孔菌屬，銳孔菌屬，帕氏孔菌屬，皮拉孔菌屬，剝管菌屬，臥孔菌屬，波斯特孔菌屬，硬孔菌屬，苔芝屬，紅木色孔菌屬，栓菌屬，干酪菌屬，茯苓菌，古老球菌屬，火球菌屬，高溫球菌屬，絲衣霉屬，毛薩托菌屬，克勞姆菌屬，雙叉菌屬，埃德菌屬，翹孢霉屬，艾里斯菌屬，正青霉屬，散囊菌屬，芬尼菌屬，鉤囊菌屬，半內(nèi)果菌屬，新石座菌屬，新薩托菌屬，擬青霉屬，石座菌屬，西格菌屬，裸節(jié)菌屬，嗜熱子囊菌屬，特里希菌屬，沃卡菌屬，曲菌屬，梅麗霉屬，擬青霉，菲亞羅霉屬，賽捷羅霉屬，隔梭孢屬，纓霉屬，疣青霉，乳酸桿菌科，丙酸桿菌科，放線菌目，馬拉色菌屬和微藻。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中，每一微生物選自:酵母屬，裂殖酵母屬，丙酸胞菌屬，丙酸單胞菌屬，熱孔菌屬，丙酸桿菌科，微丙酸菌屬，乳酸桿菌科，彩孔菌屬，革菌科，半知發(fā)菌科，馬拉色菌科，乳酸桿菌科，丙酸桿菌科，放線菌目和微藻。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述第一微生物為謝氏丙酸桿菌，所述第二微生物為植物乳桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述第一微生物為微藻，第二微生物為植物乳桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物還含有防腐劑，所述防腐劑選自:水楊酸、山梨酸、苯氧乙醇、芐醇、乙醇、季銨鹽-15、與底物組合的葡糖氧化酶和乳過(guò)氧化物酶、及上述物質(zhì)的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述防腐劑含有苯氧乙醇。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的組合物，其中，所述防腐劑的量為基于所述組合物的總重量的至少0.1wt%。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物還含有至少一種選自以下的成分:水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)節(jié)劑、軟化劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色齊?、濕潤(rùn)劑、保濕劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、溶劑、芳香劑、植物萃取物、營(yíng)養(yǎng)素、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑止癢劑、抗痘成分、遮光劑、防腐劑及其組合。
13.根據(jù)權(quán) 利要求4所述的組合物，其中，所述組合物含有0.lwt%至10wt%的所述發(fā)酵提取物、0.1￥1:%至10wt%的所述防腐劑以及5(^1:%至95wt%的所述皮膚病學(xué)上可接受的載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物含有按重量計(jì)90.0%至99.9%的所述發(fā)酵提取物和按重量計(jì)0.1%至10.0%的所述防腐劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中，所述發(fā)酵提取物含有在存在植物乳桿菌的代謝物的條件下同時(shí)生長(zhǎng)的謝氏丙酸桿菌的代謝物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中，成分(a)含有在存在植物乳桿菌的代謝物的條件下同時(shí)生長(zhǎng)的微藻的代謝物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述發(fā)酵提取物通過(guò)含有以下步驟的方法制備: (i)使用通過(guò)化學(xué)方法定義的第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基使第一微生物生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，以制備含有所述第一微生物和由所述第一微生物表達(dá)的次級(jí)代謝物的第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基； (?)使所述第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基與第二微生物接觸； (iii)在第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使所述第一微生物和所述第二微生物同時(shí)發(fā)酵以制備含有水溶性部分和水不溶性部分的發(fā)酵混合物；以及 (iv)從所述發(fā)酵混合物中分離所述水不溶性部分，由此隔離所述水溶性部分并制備出所述雙重發(fā)酵提取物。
18.一種制備來(lái)自同時(shí)發(fā)酵的發(fā)酵提取物的方法，所述方法包括: (i)使用通過(guò)化學(xué)方法定義的第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基使第一微生物生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，以制備含有所述第一微生物和由所述第一微生物表達(dá)的次級(jí)代謝物的第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基； (?)使所述第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基與第二微生物接觸； (iii)在第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使所述第一微生物和所述第二微生物同時(shí)發(fā)酵以制備含有水溶性部分和水不溶性部分的發(fā)酵混合物；以及(iv)從所述發(fā)酵混合物中分離所述水不溶性部分，由此隔離所述水溶性部分并制備出所述雙重發(fā)酵提取物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述第一微生物為謝氏丙酸桿菌，所述第二微生物為植物乳桿菌。
20.根據(jù)權(quán)利要求18 所述的方法，其中，所述第一微生物為微藻吾肯氏壺菌，所述第二微生物為植物乳桿菌。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一微生物與所述第二微生物在有氧條件下、無(wú)氧條件下或者組合條件下生長(zhǎng)。
22.—種刺激皮膚細(xì)胞中的透明質(zhì)酸和⑶44生成的方法，所述方法包括使使用者的皮膚與根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的局部用組合物接觸。
23.一種刺激皮膚細(xì)胞中的透明質(zhì)酸和半胱天冬酶-14生成的方法，所述方法包括使使用者的皮膚與根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的局部用組合物接觸。
【文檔編號(hào)】A61K36/02GK103957997SQ201280052827
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月25日
【發(fā)明者】詹姆斯·文森特·格魯伯, 史密瑟·拉奧 申請(qǐng)人:奧麒個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品公司