包含gsk-3抑制劑的腹膜透析液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腹膜透析液，其包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特別是抑制(GSK)-3β活性的化合物，所述的腹膜透析液用于預(yù)防感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥，例如腹膜炎，腹膜損傷、損壞和衰竭，屏障功能障礙和間皮細胞脫落。
【專利說明】包含GSK-3抑制劑的腹膜透析液
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種腹膜透析液(在下文中也被稱為“PDF”)。
【背景技術(shù)】
[0002]與血液透析相比，腹膜透析(PD)是一種安全經(jīng)濟有效，同時提供了更好的生活質(zhì)量的腎臟替代療法。但是，腹膜透析治療常常導(dǎo)致通常與腹膜組織變化和腹膜完整性的損失相關(guān)的膜的超濾功能的逐漸衰退(I)。
[0003]目前，超過三分之二的患者在他們治療的頭兩年遭受著ro相關(guān)的感染性或非感染性并發(fā)癥(例如腹膜炎，腹膜功能退化或技術(shù)缺陷)。
[0004]不同種類的液體可用于H)。這些液體之間的區(qū)別是滲透劑的種類、其濃度和緩沖液的種類和在ro液中的pH值。
[0005]在臨床實踐中，仍然代表約80%的所有ro液的標(biāo)準(zhǔn)液含有非生理性高濃度葡萄糖作為它們的滲透劑。腹膜的病理變化主要由于高滲性高糖濃度和低PH值(2)。更復(fù)雜的慢性損傷由葡萄糖降解產(chǎn)物(GDPs)誘發(fā)，所述葡萄糖降解產(chǎn)物在腹膜透析液的熱殺菌過程中生成(3)。由于更多的腔室系統(tǒng)的使用，新的和更具的生物相容性的葡萄糖基的ro液具有正常PH值和低含量的⑶P;但是，這些液體是非常昂貴的，因此其臨床應(yīng)用在全局設(shè)置(global setting)中仍被限制。
[0006]在市場上也有替代的、非葡萄糖基的ro液，例如艾考糊精或氨基磺酸基的ro液，但是，它們的使用被限制為每天一次交換并且其超濾能力不如葡萄糖基的溶液好。而且，它們還具有更低的pH值，其加強了腹膜中不利的細胞變化。
[0007]因此，尋找減少ro液毒性的策略仍然是試驗和臨床腎病中的一個現(xiàn)行的領(lǐng)域，并且具有巨大的醫(yī)療和社會經(jīng)濟意義。
[0008]之前在許多研究中已證實了 HSPs對在試驗ro的間皮細胞存活方面具有顯著影響，因為由藥理學(xué)或質(zhì)粒介導(dǎo)的方式的HSPs的上調(diào)保護了間皮細胞不受ro液的毒性(12，13，14)。
[0009]然而，有趣的是，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖基ro液的培養(yǎng)導(dǎo)致間皮細胞中的HSP的下調(diào)表達，引起弱化的細胞防御機制。
[0010]W02008/106702公開了一種碳水化合物基的腹膜透析液，其包含選自由以下組成的組的化合物:
[0011]-谷氨酰胺，優(yōu)選L-谷氨酰胺，
[0012]-能夠釋放游離形式的谷氨酰胺，L-谷氨酰胺的二肽，所述的二肽優(yōu)選選自由谷氨酰-甘氨酸、甘氨酸-谷氨酰胺、谷氨酰胺酰-丙氨酸和丙氨酰-谷氨酰胺組成的組中，
[0013]-由兩個至七個谷氨酰胺組成的寡肽，優(yōu)選L-谷氨酰胺殘基，和
[0014]-它們的混合物。
[0015]仍然有需要獲得腹膜透析液，使用所述的腹膜透析液，可以預(yù)防或至少抑制感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥的發(fā)生，例如腹膜炎，腹膜損傷、損壞和衰竭，屏障功能障礙和間皮細胞脫離。通過預(yù)防這樣的感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥，患者經(jīng)過ro治療的技術(shù)缺陷可以被抑制。術(shù)語“技術(shù)缺陷”是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且意味著需要終止腹膜透析，并切換到可替換的腎臟替代療法，如血液透析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種腹膜透析液，使用所述的腹膜透析液，可以預(yù)防或抑制這種感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥的發(fā)生。
[0017]一個方面，本發(fā)明涉及一種腹膜透析液，其包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特別是抑制(GSK)-3 β活性的化合物，所述的腹膜透析液用于預(yù)防感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥，例如腹膜炎，腹膜損傷、損壞和衰竭，屏障功能障礙和間皮細胞脫落。
[0018]另一方面，本發(fā)明涉及一種艾考糊精基的腹膜透析液，其包含抑制糖原合酶激酶(GSK) -3活性，特別是抑制(GSK) -3 β活性的化合物。
[0019]再另一方面，本發(fā)明涉及一種抑制糖原合酶激酶(GSK)_3活性，特別是抑制(GSK) -3 β活性的化合物，所述的化合物用于預(yù)防感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥，例如腹膜炎，腹膜損傷、損壞和衰竭，屏障功能障礙和間皮細胞脫落。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖?:用具有不同的滲透劑和毒性特性的不同的市售的ro液處理的間皮細胞中的P-GSK-3 β的表達。 [0021]圖2:用具有不同的滲透劑和毒性特性的不同的市售的ro液處理的間皮細胞中的LDH釋放。
[0022]圖3:與對照組細胞相比，由中性紅吸附的百分比評估細胞活性。
[0023]圖4:通過熒光素酶試驗評估熱休克因子-1活性。
[0024]圖5:通過蛋白質(zhì)印跡法評估熱休克蛋白-72(HSP_72)的表達。
[0025]圖6:LDH釋放到上清液中。
[0026]圖7:通過熒光素酶試驗評估熱休克因子(HSF-1)的轉(zhuǎn)化活性。
[0027]圖8:通過蛋白質(zhì)印跡法評估的熱休克蛋白-72(HSP_72)的表達。
【具體實施方式】
[0028]糖原合酶激酶-3 β (GSK-3 β )是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。GSK-3 β本身是由不同的上游激酶在絲氨酸-9殘基處通過磷酸化被調(diào)節(jié)并被抑制，除上游激酶外，Akt和血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶-1 (SGK-1)已經(jīng)獲得更多的關(guān)注(4)。GSK-3 0最初被鑒定為一個關(guān)鍵的酶，其和不同濃度的葡萄糖和GDPs反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)糖原質(zhì)合成(5，6)。然而，后續(xù)工作證實，GSK-3 β在整體細胞存活，細胞周期進程和遷移中具有核心作用。
[0029]雖然GSK-3 β被描述于約30年前，但是它作為潛在的藥物靶標(biāo)的興趣僅在本世紀(jì)初開始突出，這是由于GSK-30被發(fā)現(xiàn)作為涉及多個生理和病理過程的多面激酶。許多研究報道了通過選擇性的小分子抑制劑或具有鋰的GSK-3 3抑制在各種疾病模型中具有預(yù)防特性。GSK-30抑制被證實在II型糖尿病中改善胰島素耐受性(23，24)，在類似于阿爾茨海默氏病的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂中具有有益效果(25)，并減少心肌肥大和局部缺血(26)。[0030]許多GSK-3 β靶標(biāo)是轉(zhuǎn)錄因子(HSF-1，β -鏈蛋白，C_Jun，CREB)，其導(dǎo)致改變的應(yīng)激反應(yīng)，增加的細胞凋亡和神經(jīng)傳遞的變化。GSK-30還能夠調(diào)節(jié)細胞骨架元素(7，8)，完全使GSK-3 0具有在細胞命運中重要作用的細胞信號傳輸?shù)闹袠薪閷?dǎo)因子。
[0031]GSK-3 β的主要靶標(biāo)之一是熱休克因子-1 (HSF-1)，細胞保護熱休克蛋白(HSP)表達的關(guān)鍵誘導(dǎo)物(9，10)。脅迫條件下，HSF-1在多步方法中被活化，所述的方法包括過度磷酸化，轉(zhuǎn)位到細胞核中，HS元素(HSE)的結(jié)合，隨后由相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄。HSF-1被磷酸化，并由此通過導(dǎo)致HSP含量減少的GSK-3 0被抑制(11)。在絲氨酸-303殘基處GSK-3 β磷酸化HSF-1，負面調(diào)劑它與DNA和HSF-1-依賴型轉(zhuǎn)錄的結(jié)合，所述HSF-1-依賴型轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致抑制的HSP-72的生成(21)，另一方面，GSK-3 β的抑制增加了對改進細胞防御起作用的熱休克反應(yīng)。
[0032]由于GSK_3i3是由葡萄糖和⑶Ps嚴(yán)格調(diào)節(jié)的(15)，本發(fā)明的發(fā)明人已考慮到，這可能是在PD-相關(guān)的細胞信號中的相關(guān)分子角色。但是，GSK-3i3和H)之間的直接關(guān)聯(lián)還沒有被描述過。
[0033]假設(shè)抗-存活GSK-3 β的活性的增加(可能由H)液體暴露介導(dǎo)的)抑制促存活HSF-1，在ro過程中，熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。因此，阻斷GSK-3i3的活性可能會導(dǎo)致HSF-1活性的增強，從而引起更高的熱休克蛋白的表達和較少的細胞毒性。
[0034]目前已發(fā)現(xiàn)GSK-3的抑制，特別是GSK-3β抑制減少了用H)液體處理過的細胞中的間皮細胞損傷和死亡率。間皮細胞的保護相應(yīng)于較高的HSF-1活性和HSP-72的表達。 [0035]使用選自由碳水化合物基透析液和氨基酸基透析液組成的組中的ro液體，這種效果是特別顯著。使用具有pH值為7.3或更低，優(yōu)選為7.0或更低，最優(yōu)選為6.0或更低的碳水化合物基的腹膜透析液，這種效果甚至更加顯著。
[0036]碳水化合物基的腹膜透析液特別是葡萄糖或艾考糊精基的那些。最優(yōu)選，所述腹膜透析液基于艾考糊精。
[0037]因此，本發(fā)明特別優(yōu)選實施方案是基于艾考糊精的腹膜透析液，其包括抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特別是抑制(GSK)-3 β活性的化合物。
[0038]如上所述，本發(fā)明的又一方面涉及一種抑制糖原合酶激酶(GSK)_3活性，特別是抑制(GSK)_3i3的化合物，所述的化合物用于預(yù)防由使用腹膜透析液治療引起的感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥，例如用腹膜炎，腹膜損傷、損壞和衰竭，屏障功能障礙和間皮細胞脫落。
[0039]所述的化合物優(yōu)選在腹膜透析治療過程中與一種腹膜透析液一起施用。所述的ro液體優(yōu)選選自上文已討論過的F1D液體。
[0040]抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特別是抑制(GSK)_3i3活性的化合物優(yōu)選選自由以下組成的組中:鋰，tideglusib, NP-103, GSK-3 β抑制劑I (TDZD-8，4-芐基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮)，GSK-3 β抑制劑11(2-硫代(3-碘芐基)-5-(1-吡I啶基)-[1，3，4]_ 惡二唑)，GSK-3 抑制劑 IV(SB-216763，3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5- 二酮)，GSK-3 抑制劑 IX_，(2，Z，3’ E)_6_ 溴靛玉紅-3，-月虧)，GSK-3 β抑制劑VI (2-氣-1- (4, 5- 二漠-喔吩_2_基)-乙麗)，GSK-3 β抑制劑￥11(2，4’-對溴苯酰甲基溴)，GSK-3 β抑制劑VIII (AR Α014418，N-(4-甲氧基芐基)-N，- (5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲)，GSK-3 抑制劑 X (B I O-丙酮肟，(2，Ζ，3’ Ε) -6-溴靛玉紅-3’-丙酮肟)，GSK-3 β抑制劑XI (3-(1-(3-羥基丙基)-1Η-吡咯并[2，3_b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5- 二酮，7AIPM)，GSK-3抑制劑XIII (5-甲基-1H-批唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺)，GSK-3 β 抑制劑 XII(TWS119，3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]氧基苯酚雙三氟乙酸鹽)，GSK-3 β抑制劑XVIII (2-(氯-4- (4-噻吩-2-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基)-(4-甲基-哌嗪_1_基)-甲酮)，GSK-3 β抑制劑X (B I O-丙酮肟，(2，Ζ，3’ Ε) -6-溴靛玉紅_3’ -丙酮肟)，GSK-3 β抑制劑XI (3-(1-(3-羥基丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，
5-二酮，7AIPM) ,GSK-3P抑制劑XIX (頂_12，C22H2tlFN3O2，吲哚基順丁烯二酰亞胺-衍生物)，GSK-3抑制劑XVI (6- (2- (4- (2,4- 二氯苯基)-5- (4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基)乙烷-氨基)_氰基吡啶，CHIR99021), GSK-3抑制劑XVII (5-芐氨基-3-氧代-2，3- 二氫-1,2,4-噻二唑，TDZD-20)，GSK-3 抑制劑 XXII，化合物 A (6-甲基-N-[3-[ [3- (1-甲基乙氧基)丙基]氨基甲?；鵠-1H-吡唑-4-基]吡啶-3-甲酰胺)，GSK-3 β抑制劑 XXIII, 3F8 (5-乙基-7，8-二甲氧基-1H-吡咯并[3，4-C]-異喹啉-1，3-(2Η) - 二酮)，GSK-3 β 肽抑制劑(L803，H-KEAPPAPPQSpP-NH2)，GSK-3 β 肽抑制劑(L803-MTS，MYR-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2)，GF-109203X (2-[1- (3- 二甲基氨基丙基)吲哚 _3_ 基]_3_ (吲哚-3-基)馬來酰亞胺)及其藥物可接受的鹽和它們的混合物。
[0041]在一個優(yōu)選實施方案中，抑制糖原合酶激酶(GSK)_3活性的化合物是鋰鹽，具體是氯化鋰或碳酸鋰。在透析液中鋰鹽的濃度優(yōu)選為ImM至IOmM,最優(yōu)選2mM至5mM。
[0042]鋰是眾所周知的通過針對鎂競爭抑制GSK-3 β的GSK-3 β抑制劑(27)。自十九世紀(jì)五十年代以來，鋰已用于雙相心境障礙(bipolar mood disorders)的治療，而那時并不知道鋰的具體作用模式。在1996年，它被發(fā)現(xiàn)是GSK-3 0的有效抑制劑并且證據(jù)越來越多的表示它可能是在雙相障礙中對于鋰已知且利用的情緒穩(wěn)定作用的基礎(chǔ)機制之一(16，17，18，22)。除 了心境障礙，鋰正處于肌萎縮側(cè)索硬化癥治療和在供體干細胞移植后的腸道移植物抗宿主病治療的II期臨床試驗階段。
[0043]更少知道關(guān)于通過鋰介導(dǎo)的GSK-3 0抑制的下游活動是否涉及HSPs。但是最近，鋰保護作用被證實在試驗?zāi)Ｐ椭信c改進的HSP含量相關(guān)，所述的試驗?zāi)Ｐ屠缇植咳毖阅X損傷(30，31)并且鋰的神經(jīng)保護作用也直接歸因于與誘導(dǎo)的HSF-1活性相關(guān)(32，33)。
[0044]在臨床環(huán)境中，為了治療持續(xù)不臥床腹膜透析的患者的雙相癥狀，已經(jīng)將鋰添加到葡萄糖基H)液體中；但是，這種應(yīng)用模式隨后沒有被引入作為常規(guī)給藥(28)。在這項研究中，在2L袋子中，以0.9mM的最終劑量的鋰被添加于2.5%的腹膜透析液?溶液中，并且所述的溶液一天三次變化，從而產(chǎn)生持續(xù)的鋰暴露。
[0045]隨后，在一個試驗性大鼠ro模型中，鋰-碳酸酯與葡萄糖基的ro液體一起給藥，從而研究其對急性超濾率、結(jié)果的效果，但被證實出相反的效果，即鋰降低了超濾速率
(29)。在這項研究中，施用5mM的鋰。
[0046]GSK-3 β抑制也可以通過可替代的、具體的藥理學(xué)抑制劑(GSK-3或GSK-3 β抑制劑)實現(xiàn)。市場上有幾種可用的抑制劑。這些試劑中的一部分目前正用于治療特殊癥狀的臨床研究中，但沒有一個已被施用在ro溶液中或用于PD-引起的腹膜功能衰退的治療。
[0047]除具體的GSK-3抑制劑外，tideglusib ((Zentylor)，非ATP競爭性抑制劑)是唯一一種已獲批臨床使用的抑制劑。Zentylor在2010年獲得FDA的批準(zhǔn)，用于進行性核上性麻痹的治療，并且處于阿爾茨海默氏病治療的II期試驗階段。其它具體的抑制劑是上述命名的那些。
[0048]倘若除了鋰或鋰鹽外的GSK-3抑制劑，在H)液體中適合劑量的相應(yīng)的抑制劑可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
[0049]實施例
[0050]方法
[0051]細胞培養(yǎng)
[0052]人類Met_5a細胞系從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，羅克維爾，MD)購得。全部細胞在補充有L-谷氨酰胺(0.1克/升)、青霉素(100U/毫升)、鏈霉素(100微克/暈升)、10%的胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37°C的含5%的CO2培養(yǎng)箱的潮濕空氣中繁殖。除非另有說明，標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品購自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密蘇里州，美國)。Falcon?組織培養(yǎng)塑料(Becton Dickinson公司，富蘭克林湖，新澤西州，美國)被用于全部細胞培養(yǎng)過程。
[0053]PDF 暴露
[0054]為了用PDF進行培養(yǎng)，使用葡萄糖基低pH值(5.5)的3.86%的液體(腹膜透析液PD4溶液)，艾考糊精基低pH值(5.5)的液體(多聚糖透析液)；來自BAXTER AG，維也納，奧地利的氨基酸基的液體(pH值為6.7)(氨基酸透析液)和葡萄糖基中性pH值的乳酸/碳酸氫鹽緩沖液(生理性雙腔透析液)。葡萄糖基、乳酸緩沖、中性pH的溶液(平衡液)購自奧地利，費森尤斯。
[0055]對照溶液是補充有L-谷氨酰胺(0.1克/升)、青霉素(100U/毫升)、鏈霉素(100微克/毫升)而沒有胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0056]PDF暴露模型:在12孔板中的匯合培養(yǎng)在指定時間(30分鐘或I小時)被暴露到PD液體溶液或同時保持在照培養(yǎng)基中。對于HSF-1活性試驗，在暴露數(shù)次后立刻收集細胞并溶解，而對于LDH和HSP-72的測定，p_GSK_3 β蛋白質(zhì)印跡法分析，細胞被允許通過使用含有10%的FBS的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)16小時。
[0057]氯化鋰處理
[0058]鋰-氯(氯化鋰)購自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密蘇里州，美國)，并且根據(jù)說明按劑量施用。
[0059]LDH 釋放
[0060]對于LDH分析，在上述試驗開始后取出200 μ L等量的上清液并將其保存在_20°C下48小時直到被分析。根據(jù)制造商的說明書，使用Sigma T0X-7LDH試劑盒以重復(fù)形式進行測定。LDH流出物相對于蛋白質(zhì)含量被標(biāo)準(zhǔn)化。
[0061]中性紅吸附
[0062]為了通過中性紅吸附評估細胞存活率，細胞被接種到96孔板并被暴露于如前描述的不同的治療方案。根據(jù)制造商的說明書，使用標(biāo)準(zhǔn)試劑(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO，美國)測定中性紅吸附。
[0063]熒光素酶試驗
[0064]為了確定熱休克因子-1(HSF-1)的特異性結(jié)合，市售的包含熱休克元素[5’CTGGAAITTTCTAGACTGGAAITTTCTAGACTGGAAITTTCTAGA3’ ]的螢光素酶報告載體(LR0038，Panomics公司，意大利)以及一個空白的對照載體是被轉(zhuǎn)染到MET_5a細胞。轉(zhuǎn)染前24小時，MC被接種到96孔細胞培養(yǎng)板中并使其在轉(zhuǎn)染當(dāng)天達到約80-90%的匯合。轉(zhuǎn)染前，每孔0.15微升的Fugene6 (Roche)轉(zhuǎn)染試劑，并且0.1微升的HSE報告載體或?qū)φ蛰d體分別用不含F(xiàn)CS的5 μ I的標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)液稀釋并培養(yǎng)5分鐘?；旌纤龅娜芤喝缓笈囵B(yǎng)30分鐘。10微升的該混合液分別被添加到每個孔中，并在濕潤環(huán)境中37°C，5%的CO2下培養(yǎng)24小時。根據(jù)上述描述進行試驗暴露，并且允許所述細胞恢復(fù)6小時以便于熒光素酶的蛋白質(zhì)合成。沖洗細胞并使用市售的緩沖液(E1531，Promega)裂解。細胞裂解物被轉(zhuǎn)移至白色平底微孔板(Nunc)。使用自動移液管以3秒的間隔將熒光素酶試劑(E1500，Promega)添加，并在2分鐘后使用光度計酶標(biāo)儀(Flx800，BioTek)測定產(chǎn)生的信號。
[0065]蛋白質(zhì)印跡法
[0066]對于蛋白質(zhì)印跡法，蛋白質(zhì)含量由Bradford試驗確定(Biorad,維也納,奧地利)并且等量的蛋白質(zhì)樣品(2微克/通道)使用Pharmacia Multiphore II單元通過標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE電泳分離。大小分級的蛋白質(zhì)隨后在Pharmacia Multiphore II Novablot單元通過半干轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜被攔截在TBS-吐溫的5%的干奶粉中(IOmM Tris, 150mM氯化鈉，0.05%吐溫20，ρΗ7.4)。膜與相應(yīng)的一抗(HSP-72，P-GSK-3 β )培養(yǎng)16小時。通過使用第二、過氧化物酶偶聯(lián)的抗體(抗小鼠或抗兔IgG,DakoCytomation,CA,USA)經(jīng)過培養(yǎng)完成檢測，并且使用ECL蛋白質(zhì)印跡分析體系增強化學(xué)發(fā)光(ECL) (Renaissance,NEN-LifeScience Products,波士頓，MA, USA)。
[0067]數(shù)據(jù)分析
[0068]全部的統(tǒng)計分析使用Sigmaplotll.0軟件(Systat軟件公司，?？死?德國)進行。來自不同組的數(shù)值使用t-test或方差分析(如適用)進行比較。倘若方差分析，Tukey的HSD用作作為事后檢 驗(post-hoc test)?！?.05的P值被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果被表示為平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0069]結(jié)果
[0070]使用常規(guī)ro液體培養(yǎng)誘導(dǎo)間皮細胞損傷和死亡
[0071]使用葡萄糖基低pH值、乳酸緩沖的腹膜透析液(HF，腹膜透析液)和低pH值艾考糊精基的HF (多聚糖透析液)培養(yǎng)間皮細胞導(dǎo)致通過光顯微鏡和活-死(Vital-dead)染色證實的細胞片段的(數(shù)據(jù)未示出)萎縮、脫落和部分所反映的嚴(yán)重細胞損傷。
[0072]這是高LDH釋放(數(shù)據(jù)未示出)、顯著降低的細胞活性和高死亡細胞率并行著。
[0073]使用ro液體培養(yǎng)增加激活的GSK-3 β水平
[0074]PDF培養(yǎng)降低了通過免疫熒光染色(數(shù)據(jù)未示出)并通過蛋白質(zhì)印跡法(圖1)分析的失活的絲氨酸-9磷酸化的GSK-3 β (p-GSK-3 β )的水平，而總GSK-3 β的水平保持不變(圖1)，從而導(dǎo)致與對照細胞相比更高的活性的激酶_GSK-3i3的凈水平(net level)。
[0075]細胞表達，特別是，p-GSK-3 β的定位是通過免疫熒光染色進行分析。用不同H)液體培養(yǎng)后，存在整體P_GSK-3i3更低的表達，同時圍繞細胞核明顯凝結(jié)(數(shù)據(jù)未示出)，尤其是葡萄糖基低PH的PDF和艾考糊精基的液體處理的細胞中。但是，同樣在其它處理(乳酸緩沖、乳酸/碳酸氫鹽緩沖和氨基酸基的H)液體)，當(dāng)與對照細胞相比時，觀察到了降低和凝結(jié)。
[0076]不同市售H)液體對絲氨酸-9P-GSK-3i3的影響表明低pH艾考糊精基的H)液體(多聚糖透析液)與葡萄糖基低PH值的溶液具有類似的作用，即p-GSK-3i3的顯著更低表達。在標(biāo)準(zhǔn)pH值葡萄糖基(乳酸或乳酸/碳酸氫鹽緩沖；分別是平衡液和生理性雙腔透析液)的H)液體和具有適中酸性pH (pH值6.7)氨基酸基的H)液體(氨基酸透析液)效果更不顯著(圖1)。這些結(jié)果與先前對葡萄糖和⑶Ps的觀察是一致(19，20)。這些研究報道了高濃度的葡萄糖降低了(19)，而最終產(chǎn)品的⑶Ps上調(diào)了 GSK-3i3的活性(20)。
[0077]圖1說明:用具有不同的滲透劑和毒性特性的不同的市售的H)液處理的間皮細胞中的p-GSK-3i3的表達。對照細胞用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)基處理，PDF處理的細胞用具有高⑶P含量的葡萄糖基低pH值的ro液體(H)F，腹膜透析液)，艾考糊精基的ro液體(多聚糖透析液)，乳酸緩沖低⑶P、pH值7.4的平衡液，乳酸/碳酸氫鹽緩沖、低⑶P、pH值7.4的生理性雙腔透析液，氨基酸基(氨基酸透析液)的ro液處理。(I小時暴露不恢復(fù))。*p〈0.01vs.對照。
[0078]在ro液體培養(yǎng)后，鋰抑制GSK-3 β，從而減少間皮細胞的細胞損傷和死亡
[0079]與對照相比，葡萄糖基低pH值、含高⑶P和低pH值的艾考糊精基的H)液體引起明顯的LDH升高，同時細胞存活率顯著減少(圖2)。葡萄糖基正常pH值的和氨基酸基的H)液體引起的較溫和的顯著LDH的釋放(圖2)，這與顯著的細胞死亡不相關(guān)(數(shù)據(jù)未示出)。
[0080]在這些H)液體暴露系統(tǒng)中，添加IOmM的氯化鋰，抑制GSK-3 β活性，在用觀察到的全部H)液體處理后，正如減弱的LDH釋放反映的，減少了細胞損傷(圖2)。用低pH值葡萄糖基和艾考糊精基的溶液培養(yǎng)后觀察到最顯著的保護(圖2)。
[0081]因此，在這些暴露系統(tǒng)中，使用活-死染色和由中性紅吸附的活細胞的測定進一步研究氯化鋰的保護作用。在用低pH值的葡萄糖基或艾考糊精基的ro液體培養(yǎng)后，用氯化鋰的處理導(dǎo)致保持的細胞結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)未示出)，死細胞減少的速率(數(shù)據(jù)未示出)和活細胞增加的數(shù)量(圖3)。
[0082]圖2說明:用具有不同的滲透劑和毒性特性的不同的市售的ro液處理的間皮細胞中的LDH釋放。對照細胞用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)基處理，PDF處理的細胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的ro液體(腹膜透析液)，艾考糊精基的ro液體(多聚糖透析液)，乳酸緩沖低⑶P、pH值7.4的平衡液，乳酸/碳酸氫鹽緩沖低⑶P、pH值7.4 (生理性雙腔透析液)的ro液體，氨基酸基的(氨基酸透析液)ro液處理。以IOmM的劑量施用氯化鋰。#P〈0.05vs.對照，*P〈0.01vs.非氯化鋰處理。(I小時暴露，16小時恢復(fù))。
[0083]圖3說明:與對照細胞相比，由中性紅吸附百分比評估細胞活性。細胞用TOF(具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的H)液(腹膜透析液))或具有低pH值的艾考糊精基的ro液體(多聚糖透析液)處理。以IOmM的劑量施用氯化鋰。#P〈0.01vs.對照，*Ρ〈0.01vs.非氯化鋰處理。(I小時暴露，16小時恢復(fù))。對照細胞用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)液處理。
[0084]氯化鋰導(dǎo)致更高的HSF-1活性
[0085]熒光素酶分析顯示在對照細胞和用葡萄糖基低pH值、含高GDP的和低pH艾考糊精基的ro液體培養(yǎng)后，氯化鋰處理顯著增加了 HSF-1的轉(zhuǎn)錄活性(圖4)。
[0086] 圖4說明:通過熒光素酶試驗評估熱休克因子-1活性。對照胞用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)液進行處理，PDF處理的細胞用具有高⑶P含量的葡萄糖基、低pH值的H)液體(腹膜透析液)，具有低pH值的艾考糊精基的ro液體(多聚糖透析液)處理。以IOmM的劑量施用氯化鋰。(30分鐘暴露，6小時恢復(fù))，分別地，#P〈0.01vs.對照，*P〈0.01vs.非氯化鋰處理。[0087]氯化鋰處理導(dǎo)致更高的HSP-72的表達
[0088]在用具有高GDP的葡萄糖基、低pH值的H)液體或用給予或不給予氯化鋰的艾考糊精基的H)液體處理培養(yǎng)30分鐘或I小時后的細胞中評估HSP-72。
[0089]與對照細胞相比，在用葡萄糖基低pH值、含高⑶P的液體培養(yǎng)30分鐘后HSP-72的表達略有增加，I小時后，其表達顯著減少(圖5)。與對照相比，在用艾考糊精基的ro液體培養(yǎng)30分鐘后，HSP-72的表達增加，但I小時后，SP-72的表達保持不變(圖5)。當(dāng)與相應(yīng)的未處理過的細胞相比，在每種培養(yǎng)設(shè)置中，用氯化鋰處理顯著增加了 HSP-72的水平。
[0090]圖5說明:通過蛋白質(zhì)印跡法評估熱休克蛋白-72(HSP_72)的表達。對照細胞用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)基進行處理，PDF處理的細胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的H)液體(腹膜透析液)，具有低PH值的艾考糊精基的H)液體(多聚糖透析液)處理。以IOmM的劑量施用氯化鋰。(30分鐘-左圖-或I小時暴露-右圖，16小時恢復(fù))。分別地，*P〈0.05vs.對照，% P<0.0Olvs.對照，&P〈0.05vs.非氯化鋰處理。
[0091 ] 氯化鋰施用的劑量曲線分析
[0092]為了確定在哪個濃度鋰可以有效地改善間皮細胞損傷，在用低pH值葡萄糖基的PDF或艾考糊精基的液體的培養(yǎng)過程中分析劑量曲線。檢驗ImM，2mM, 5mM和IOmM的氯化鋰劑量。
[0093]在低pH值葡萄糖基(PDF)液體中，ImM至5mM的氯化鋰劑量沒有改變LDH釋放到上清液中(圖6)，但正如先前所檢測到的，與對照相比時，IOmM的氯化鋰顯著減少了 LDH的釋放(圖6)。在用艾考糊精 基的液體培養(yǎng)的過程中，呈現(xiàn)劑量依賴型LDH響應(yīng)曲線:lmM的氯化鋰并沒有顯著變化，而2mM的氯化鋰已經(jīng)降低了 LDH水平，并且這種降低在施用5mM和IOmM的氯化鋰時更為顯著(圖6)。
[0094]圖6說明:LDH釋放到上清液中。對照細胞用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)基進行處理，PDF處理的細胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的ro液體(腹膜透析液)，艾考糊精基的ro液體具有低PH值(多聚糖透析液)處理。以lmM，2mM，5mM或IOmM的劑量施用氯化鋰。(30分鐘暴露，6小時恢復(fù))。分別地，#P〈0.0Olvs.對照，*P〈0.05vs.非氯化鋰處理。
[0095]通過熒光素酶測定法評估的HSF-1活性顯示在用低pH值葡萄糖基的或艾考糊精基的PDF培養(yǎng)的細胞中，與相應(yīng)的對照細胞相比，存在HSF-1活性的劑量依賴型上調(diào)(圖7)。
[0096]圖7說明:通過熒光素酶試驗評估熱休克因子(HSF-1)的轉(zhuǎn)化活性。對照細胞用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)液進行處理，PDF處理的細胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值的H)液體(腹膜透析液)，具有低PH值的艾考糊精基的H)液體(多聚糖透析液)處理。以IOmM的劑量施用氯化鋰。(30分鐘暴露-右圖，6小時恢復(fù))。分別地，#P〈0.01vs.對照，*P〈0.01vs.非氯化鋰處理。
[0097]在用葡萄糖基、低pH值的PDF液體培養(yǎng)的細胞中，與未處理的細胞相比，僅在施用2mM或IOmM的氯化鋰后，HSP-72的表達增加(圖8)。另一方面，在用艾考糊精基的H)液體培養(yǎng)后，全部施用氯化鋰的劑量增加了 HSP-72蛋白質(zhì)的表達(圖8)。
[0098]圖8說明:通過蛋白質(zhì)印跡法評估的熱休克蛋白-72(HSP_72)的表達。對照細胞用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)液進行處理，PDF處理的細胞用具有高GDP含量的葡萄糖基、低pH值H)液體(腹膜透析液)，具有低PH值的艾考糊精基的H)液體(多聚糖透析液)處理。以IOmM的劑量施用氯化鋰。(30分鐘暴露-右圖，16小時恢復(fù))。分別地，#P〈0.05vs.對照，*P〈0.05vs.非氯化鋰處理。
[0099]總結(jié):
[0100]在本研究中，氯化鋰(LiCl)降低了 LDH的釋放，減少了細胞死亡速率并改善了細胞活性。用葡萄糖基低pH值的和艾考糊精基的ro液體處理的間皮細胞的作用最為顯著，市售的H)液體對GSK-3 0活性具有最顯著的作用。
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【權(quán)利要求】
1.一種腹膜透析液，其包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特別是抑制(GSK)-3 β活性的化合物，所述的腹膜透析液用于預(yù)防感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥，例如腹膜炎，腹膜損傷、損壞和衰竭，屏障功能障礙和間皮細胞脫落。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腹膜透析液，其特征在于，所述的腹膜透析液選自由碳水化合物基的透析液和氨基酸基的透析液組成的組中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腹膜透析液，其特征在于，所述腹膜透析液的pH值為7.3或更低，優(yōu)選為7.0或更低，最優(yōu)選為6.0或更低。
4.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求所述的腹膜透析液，其特征在于，所述腹膜透析液是艾考糊精基的。
5.基于艾考糊精的腹膜透析液，包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特別是抑制(GSK)-3 β活性的化合物。
6.一種抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特別是抑制(GSK)-3 β活性的化合物，所述的化合物用于預(yù)防由于使用腹膜透析液引起的感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥，例如腹膜炎，腹膜損傷、損壞和衰竭，屏障功能障礙和間皮細胞脫落。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，所述的化合物在腹膜透析治療過程中與腹膜透析液一起施用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的化合物，其特征在于，所述的腹膜透析液選自由碳水化合物基的透析液和氨基酸基的透析液組成的組中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任何一項所述的化合物，其特征在于，所述腹膜透析液的pH值為7.3或更低，優(yōu)選為7.0或更低，最優(yōu)選為6.0或更低。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至9中任何一項所述的化合物，其特征在于，所述腹膜透析液是艾考糊精基的。
11.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求所述的腹膜透析液或化合物，其特征在于，抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性的化合物優(yōu)選選自由以下組成的組中:鋰，tideglusib, NP-103,GSK-3 β抑制劑I (TDZD-8，4-芐基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷_3，5- 二酮)，GSK-3 β抑制劑II(2-硫代(3-碘芐基)-5-(1-吡啶基)_[I，3，4]-惡二唑)，GSK_3 抑制劑 IV (SB-216763，3-(2，4_ 二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯 _2，5_ 二酮)，GSK-3 抑制劑 IX _，(2’2，31)-6-溴靛玉紅-3’-肟)，GSK-3 β 抑制劑 VI (2-氯-1-(4，5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮)，GSK-3 β抑制劑VII (2，4’ -對溴苯酰甲基溴)，GSK-3 β抑制劑VI11 (AR Α014418, N- (4-甲氧基芐基)-N，- (5-硝基-1，3-噻唑 _2_ 基)脲)，GSK-3 抑制劑X (B I O-丙酮肟，(2，Ζ，3’ Ε) -6-溴靛玉紅_3’ -丙酮肟)，GSK-3 β抑制劑XI (3-(1-(3-羥基丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5- 二酮，7AIPM)，GSK_3抑制劑XIII (5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺)，GSK-3 β抑制劑父11(1￥5119，3-[[6-(3-氨基苯基)-7!1-吡咯并[2，3_d]嘧啶_4_基]氧基苯酚雙三氟乙酸鹽)，GSK-3 β抑制劑XVIII (2-(氯-4-(4-噻吩-2-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基)-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酮)，GSK-3i3抑制劑X (BIO-丙酮肟，(2’Z，3’E)-6-溴靛玉紅-3’-丙酮肟)，GSK-3 β抑制劑XI (3-(1-(3-羥基丙基)-1H-吡咯并[2，3_b]吡啶_3_基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5- 二酮，7AIPM)，GSK-3 β 抑制劑 XIX(IM-12, C22H20FN3O2,吲哚基順丁烯二酰亞胺-衍生物)，GSK-3抑制劑XVI (6- (2- (4- (2，4- 二羥二氯苯基)-5- (4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基)乙烷-氨基)-氰基吡啶，CHIR99021)，GSK-3抑制劑 XVII (5-芐氨基-3-氧代-2，3- 二氫-1,2,4-噻二唑，TDZD-20)，GSK-3 抑制劑 XXII，化合物A(6-甲基-N-[3-[[3-(1-甲基乙氧基)丙基]氨基甲酰基]-1H-吡唑_4_基]吡啶-3-甲酰胺)，GSK-3 β抑制劑XXIII，3F8 (5-乙基_7，8-二甲氧基-1H-吡咯并[3，4-C]-異喹啉-1，3- (2Η) - 二酮)，GSK-3 β 肽抑制劑(L803，H-KEAPPAPPQSpP_NH2)，GSK-3 β肽抑制劑(L803-MTS，MYR-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2)，GF-109203X(2-[1-(3-二甲基氨基丙基)吲哚-3-基]-3-(吲哚-3-基)馬來酰亞胺)及其藥物可接受的鹽和它們的混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的腹膜透析液或化合物，其特征在于，所述抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性的化合物是鋰鹽，具體是氯化鋰或碳酸鋰。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的腹膜透析液或化合物，其特征在于，所述透析液中鋰鹽的濃度為ImM至IOmM,優(yōu)選是2mM至5mM。
14.一種用于預(yù)防感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥的方法，所述感染性和非感染性腹膜并發(fā)癥由于使用腹膜透析液進行治療所引起，例如腹膜炎，腹膜損傷、損壞和衰竭，屏障功能障礙和間皮細胞脫落，其中使用于所述治療的所述的腹膜透析液包含抑制糖原合酶激酶(GSK)-3活性，特別是 抑制(GSK)-3 β活性的化合物。
【文檔編號】A61P31/00GK104023722SQ201280060560
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月27日
【發(fā)明者】克里斯蒂娜·西拉維亞·魯紹伊, 克里斯托弗·奧弗里希特 申請人:杰拓保護有限公司