減少息肉病和結(jié)腸直腸癌的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供減少或抑制息肉病或結(jié)腸直腸癌的方法。所述方法包括將經(jīng)修飾以減少細(xì)胞表面上脂磷壁酸的展示的細(xì)菌施用于哺乳動(dòng)物。所述重組細(xì)菌的施用促進(jìn)了所需的治療響應(yīng)。所述重組細(xì)菌可以單劑量或一系列劑量施用。方法可用于治療或預(yù)防多種息肉相關(guān)疾病，例如治療或林奇綜合征、家族性腺瘤性息肉病和結(jié)腸直腸癌。
pta-11587
2011.01.10
【專(zhuān)利說(shuō)明】減少息肉病和結(jié)腸直腸癌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及減少或抑制息肉病和結(jié)腸直腸癌的方法和組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 鑒別腸道中能提高保護(hù)性與致病性炎癥之比的細(xì)菌組分和最終產(chǎn)物，對(duì)于 使胃腸（GI)慢性炎性疾病和惡性腫瘤中的穩(wěn)態(tài)再平衡是重要的。共生的乳桿菌屬 (Lactobacillus)物種是人類(lèi)胃腸道中的天然微生物群棲居者，并且可通過(guò)其表面層蛋白 質(zhì)的相互作用刺激先天細(xì)胞以同時(shí)產(chǎn)生炎性和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子。脂磷壁酸是乳酸桿菌和其 他乳酸菌的主要細(xì)胞壁組分，并且據(jù)報(bào)道通過(guò)特異性模式識(shí)別受體（包括TLR2)刺激樹(shù)突 狀細(xì)胞（DC)，導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放。通過(guò)缺失嗜酸乳桿菌（L.acid 〇philuS)NCFM的磷酸甘油 轉(zhuǎn)移酶基因來(lái)中斷LTA合成，導(dǎo)致了作用于腸免疫細(xì)胞的細(xì)菌菌株（NCK2025)增加 IL-10 的產(chǎn)量，下調(diào)IL-12水平，并且顯著減輕小鼠中硫酸葡聚糖鈉（DSS)誘導(dǎo)的以及⑶4+⑶45RB *T 細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎（PCT 申請(qǐng) NO.PCT/US2011/040674 和 Mohamadzadeh，et al.PNAS(20 11) 108Supplementl : 4623-4630 (Mohamadzadeh 等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，2011 年，第 108卷，增刊1，第4623-4630頁(yè)））。根據(jù)這些觀察，LTA-缺陷的嗜酸乳桿菌顯示出通過(guò)減 輕炎癥來(lái)改變細(xì)菌-宿主相互作用。
[0003] 結(jié)腸直腸癌在世界范圍內(nèi)是第三常見(jiàn)的癌癥和第四常見(jiàn)的癌癥死亡原因 （Weitz et al·，2005, Lancet365 : 153-65 (Weitz 等人，2005 年，《柳葉刀》，第 365 卷，第 153-165 頁(yè)））。所有結(jié)腸直腸癌中大約5-10%遺傳了家族性腺瘤性息肉?。‵AP)的一種主要形式， 該疾病是其中約80%的受影響個(gè)體包含結(jié)腸腺瘤性息肉?。ˋPC)基因中的種系突變的常 染色體顯性疾病。另外，炎癥已顯示出在患有息肉病的小鼠中和在人類(lèi)結(jié)腸癌中具有腫瘤 促進(jìn)作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs)是炎癥的強(qiáng)效抑制劑，并且有證據(jù)顯示其在息肉病和結(jié)腸 癌中具有保護(hù)作用。然而，Tregs與促炎性細(xì)胞及其細(xì)胞因子的長(zhǎng)期相互作用可逆轉(zhuǎn)Tregs 的抗炎特性并賦予其促炎性。對(duì)于淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞之間的相互作用調(diào)節(jié)促腫瘤與抗腫 瘤免疫性之比已形成共識(shí)。然而，腸道菌群組分對(duì)息肉病和相關(guān)結(jié)腸直腸癌的相互作用尚 未闡明。
[0004] 本領(lǐng)域需要另外的方法和組合物來(lái)改善息肉病的治療并且減低結(jié)腸直腸癌的發(fā) 生率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供減少或抑制息肉病或結(jié)腸直腸癌的方法。所述方法包括將經(jīng)修飾以減 少細(xì)胞表面上脂磷壁酸的展示的細(xì)菌施用于哺乳動(dòng)物。修飾細(xì)菌的施用促進(jìn)了所需的治療 響應(yīng)。修飾細(xì)菌可以單劑量或一系列劑量施用。方法可用于治療或預(yù)防多種息肉相關(guān)疾病， 例如治療或預(yù)防林奇綜合征、家族性腺瘤性息肉病和結(jié)腸直腸癌。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0006] 圖1報(bào)道了用PBS、NCK56或NCK2025處理的充滿(mǎn)息肉的小鼠中息肉的狀態(tài)。PBS， η = 6。NCK56和NCK2025, η = 5。（a)對(duì)回腸和結(jié)腸中的息肉進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果使用盒須圖 表示。（b)用PBS(上）或NCK2025(下）處理的小鼠的代表性結(jié)腸的照片。（c)用PBS、 NCK56或NCK2025處理的小鼠息肉中Ki-67+和TUNEL+細(xì)胞的定量。（d)Ki-67 (上圖）和 TUNEL(下圖）的結(jié)腸息肉的染色；用PBS、NCK56或NCK2025處理的小鼠的石蠟包埋組織的 6 μ m 切片。柱條表不 50 μ m。（***p < 0· 0001 ;**p < 0· 004 ;*p < 0· 0176)
[0007] 圖2示出了嗜酸乳桿菌菌株減少TS4CreXcAPClox468中息肉內(nèi)炎癥。（a)CAE+ 肥大細(xì)胞，η = 4小鼠；(b)Grl+嗜中性粒細(xì)胞和粒細(xì)胞（ganulocyte), η = 5或更多；（c) F4/80+巨噬細(xì)胞，η = 5或更多；（d)息肉內(nèi)CAE+細(xì)胞的頻率，< 0. 0001 ;(e)息肉內(nèi) Grl+細(xì)胞的頻率，< 0. 0005 ; (f)息肉內(nèi)F4/80+細(xì)胞的頻率，#p < 0. 006。黑色尺 寸條表示50 μ m，黑色箭頭表示肥大細(xì)胞，白色箭頭表示F480+或Grl+細(xì)胞，對(duì)于對(duì)照組和 NCK2025組，η = 3 ;對(duì)于Nck56組，η = 5。示出SEM(均值標(biāo)準(zhǔn)誤差）誤差條。
[0008] 圖3表示對(duì)表達(dá)免疫抑制性和促炎性細(xì)胞因子的DC(樹(shù)突狀細(xì)胞）在息肉和 正常鄰近組織中的浸潤(rùn)的定量。（a)CDllc+IL-10+，< 0.0001，#ρ < 0.001 ;(b) Q)llc+IL-12+,**p < 0· 006, (**)p < 0· 004 ; (c)Q)llc+TNFa +,***p < 〇· 〇〇〇5,*p < 0· 01 ; (d)CDllc+CD103+*#p < 0.0009, *p < 0.05。與息肉外相比息肉內(nèi) CD103+DC 顯著增加， **p < 0. 0014。白色尺寸條表示50 μ m，白色箭頭表示雙陽(yáng)性細(xì)胞。
[0009] 圖4示出了息肉浸潤(rùn)性Tregs和輔助⑶4T-細(xì)胞的質(zhì)量的變化。圖示息肉浸潤(rùn) 性（a)涵蓋抗炎性和促炎性亞型二者的⑶4+Foxp3+Tregs，（b)涵蓋抗炎性和促炎性Tregs 以及促炎性T-細(xì)胞的ROR γ t和/或Foxp3的細(xì)胞表達(dá)，（c)⑶4+IFN γ +促炎性T-細(xì)胞； 小鼠未處理或用PBS、NCK56或NCK2025處理，如圖所示。對(duì)息肉和正常鄰近組織中以下 四者的定量：（d)涵蓋抗炎性和促炎性亞型二者的CD4+F 〇Xp3+TregS，*p < *0· 004,（e) ROR Y t-Foxp3+ 抗炎性 Treg，林p < 0· 0〇2n = 5，*p < 0· (Mn = 5，（f) ROR γ t+Foxp3+ 促 炎性 Tregs，#p < 0· 008η = 3PBS&5NCK2025，（g) ROR γ t+Foxp3-促炎性 T-細(xì)胞，趨勢(shì)無(wú) 統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性，（h)⑶4+IFN γ +促炎性效應(yīng)T-細(xì)胞，*ρ < 0. 016η = 5。尺寸條表示 50 μ m，白色箭頭表示F4/80+或Grl+細(xì)胞。
[0010]圖5示出了嗜酸乳桿菌菌株減少充滿(mǎn)息肉的小鼠中的全身性炎癥。（a)未處理或 用嗜酸乳桿菌菌株處理的充滿(mǎn)息肉的小鼠中的脾臟重量；*P < 〇. 026。（b)未處理和處理的 充滿(mǎn)息肉的小鼠的脾臟和MLN中⑶4+Foxp3-效應(yīng)T-細(xì)胞和⑶4+F〇xp3+Treg-細(xì)胞的頻率； 脾臟 CD4+*p < 0· 065，脾臟 Tregs p < 0· 026，PBS η = 3，NCK56n = 5，NCK2025n = 3。（c) 未處理或處理的小鼠的脾臟來(lái)源的MNC中⑶llb+F4/80+巨噬細(xì)胞、⑶llb+Grl+嗜中性粒細(xì) 胞/粒細(xì)胞和⑶Ilb+⑶Ilc+樹(shù)突狀細(xì)胞的頻率；脾臟⑶llb+F4/80+細(xì)胞***p < 0. 0001， 脾臟 CDllb+Grl+ 細(xì)胞 ***p < 0· 0004, PBS η = 3, NCK56n = 5, NCK2025n = 3。（c)腸系 膜淋巴結(jié)（MLN)來(lái)源的MNC中的相同頻率。柱狀圖示出了經(jīng)編輯的結(jié)果，帶有SEM ;顯示的 趨勢(shì)無(wú)統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性。黑色柱條是未處理的，灰色是NCK56,白色柱條是NCK2025處 理的小鼠。
[0011] 圖6示出了用嗜酸乳桿菌菌株處理充滿(mǎn)息肉的小鼠對(duì)于小鼠中血清細(xì)胞因子水 平的影響。數(shù)據(jù)以 NCK2025/NCK56/PBS 的順序列出。IL-6 : 23. 16+3. 03/45. 60+2. 21/82. 72+32. 06，與 PBS 相比 NCK2025 的 p = 0· 039，與 NCK56 相比 NCK20225 的 p = 0· 009 ; IFN- g : 5· 11 ±2. 13/2. 79+1. 39/9. 08+3. 17 ;TNF-a : 1〇· 33+2. 66/16. 79+4. 02/16. 19+1. 77 ;I L-IO : 18. 95+95/16. 07+4. 89/39. 14+4. 31，與 PBS 相比 NCK2025 的 p = 0· 002,與 PBS 相比 NCK56 的 p = 0· 03 ;VEGF : 3. 19+1. 13/18. 11±9· 98/12. 46+7. 42,與 NCK56 相比 NCK2025 的 p = 0· 008 ;G-CSF : 573. 3 ±109. 1/9361+638. 8/7689+1436,與 PBS 和 NCK56 相比 NCK2025 的 p < 0· 0001 ;IL-12p70 : 34. 15+15. 46/69. 76+8. 60/24. 64+3. 50,與 PBS 相比 NCK56 的 p = 0· 001 ;IL-22 : 59. 57+5. 65/31. 85+4. 18/19. 89+12. 60,與 PBS 相比 NCK2025 的 p = 0. 005 ;p值在達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)給出。NCK2025, η = 5小鼠；NCK56, η = 2小鼠；PBS，η = 3小鼠；每個(gè)均重復(fù)進(jìn)行測(cè)試。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下文將參照附圖更完整地描述本發(fā)明，附圖中示出了一些但并非全部本發(fā)明的實(shí) 施例。實(shí)際上，這些發(fā)明可以多種不同的形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)理解為限制于本文示出的實(shí)施 例；相反，提供這些實(shí)施例使得本公開(kāi)滿(mǎn)足適用法律要求。在全文中同樣的編號(hào)表示同樣的 元件。
[0013] 這些發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員得益于具有上述說(shuō)明和相關(guān)附圖呈現(xiàn)的教導(dǎo)內(nèi)容， 將會(huì)想到本文示出的這些發(fā)明的多個(gè)修改和其他實(shí)施例。因此，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所 公開(kāi)的具體實(shí)施例，并且還旨在將修改和其他實(shí)施例包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然 本文使用了具體術(shù)語(yǔ)，但它們僅以通用和描述意義使用，并且不出于限制目的。
[0014] 概述
[0015] 提供了減少受試者中息肉病的方法，包括治療或預(yù)防結(jié)腸直腸癌的方法。此類(lèi)方 法可用于使用經(jīng)修飾以減少細(xì)菌細(xì)胞表面上LTA的展示的細(xì)菌來(lái)減低胃腸道中的炎癥。腸 道炎癥是息肉病的促進(jìn)因素，所述息肉病隨后可發(fā)展為結(jié)腸直腸癌。因此，本文提供的方法 利用修飾的細(xì)菌菌株歸一化（normalize)先天和適應(yīng)性免疫響應(yīng)，以預(yù)防和治療息肉病和 結(jié)腸直腸癌。
[0016] 治療或ΜΦ息肉病發(fā)牛率的方法
[0017] 提供了治療或減少哺乳動(dòng)物中息肉病發(fā)生率的方法，該方法包括施用經(jīng)修飾以減 少細(xì)菌表面上LTA的展示的細(xì)菌。在一些實(shí)施例中，LTA的展示減少的細(xì)菌菌株可改善確 立的息肉病的癥狀，并且預(yù)防結(jié)腸直腸癌的發(fā)病。在一些實(shí)施例中，提供了減少息肉內(nèi)的有 絲分裂活性、減少息肉內(nèi)肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)以及減少骨髓細(xì)胞的息肉內(nèi)密度的方法。
[0018] "治療"或"減低"或"減少"在本文中定義為治愈、痊愈、緩減、減輕、改變、醫(yī)治、改 善、完善或影響患有息肉病或結(jié)腸直腸癌的哺乳動(dòng)物的病癥或癥狀。因此息肉病的減少可 包括例如息肉病的至少一個(gè)癥狀或指標(biāo)減少至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70%、80%、90%或100%。息肉病的癥狀或指標(biāo)包括但不限于：息肉內(nèi)有絲分裂活性、骨髓 細(xì)胞密度（例如Grl+粒細(xì)胞）、息肉內(nèi)肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)（例如F4/80+巨 噬細(xì)胞）、息肉內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)炎癥（例如促炎性細(xì) 胞）、脾臟尺寸、脾臟巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾臟粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、促炎性Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)、結(jié)腸或腸道炎 癥以及腸道、結(jié)腸或直腸中息肉的數(shù)量。息肉病的癥狀和指標(biāo)的測(cè)定方法是本領(lǐng)域已知的， 并且在本文別處有描述。待治療的哺乳動(dòng)物可患有息肉病或結(jié)腸直腸癌或存在患有息肉病 或結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，包括例如患有林奇綜合征（遺傳性非息肉病）、家族性腺瘤性息肉病 (FAP)、MUTYH-相關(guān)息肉病、肥大細(xì)胞增多癥、脾腫大、糖尿病或自體免疫疾?。ㄈ绺稍锞C合 癥）或存在患有這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0019] LTA-缺陷細(xì)菌的施用可出于預(yù)防或治療目的。所謂"預(yù)防"或"抑制"是指預(yù)防性 提供重組細(xì)菌，即在任何癥狀之前提供細(xì)菌。細(xì)菌的預(yù)防施用起到預(yù)防或減輕息肉病或結(jié) 腸直腸癌的任何后續(xù)癥狀的作用。在一些實(shí)施例中，預(yù)防或抑制息肉病包括其中在LTA-缺 陷細(xì)菌的首次施用后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或 大于30天不形成息肉的病癥。在一些實(shí)施例中，預(yù)防或抑制息肉病包括其中在LTA-缺陷 細(xì)菌的最終施用后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或大 于30天不形成息肉的病癥。當(dāng)被提供以減少息肉病時(shí)，細(xì)菌在癥狀的發(fā)作或息肉的形成時(shí) (或不久之后）提供。細(xì)菌的施用因此可起到減輕包括息肉的生長(zhǎng)或分裂在內(nèi)的任何實(shí)際 癥狀的作用。
[0020] 所謂"受試者"是指哺乳動(dòng)物。在具體實(shí)施例中，受試哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類(lèi)或人。在 其他實(shí)施例中，受試者包括馴養(yǎng)哺乳動(dòng)物，例如貓科動(dòng)物或犬科動(dòng)物，或耕作動(dòng)物，例如反 芻動(dòng)物、馬、豬、家禽或綿羊。在具體實(shí)施例中，經(jīng)歷本文所述的細(xì)菌菌株治療或預(yù)防的受試 者是人。在一些實(shí)施例中，經(jīng)歷治療的人可以是新生兒、嬰兒、學(xué)步的幼兒、青春期前的兒 童、青少年或成人。本發(fā)明的受試者可遭受息肉病或結(jié)腸直腸癌的癥狀或可存在發(fā)展息肉 病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0021] 息肉病
[0022] 本文公開(kāi)的方法涉及息肉病的治療和預(yù)防。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"息肉病"是指以存 在至少一種息肉為特征的病癥。在一些實(shí)施例中，息肉病具有基因或遺傳因素，例如林奇綜 合征（遺傳性非息肉病，HNPCC)、家族性腺瘤性息肉?。‵AP)和MUTYH-相關(guān)息肉?。∕AP)。 在一些實(shí)施例中，息肉病是指結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸癌。
[0023] 術(shù)語(yǔ)"息肉"或"瘤形成"是指從粘膜突起的組織的異常生長(zhǎng)。本文所述的息肉可 以是增生性息肉、腺瘤性息肉（腺瘤）、炎性息肉或任何其他類(lèi)型的息肉。如本文所用，贅生 性息肉可以是腺瘤性息肉或惡性息肉。就結(jié)腸直腸腺瘤（腺瘤性息肉）而言，異常生長(zhǎng)局 限于粘膜。如果該非典型生長(zhǎng)延伸穿過(guò)粘膜肌層、粘膜下的肌肉層，并且損壞解剖壁，則異 常生長(zhǎng)稱(chēng)為結(jié)腸直腸癌或惡性息肉。
[0024] 如本文所用，"結(jié)腸直腸癌"或"結(jié)腸癌"是指以具有至少一種結(jié)腸直腸癌為特征的 病癥。結(jié)腸直腸癌可包括所有形式的胃腸道或結(jié)腸的癌癥。結(jié)腸直腸癌可包括偶發(fā)性和遺 傳性結(jié)腸直腸癌。結(jié)腸直腸癌可包括惡性結(jié)腸腫瘤、原位惡性腫瘤、典型類(lèi)癌瘤和非典型類(lèi) 癌瘤。結(jié)腸直腸癌還可包括腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌和腺鱗狀細(xì)胞癌。結(jié)腸直腸癌可與選自 遺傳性非息肉病性結(jié)腸直腸癌、家族性腺瘤性息肉病、加特納綜合征、黑斑息肉綜合征、特 科特綜合征和幼年性息肉病的遺傳性綜合征相關(guān)。如本文所述，結(jié)腸癌可由選自遺傳性非 息肉病性結(jié)腸直腸癌、家族性腺瘤性息肉病、加特納綜合征、黑斑息肉綜合征、特科特綜合 征和幼年性息肉病的遺傳性綜合征引起。
[0025] 在一些實(shí)施例中，息肉可見(jiàn)于胃腸道或直腸中。如本文所用，"胃腸道"包括胃竇、 十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸。
[0026] 在一些實(shí)施例中，本文所述的細(xì)菌施用給存在發(fā)展息肉病或結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)因 素的哺乳動(dòng)物。如本文所用，發(fā)展息肉病或結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)因素包括遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素或生 活方式風(fēng)險(xiǎn)因素。遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素包括但不限于：具有腫瘤抑制基因如結(jié)腸腺瘤性息肉病 (APC)基因的突變，或具有錯(cuò)配修復(fù)（MMR)基因如SCH2、MLH1、MSH6和PMS2基因的突變。生 活方式風(fēng)險(xiǎn)因素包括但不限于：升高的身體質(zhì)量指數(shù)（BMI)、肥胖、低體力活動(dòng)、紅肉和加 工肉制品、細(xì)糧、甜食和醇的高消耗量以及水果和蔬菜的低消耗量。
[0027] 在一些實(shí)施例中，息肉病的減少以息肉內(nèi)有絲分裂活性的減少為特征。如本文所 用，"息肉內(nèi)有絲分裂活性"是指息肉中細(xì)胞的分裂或增殖。例如，息肉內(nèi)有絲分裂活性可通 過(guò)定量Ki-67 +或TUNEL+細(xì)胞的群體或密度來(lái)測(cè)量。測(cè)量Ki-67+或TUNEL+細(xì)胞的方法是本 領(lǐng)域已知的，并且在本文別處有描述。
[0028] 在一些實(shí)施例中，息肉病的減少以息肉內(nèi)炎癥的減少為特征。如本文所用，"息肉 內(nèi)炎癥"是指至少一種息肉內(nèi)的組織的炎癥。息肉內(nèi)炎癥的減少可在LTA-缺陷細(xì)菌施用后 通過(guò)鑒別抗炎性細(xì)胞因子水平的增加，或促炎性細(xì)胞因子水平的減少或它們的任何組合來(lái) 測(cè)量。在一些實(shí)施例中，息肉內(nèi)炎癥的減少在LTA-缺陷細(xì)菌施用后通過(guò)測(cè)量增加的抗炎性 Tregs與促炎性Tregs的比率來(lái)鑒別。
[0029] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"促炎性細(xì)胞因子"是指有利于炎癥的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。本發(fā) 明的促炎性細(xì)胞因子包括 ILl-a、ILl-β、TNF-a、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、 IL-17、IL-18、TNF-a、LT、LIF、制瘤素或 IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
[0030] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"抗炎性細(xì)胞因子"是指在具有該細(xì)胞因子的受體的細(xì)胞中引 起抗炎性響應(yīng)的天然存在的或重組的蛋白、其類(lèi)似物或其片段。本發(fā)明的抗炎性細(xì)胞因子 可以是控制促炎性細(xì)胞因子響應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)分子。本發(fā)明的抗炎性細(xì)胞因子包括白介素 (IL)-I 受體拮抗劑、IL-4、IL-10、IL-Il 和 IL-13、IL-16、IFN-a、TGF-β、G-CSF。
[0031] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"抗炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞"或"抗炎性Tregs "或"天然調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞"或"nTregs"或"良性Tregs"是指表達(dá)抗炎性細(xì)胞因子，例如⑶4+F 〇Xp3+TregS的調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞。抗炎性Tregs可通過(guò)ROR γ t的表達(dá)和Foxp3的缺失而喪失其抗炎特性，導(dǎo)致轉(zhuǎn) 化為T(mén)H17細(xì)胞?；蛘?，它們可共表達(dá)Foxp3和ROR γ t，保持T-細(xì)胞抑制特性，但獲得促炎 性功能。在兩種情況下，Tregs抗炎特性的喪失可促使病原性炎癥的逐步升級(jí)和息肉病的 進(jìn)展?？寡仔哉{(diào)節(jié)性T細(xì)胞可產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子，例如IL-10。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"促炎 性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞"是指表達(dá)促炎性細(xì)胞因子如F 〇Xp3+R0R γ t+Tregs的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0032] 治療有效量
[0033] 所謂"治療有效劑量"、"治療有效量"或"有效量"是指當(dāng)施用給受試者時(shí)減少息 肉病或預(yù)防息肉病的發(fā)展、增加或進(jìn)展的LTA-缺陷細(xì)菌的量。"積極治療響應(yīng)"是指例如改 善息肉病或結(jié)腸直腸癌的至少一種癥狀或指標(biāo)的狀況。
[0034] 治療劑的有效量根據(jù)預(yù)期目標(biāo)確定。術(shù)語(yǔ)"單位劑量"是指適用于受試者的物理上 分立的單位，每個(gè)單位包含預(yù)定量的治療組合物，該量經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生與其施用即適當(dāng)?shù)耐?徑和治療方案相關(guān)的所需響應(yīng)。根據(jù)治療次數(shù)和單位劑量二者的施用量取決于待治療的受 試者、受試者的狀態(tài)和所需的保護(hù)。精確量的治療組合物還取決于專(zhuān)業(yè)人員的判斷，并且僅 限于每個(gè)個(gè)體。一般來(lái)講，LTA-缺陷細(xì)菌的劑量將根據(jù)例如患者的年齡、體重、身高、性別、 一般醫(yī)療狀況和既往病史的因素而變化。在特定實(shí)施例中，期望在大約IO 4至約l〇12CFU、IO5 至10nCFU、IO6至101° CFU、IO8至IOltlCFU或IO8至IO12CFU/劑量的范圍內(nèi)施用細(xì)菌。
[0035] 在一些實(shí)施例中，該方法包括施用多劑量細(xì)菌。該方法可包括施用1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多治療有效劑量的包含本文所述的細(xì)菌的組合物。在一 些實(shí)施例中，劑量在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或多于30 天的過(guò)程中施用。在一些實(shí)施例中，該方法包括連續(xù)施用細(xì)菌。例如，多劑量組合物的施用 頻率和持續(xù)時(shí)間是使得減低或預(yù)防炎性響應(yīng)從而治療或預(yù)防腸胃疾病的施用頻率和持續(xù) 時(shí)間。此外，用治療有效量的本發(fā)明重組細(xì)菌治療受試者可包括單次治療或可包括一系列 治療。還應(yīng)當(dāng)理解用于治療的有效劑量的細(xì)菌可在具體治療過(guò)程中增加或減少。劑量的變 化可得自本領(lǐng)域已知和本文所述的檢測(cè)息肉病的診斷測(cè)定法的結(jié)果并且從該結(jié)果顯而易 見(jiàn)。
[0036] 藥物纟目合物
[0037] 在一些實(shí)施例中，將LTA的展示減少的細(xì)菌菌株以保健食品組合物 (nutraceutical composition)例如營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和/或食品添加劑的形式施用給受試者。 在具體實(shí)施例中，藥物或保健食品組合物包含經(jīng)修飾以減少編碼磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的多核苷 酸或多肽的表達(dá)的LTA-缺陷細(xì)菌。在其他實(shí)施例中，將提取物以藥物組合物的形式施用給 受試者。施用可包括單劑量或多劑量施用，如本文別處所述。
[0038] 藥物組合物可以是液體制劑或固體制劑。當(dāng)藥物組合物是固體制劑時(shí)，其可配制 為片劑、吮吸片劑、咀嚼片劑、咀嚼膠、膠囊劑、小藥囊、粉末、顆粒劑、包衣顆粒、包衣片劑、 腸溶包衣片劑、腸溶包衣膠囊劑、熔化條或膜劑。當(dāng)藥物組合物是液體制劑時(shí)，其可配制為 口服溶液劑、混懸劑、乳劑或糖漿劑。藥物組合物可以鼻腔、口腔、陰道或肛門(mén)途徑施用。對(duì) 于肛門(mén)遞送，可使用栓劑。栓劑可包含粘結(jié)劑和載體，例如聚亞烷基二醇或甘油三酯。該組 合物還可以局部制劑或靜脈注射形式遞送。所述組合物還可包含獨(dú)立地選自但不限于乳酸 發(fā)酵食品、發(fā)酵乳制品、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)的載體材 料。
[0039] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"藥物組合物"可配制為食物組合物、膳食補(bǔ)充劑、功能性食品、 醫(yī)療食品或營(yíng)養(yǎng)品，只要實(shí)現(xiàn)所需效果，即治療或預(yù)防息肉病或結(jié)腸直腸癌。所述食物組合 物可選自：飲料、酸奶、汁、冰淇淋、面包、餅干、薄脆餅干、谷物、健康條狀食品、涂抹料和營(yíng) 養(yǎng)品。食物組合物還可包含載體材料，其中所述載體材料選自乳酸發(fā)酵食品、發(fā)酵乳制品、 非發(fā)酵乳制品（如，牛奶）、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的、根據(jù)本發(fā)明使用的或根據(jù)本發(fā)明制備的藥物組合物也可包含其他 物質(zhì)，例如熟知的惰性載體或可藥用佐劑、載體、防腐劑等。
[0041] 本公開(kāi)還包括重組細(xì)菌彼此和/或與一種或多種可用于治療息肉病或結(jié)腸直腸 癌的其他藥劑的組合。例如，本發(fā)明的細(xì)菌可與有效劑量的治療息肉病或結(jié)腸直腸癌的 常規(guī)抗炎性劑組合施用，所述常規(guī)抗炎性劑例如化學(xué)治療劑FOLFOX(甲酰四氫葉酸[亞葉 酸]、5-FU和奧沙利鉬）、F0LF0X(甲酰四氫葉酸[亞葉酸]、5-FU和奧沙利鉬）XapeOX (卡 培他濱和奧沙利鉬）、貝伐單抗、西妥昔單抗、5-FU和甲酰四氫葉酸、F0LF0XIRI (甲酰四氫 葉酸、5-FU、奧沙利鉬和伊立替康）、含或不含西妥昔單抗的伊立替康、西妥昔單抗或帕尼單 抗。術(shù)語(yǔ)"組合施用"是指活性劑的同時(shí)和按順序施用。當(dāng)然組合治療不限于本文提供的 試劑，而是包括任何治療息肉病或結(jié)腸直腸癌的組合物。
[0042] LTA的展示ΜΦ的修飾細(xì)菌細(xì)朐
[0043] 本文提供的治療、減少或預(yù)防息肉病的各種方法利用細(xì)胞表面上LTA展示減少 的修飾細(xì)菌細(xì)胞。如本文所用，當(dāng)與適當(dāng)?shù)膶?duì)照比較時(shí)，細(xì)胞表面上或細(xì)胞表面的LTA展 示減少包括細(xì)胞表面上展示的LTA水平的任何統(tǒng)計(jì)意義上的顯著減少。此類(lèi)減少可包括 例如細(xì)胞表面上展示的LTA的量減少至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80%、90%或100%。測(cè)定細(xì)胞表面上LTA的量的方法包括例如丁醇和疏水相互作用色譜法 (Morath S，Geyer A，&Hartung T (2001)J Exp Medl93(3) :393-397(Morath S、Geyer A 和 Hartung T，2001年，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，第193卷，第3期，第393-397頁(yè)））或酶聯(lián)免疫吸附 測(cè)定（ELISA)(Tadler et al. (2005) J Clin Lab Anal. 1989 ;3(1) :21 (Tadler 等人，2005 年，《（臨床實(shí)驗(yàn)室分析雜志》，1989年，第3卷，第1期，第21頁(yè)））。如本文所用，"LTA的 展示減少"涵蓋細(xì)胞表面上LTA的展示的改變。細(xì)胞表面上LTA的展示的改變意指涵蓋任 何與野生型細(xì)菌表面上的LTA結(jié)構(gòu)不同的LTA結(jié)構(gòu)。因此，如本文所用，"LTA-缺陷"細(xì)菌 是指細(xì)胞表面上LTA的展示改變或減少的細(xì)菌。在一些實(shí)施例中，本文所述方法中使用的 LTA-缺陷細(xì)菌是在 PCT 申請(qǐng) No. PCT/US2011/040674 和 Mohamadzadeh，et al. PNAS (2011) 108Supplementl : 4623-4630 (Mohamadzadeh 等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，2011 年，第 108 卷，增刊1，第4623-4630頁(yè)）中詳細(xì)描述的嗜酸乳桿菌NCK2025,這些文獻(xiàn)全文以引用方式 并入本文。
[0044] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表面"、"細(xì)胞表面"或"細(xì)菌表面"是指細(xì)胞質(zhì)膜外部和包括細(xì) 胞質(zhì)膜的細(xì)菌細(xì)胞區(qū)域。革蘭氏陽(yáng)性菌包含細(xì)胞質(zhì)膜外部的肽聚糖層以及其中散布的磷壁 酸。革蘭氏陰性菌還包含覆蓋肽聚糖層的外膜。因此，根據(jù)本發(fā)明的表面上LTA的展示可 以在革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞質(zhì)膜或肽聚糖層之中或之上，或在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞質(zhì)膜、肽 聚糖層或外膜之中或之上。
[0045] 用于本文公開(kāi)的方法的細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)基因修飾以減少細(xì)胞表面上LTA的展示。如本 文所用，術(shù)語(yǔ)"重組細(xì)菌"或"重組細(xì)菌細(xì)胞"是指其中至少一個(gè)基因變更已作用于所關(guān)注 基因的細(xì)菌或多個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，或經(jīng)如此變更而包含該基因變更的細(xì)胞的子代細(xì)胞。因此，如 本文所用，術(shù)語(yǔ)"經(jīng)基因修飾的"或"基因修飾"是指已作用于所關(guān)注的基因或核酸序列的 基因變更，例如缺失、添加或置換。在一些實(shí)施例中，基因變更是通過(guò)突變或重組技術(shù)手工 產(chǎn)生的變更。在一些實(shí)施例中，手工使用的突變技術(shù)是基于選擇的誘變技術(shù)，其中所選擇的 細(xì)菌具有基因修飾以及減少或改變的LTA展示。
[0046] 在一些實(shí)施例中，基因變更包括將異源多核苷酸引入細(xì)菌細(xì)胞的基因組中。如本 文所用，針對(duì)序列所謂的"異源"為來(lái)源于外來(lái)物種的序列，或者，如果來(lái)源于相同物種的 話，則通過(guò)有意的人為干預(yù)對(duì)其天然形式的組成和/或基因座進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性修飾。例如，有 效連接至異源多核苷酸的啟動(dòng)子來(lái)自于與得到該多核苷酸的物種不同的物種，或者如果來(lái) 自于相同/相似物種的話，則對(duì)一者或二者從其初始形式和/或基因座進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性的修 飾，或啟動(dòng)子不是該被有效連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。
[0047] 任何所關(guān)注的細(xì)菌均可用于本文所述的方法。在具體實(shí)施例中，細(xì)菌包括益生 菌。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"益生菌"是指當(dāng)適量施用時(shí)賦予宿主健康有益效果的活微生物 (FA02001 :參見(jiàn)網(wǎng)站 isapp. net/docs/ProbioticDefinition. pdf)或至少一種有助于受試 者腸道的健康和平衡的生物體。在具體實(shí)施例中，也稱(chēng)為"友好"、"有益"或"優(yōu)良"細(xì)菌，當(dāng) 由受試者攝入時(shí)，有助于維持腸道健康，并且有助于部分或完全減輕疾病的一種或多種癥 狀。如本文所用，"益生菌特性"包括增強(qiáng)腸道功能和穩(wěn)定性；改善對(duì)感染性和非感染性疾 病的保護(hù)；免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)；減輕乳糖不耐癥；改善消化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收；減低血膽固醇；減 低過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)；以及減低尿道感染風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施例中，益生特性包括接受益生菌的受試者 中產(chǎn)生的抗炎性細(xì)胞因子增加，接受益生菌的受試者中產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子減少或接受 益生菌的受試者中產(chǎn)生的抗炎性與促炎性細(xì)胞因子的比率增加。
[0048] 在一些實(shí)施例中，本文所述的細(xì)菌經(jīng)修飾或選擇以增強(qiáng)一種或多于一種益生特 性。例如，在一些實(shí)施例中，用于本方法的細(xì)菌經(jīng)修飾以增加對(duì)胃腸上皮的粘附，并且還經(jīng) 修飾以減少細(xì)胞表面上LTA的展示。在其他實(shí)施例中，用于本方法的細(xì)菌經(jīng)修飾以增加對(duì) 酸或膽汁的耐受性，或增加膽汁鹽水解酶活性，并且還經(jīng)修飾以減少細(xì)胞表面上LTA的展 示。在其他實(shí)施例中，用于本方法的細(xì)菌經(jīng)修飾以從膳食組分生成微生物代謝物，例如雌馬 酚（equol)或其他有益糖苷元,并且還經(jīng)修飾以減少細(xì)胞表面上LTA的展示。在一些實(shí)施例 中，用于本方法的細(xì)菌經(jīng)修飾以減低DNA損傷，或增加針對(duì)化學(xué)致癌物的抗基因毒性特性， 并且還經(jīng)修飾或選擇以減少細(xì)胞表面上LTA的展示。在一些實(shí)施例中，用于本方法的細(xì)菌 經(jīng)修飾或選擇以增加谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物 酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、草酸利用率或丁酸產(chǎn)量。
[0049] 在某些實(shí)施例中，細(xì)菌是乳酸細(xì)菌。如本文所用，"乳酸細(xì)菌"是指選自如下屬的 細(xì)菌：氣球菌屬（Aerococcus)、肉桿菌屬（Carnobacterium)、腸球菌屬（Enterococcus)、 乳球菌屬（Lactococcus)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、明串珠菌屬（Leuconostoc)、酒球 菌屬（Oenococcus)、片球菌屬（Pediococcus)、鏈球菌屬（Streptococcus)、蜜蜂球菌屬 (Melissococcus)、差異球菌屬（Alloiococcus)、狡詐球菌屬（Dolosigranulum)、乳球形菌 屬（Lactosphaera)、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus)、漫游球菌屬（Vagococcus)和魏斯氏 菌屬（Weissella) (Holzapfel et al. (2001)Am.J. Clin. Nutr. 73 : 365S_373S(Holzapfel 等人，2001年，《美國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志》，第73卷，第365S-373S頁(yè)）；Sneath，ed. (1986) Bergeyj s Manual of Systematic Bacteriology Vol2, Lippincott, Williams and Wilkins, Hagerstown, MD) (Sneath編輯，1986年，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，第2卷， Lippincott、Williams 和 Wilkins，馬里蘭州黑格斯敦））。
[0050] 在一些實(shí)施例中，使用乳桿菌。所謂"乳桿菌"意指來(lái)自乳桿菌屬的任何細(xì) 菌，包括但不限于干酪乳桿菌（Lcasei)、類(lèi)干酪乳桿菌（Lparacasei)、羅伊氏乳桿菌 (L. reuteri)、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus)、約漢遜氏乳桿菌（L. /ohnsonni)、加氏乳桿 菌（L.gasseri)、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus)、植物乳桿菌（L.plantarum)、發(fā)酵乳桿菌 (L. fermentum)、唾液乳桿菌（L. salivarius)、惰性乳桿菌（L. iners)、保加利亞乳桿菌 (L.bulgaricus)，以及 Wood 等人概述的多種其他物種（Holzapfel and Wood，eds. (1995) The Genera ofLactic Acid Bacteria,Vol. 2· , Springer,New York(Holzapfel 和 Wood 編 輯，1995年，《乳酸菌的屬》，第2卷，施普林格，紐約））。在具體實(shí)施例中，細(xì)菌是嗜酸乳桿 菌 NCK2025。
[0051] LTA的展示減少的細(xì)菌的產(chǎn)生、此類(lèi)細(xì)菌的起子培養(yǎng)物的制備以及底物尤 其是食物底物例如牛奶和益生元低聚糖（如，半乳糖-低聚糖或果糖-低聚糖）的 發(fā)酵方法可根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于：Mayra-Makineii and Bigret(1993) Lactic Acid Bacteria. Salminen and vonffright eds.Marcel Dekker, Inc. New York. 65-96 ( 和 Bigret，1993 年，《乳酸菌》，Salminen 和 vonWright 編 輯，Marcel Dekker 公司，紐約，第 6δ_96 頁(yè)）；Sandine(l996)Dairy Starter Cultures Cogan and Accolas eds. VCH Publishers，New York. 191-206 (Sandine，1996 年，《乳品起 子培養(yǎng)物》，Cogan和Accolas編輯，VCH出版社，紐約，第191-206頁(yè)）；Gilliland (1985) Bacterial Starter Cultures for Food. CRC Press, Boca Raton, Florida(Gilliland, 1985年，《食品的細(xì)菌起子培養(yǎng)物》，CRC出版社，佛羅里達(dá)州博卡拉頓）中描述的那些技術(shù)。 在一些實(shí)施例中，LTA-缺陷細(xì)菌通常被認(rèn)為是安全的（GRAS)。
[0052] 本文所述的細(xì)菌細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如通常在Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York) (Sambrook 等人，1989 年，《分子克隆： 實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約州冷泉港）中所描述。
[0053] 在一些實(shí)施例中，本文所述的細(xì)菌菌株是這樣的細(xì)菌的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物，該 細(xì)菌包含至少一種導(dǎo)致本文所述的細(xì)胞表面上LTA的展示減少的基因變更。在另外的實(shí)施 例中，細(xì)菌包含一種或多種核苷酸添加、缺失和/或置換。這些菌株可包括但不限于：嗜酸 乳桿菌、加氏乳桿菌、約漢遜氏乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌（Lactococcus Iactis)、嗜 熱鏈球菌（Streptoccus thermophilus)和腸球菌屬物種。所謂"生物學(xué)上純的"是指90%、 95%、96 %、97%、98 %、99 %或100 %不含其他細(xì)菌細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，本文所述的細(xì)菌 菌株與其他細(xì)菌菌株組合存在而生成混合培養(yǎng)物。
[0054] "對(duì)照"或"對(duì)照細(xì)胞"或"對(duì)照細(xì)菌"提供了測(cè)量重組細(xì)菌細(xì)胞表型變化的基準(zhǔn)點(diǎn)。 對(duì)照細(xì)菌可包括，例如：（a)野生型細(xì)菌，即與導(dǎo)致產(chǎn)生主題細(xì)菌的基因變更的起始材料有 相同的基因型；或（b)與起始材料基因型相同但已用無(wú)效構(gòu)建體（即對(duì)所關(guān)注的性狀不具 有已知效果的構(gòu)建體，例如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體）轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。
[0055] 表面上LTA的展示減少或改變的重組生物體可使用多種技術(shù)構(gòu)建。在本發(fā)明中， 可減少編碼一種LTA組裝途徑的至少一種酶例如磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷 酸或多肽的表達(dá)，如本文所述。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施例中，包含磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的LTA-相關(guān)多肽的水平減少。磷酸甘油轉(zhuǎn) 移酶是涉及Gro-P單元轉(zhuǎn)移至糖脂從而延伸LTA鏈的多肽。各種磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶多肽和編 碼所述多肽的基因是已知的。如本文所用，磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶涵蓋LTA合酶（LtaS)、甘油磷 酸轉(zhuǎn)移酶、甘油磷酸轉(zhuǎn)移酶以及任何其他催化Gro-P單元轉(zhuǎn)移形成LTA的聚甘油磷酸主鏈 的多肽。磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶是堿性磷酸酶超家族的成員（MdoB [C0G1368]磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶）。 參見(jiàn),例如NCBI登錄號(hào)NZ_ACGX01000068. 1和NC_010609. 1。這些參考文獻(xiàn)中的每一個(gè)以 引用方式并入本文。
[0057] 在另一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞表面上LTA的展示改變或減少的細(xì)菌可使糖基轉(zhuǎn)移酶的 表達(dá)減少。在該實(shí)施例中，糖基轉(zhuǎn)移酶的水平使用本文別處所述的減少多核苷酸或多肽水 平的方法中的任何一個(gè)方法來(lái)減少。糖基轉(zhuǎn)移酶是涉及糖脂和LTA的脂質(zhì)錨的合成的多 肽。糖基轉(zhuǎn)移酶多肽和編碼該多肽的基因是已知的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)糖基轉(zhuǎn)移酶是指任 何催化糖脂或LTA的脂質(zhì)錨的合成的多肽，包括例如YgpP、Ugt、BgsA、IagA、LafA或LafB。 糖基轉(zhuǎn)移酶是糖基轉(zhuǎn)移酶超家族的成員[C110013]。各種糖基轉(zhuǎn)移酶是已知的。 參見(jiàn)例如NCBI登錄號(hào)NC_010609. 1和EF138835. 1。這些參考物中的每一個(gè)以引用方式并 入本文。
[0058] 磷壁酸上D-Ala置換的質(zhì)量和水平可減少或改變細(xì)胞表面上LTA的展示。D-丙 氨酰-LTA的合成需要dlt操縱子DltA、DltB、DltC或DltD編碼的四個(gè)蛋白質(zhì)。因此，在 一些實(shí)施例中，LTA-相關(guān)多核苷酸或多肽可包括Dlt操縱子中示出的多核苷酸或多肽，包 括SEQ ID NO : 9-16。因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，DltA、DltB、DltC或DltD的水平減少。 dlt操縱子的各種成員是已知的。參見(jiàn)例如NCBI登錄號(hào)AAF09201 (DltA)、NCBI登錄號(hào) AAB17658. I (DltB)、NCBI 登錄號(hào) CAR86674. I (DltC)和 NCBI 登錄號(hào) CAQ6598L I (DltD)。這 些參考物中的每一個(gè)以引用方式并入本文。LTA的結(jié)構(gòu)可通過(guò)NMR和MS使用已知的技術(shù)測(cè) 量。參見(jiàn)例如 Morath S，Geyer A，&Hartung T (2001) J Exp Meadl93 (3) :393-397 (Morath S、Geyer A和Hartung T，2001年，《（實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，第193卷，第3期，第393-397頁(yè)）。
[0059] 保藏
[0060] 申請(qǐng)人:于2011年1月10日將嗜酸乳桿菌NCK2025保藏在弗吉尼亞州馬納薩 斯的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC，Manassas， VA20110USA)，ATCC保藏號(hào)PTA-11587。2011年I月10日保藏在ATCC的細(xì)菌培養(yǎng)物在本 專(zhuān)利申請(qǐng)的 申請(qǐng)日期:之前取自北卡羅來(lái)納州立大學(xué)（North Carolina State University) 保存的保藏物，地址北卡羅來(lái)納州羅利市，校園郵箱7624,肖布霍爾100室，郵編 27695 (IOOSchaub Hall，Campus Box7624, Raleigh，North Carolina，27695)。在本申請(qǐng)待 審期間，專(zhuān)利和商標(biāo)專(zhuān)員可獲取該保藏物，由專(zhuān)員確定的人員在提出請(qǐng)求后也有權(quán)獲取該 保藏物。在本申請(qǐng)中的任何權(quán)利要求獲得批準(zhǔn)后， 申請(qǐng)人:將根據(jù)37C. F. R. § 1. 808使該保 藏物可供公眾獲取。嗜酸乳桿菌NCK2025的該保藏物將保存在公共保藏庫(kù)ATCC保藏庫(kù)中 30年，或在最新請(qǐng)求后5年，或本專(zhuān)利的可執(zhí)行期（enforceable life)中的較長(zhǎng)者，并且如 果在該期限內(nèi)無(wú)法存活將會(huì)更換。另外， 申請(qǐng)人:已經(jīng)或?qū)M(mǎn)足37C.F.R. § § 1.801-1.809 的所有要求，包括提供保藏時(shí)樣品存活力的指示。 申請(qǐng)人:無(wú)權(quán)免除法律所規(guī)定的對(duì)生物材 料的轉(zhuǎn)移或其商業(yè)運(yùn)輸?shù)娜魏蜗拗啤?br> [0061] 根據(jù)以上提供的說(shuō)明，提供了如下編號(hào)的實(shí)施例：
[0062] 1. 一種減少哺乳動(dòng)物中的息肉病的方法，所述方法包括將治療有效量的細(xì)菌施用 于哺乳動(dòng)物，所述細(xì)菌經(jīng)基因修飾或選擇以減少所述細(xì)菌表面上的脂磷壁酸（LTA)展示。
[0063] 2.實(shí)施例1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有發(fā)展息肉病或結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)因 素。
[0064] 3.實(shí)施例2的方法，其中所述風(fēng)險(xiǎn)因素是腫瘤抑制基因的突變。
[0065] 4.實(shí)施例3的方法，其中所述腫瘤抑制基因是結(jié)腸腺瘤性息肉?。ˋPC)基因。
[0066] 5.實(shí)施例1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有至少一種息肉。
[0067] 6.實(shí)施例1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有至少一種在胃腸道中的息 肉或至少一種在直腸中的息肉。
[0068] 7.實(shí)施例1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有至少一種贅生性息肉。
[0069] 8.實(shí)施例7的方法，其中所述贅生性息肉是腺瘤性息肉。
[0070] 9.實(shí)施例8的方法，其中所述腺瘤性息肉位于所述哺乳動(dòng)物的胃腸道中或位于直 腸中。
[0071] 10.實(shí)施例5或6的方法，其中所述息肉是惡性息肉。
[0072] 11.實(shí)施例1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療有效量的細(xì)菌的施用減少息肉內(nèi) 有絲分裂活性。
[0073] 12.實(shí)施例11的方法，其中所述息肉內(nèi)有絲分裂活性的減少包括Ki-67+或 TUNEL+細(xì)胞的減少。
[0074] 13.實(shí)施例5-12中任一項(xiàng)的方法，其中當(dāng)與健康相鄰組織比較時(shí)，所述息肉以息 肉內(nèi)炎癥為特征。
[0075] 14.實(shí)施例13的方法，其中所述治療有效量的細(xì)菌的施用減少所述息肉內(nèi)炎癥。
[0076] 15.實(shí)施例14的方法，其中所述息肉內(nèi)炎癥的減少包括至少一種選自以下的細(xì)胞 類(lèi)型的密度的減少：肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、Grl+粒細(xì)胞、樹(shù) 突狀細(xì)胞和促炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0077] 17.實(shí)施例5-10或13-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療有效量的細(xì)菌的施用減 少息肉內(nèi)骨髓細(xì)胞密度、息肉內(nèi)肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞 計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞計(jì)數(shù)或息肉內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0078] 18.實(shí)施例1-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療有效量的細(xì)菌的施用減少脾臟尺 寸、脾臟巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)或脾臟粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0079] 19. -種抑制哺乳動(dòng)物中的息肉病的方法，所述方法包括將治療有效量的細(xì)菌施 用于哺乳動(dòng)物，所述細(xì)菌經(jīng)基因修飾以減少所述細(xì)菌表面上的脂磷壁酸（LTA)展示。
[0080] 20.實(shí)施例19的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有發(fā)展息肉病或結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)因 素。
[0081] 21.實(shí)施例20的方法，其中所述風(fēng)險(xiǎn)因素是腫瘤抑制基因的突變。
[0082] 22.實(shí)施例21的方法，其中所述腫瘤抑制基因是結(jié)腸腺瘤性息肉病（APC)基因。
[0083] 23.實(shí)施例1-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
[0084] 24.實(shí)施例1-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是馴養(yǎng)動(dòng)物。
[0085] 25.實(shí)施例1-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是耕作動(dòng)物。
[0086] 26.實(shí)施例1-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌是益生菌。
[0087] 27.實(shí)施例26的方法，其中所述益生菌是乳酸菌。
[0088] 28.實(shí)施例27的方法，其中所述乳酸菌是乳桿菌。
[0089] 29.實(shí)施例28的方法，其中所述乳桿菌是嗜酸乳桿菌。
[0090] 30.實(shí)施例29的方法，其中所述嗜酸乳桿菌是以ATCC登錄號(hào)PTA-11587保藏的嗜 酸乳桿菌NCK2025。
[0091] 31.實(shí)施例1-30中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌與至少一種其他細(xì)菌菌株組合施 用。
[0092] 32.實(shí)施例31的方法，其中所述至少一種其他細(xì)菌菌株是益生菌。
[0093] 實(shí)駘
[0094] 實(shí)例 1
[0095] 將結(jié)腸息肉病小鼠模型用于研究腸道菌群在控制胃腸免疫平衡中的作用。為了分 析NCK2025的免疫調(diào)節(jié)特性，每天用5X IO8Cfu NCK2025的劑量口服治療5個(gè)月大充滿(mǎn)息 肉的小鼠，或喂入水4周作為對(duì)照。為了具體闡述LTA的作用，第三組小鼠以類(lèi)似的方式用 親代嗜酸乳桿菌NCK56治療。在治療4周后，對(duì)所有小鼠實(shí)施安樂(lè)死并分析。NCK56治療 小鼠與對(duì)照PBS治療小鼠相比息肉病的變化很小。相比之下，NCK2025治療的小鼠小腸中 息肉數(shù)量減低（圖1A)并且結(jié)腸息肉的數(shù)量顯著減少（圖ΙΑ、B)。與PBS-和NCK56治療 小鼠相比，在NCK2025治療小鼠的息肉中有絲分裂和凋亡活性顯著減低（圖1C、D)。這些 觀察結(jié)果同時(shí)證明了在這個(gè)模型中NCK2025 口服治療在具有預(yù)先建立的結(jié)腸息肉病的小 鼠中的治療特性以及親代嗜酸乳桿菌菌株的刺激活性。圖像使用Tissue Gnostics獲取并 且使用Image J進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)通過(guò)未配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)制造商的指示進(jìn)行 Ki_67(iHistochem 公司）和 TUNEL(密理博（Millipore)公司）染色。
[0096] 實(shí)例 2
[0097] 進(jìn)行整個(gè)結(jié)腸石蠟切片的免疫熒光染色，以提供NCK2025治療小鼠中炎癥受到抑 制的證據(jù)。之前，報(bào)道了腺瘤性息肉中肥大細(xì)胞的擴(kuò)增和活化，以及其腫瘤促進(jìn)作用的證據(jù) (Khazaie et al. (2011) Cancer Metastasis Rev30 : 45 (Khazaie 等人，2011 年，《（癌癥 與轉(zhuǎn)移評(píng)論》，第30卷，第45頁(yè)））。為了評(píng)估腸道菌群對(duì)炎癥的影響，對(duì)用NCK2025治療的 患有息肉病的小鼠進(jìn)行息肉內(nèi)肥大細(xì)胞密度定量，與喂入親代嗜酸乳桿菌NCK56的小鼠相 t匕。觀察到喂入NCK2025的小鼠中息肉內(nèi)肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)的顯著減少，達(dá)到相當(dāng)于無(wú)息肉病 小鼠的結(jié)腸中的肥大細(xì)胞的水平，但發(fā)現(xiàn)與PBS治療小鼠相比NCK56治療小鼠中的變化很 ?。▓D2A、D)。息肉被相對(duì)高密度的巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和骨髓來(lái)源抑制細(xì)胞浸潤(rùn)，因 此定量測(cè)量治療對(duì)F4/80+巨噬細(xì)胞和Grl +粒細(xì)胞的息肉內(nèi)密度的影響。用NCK2025治療導(dǎo) 致F4/80+和Grl+細(xì)胞的息肉內(nèi)密度顯著減少，達(dá)到健康腸道的典型水平（圖2B、C、E、F)。 這些細(xì)胞的密度在NCK56治療小鼠中無(wú)變化。數(shù)據(jù)通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)雙尾2型進(jìn)行分析，與未 治療的小鼠相比。冰凍結(jié)腸組織的切片（5 μ m厚）用特異性抗體的氯乙酸酯酶（CAE)染色， 如早前所述（Gounaris et al.，（2007) Proc Natl Acad Sci U S A104 : 19977 (Gounaris 等人，2007年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第104卷，第19977頁(yè)））。對(duì)于免疫染色一抗：大 鼠抗小鼠 F4/80(Abcam公司（Abeam))、生物素抗小鼠 Grl、倉(cāng)鼠抗小鼠⑶llc(BD生物科學(xué) 公司（BD Biosciences))、抗倉(cāng)鼠 AlexaFluor594、抗大鼠 AlexaFluor488、鏈霉抗生物素蛋 白488以及4,6-二脒基-2-苯基Π 引哚二鹽酸鹽（DAPI，英杰公司（Invitrogen))，以顯現(xiàn) 細(xì)胞核。圖像使用TissueGnostics組織/細(xì)胞高通量成像和分析系統(tǒng)（TissueGnostics Tissue/Cell High Throughput Imaging and Analysis System)獲取并且使用 ImageJ 軟 件進(jìn)行分析。
[0098] 樹(shù)突狀細(xì)胞（DC)賦予粘膜免疫性。為了揭示治療的影響，測(cè)定了所存在的DC的 IL-10、IL-12或TNF-α的息肉內(nèi)表達(dá)。息肉內(nèi)DC總體趨向于在息肉內(nèi)的數(shù)量比健康相鄰 組織高，但該差異在統(tǒng)計(jì)意義上不顯著（圖3A-C)，例外的是CD103+DC，其在息肉內(nèi)顯著升 高（圖3D)。用NCK2025治療使DC計(jì)數(shù)降低至接近健康野生型小鼠的DC計(jì)數(shù)，而NCK56 的影響很?。▓D3A-D)。因此，DC和促炎性細(xì)胞的息肉內(nèi)密度的減少表明NCK2025將充 滿(mǎn)息肉的小鼠中腸道的致病性免疫環(huán)境成功重置回其生理狀態(tài)。數(shù)據(jù)通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)雙 尾2型進(jìn)行分析，與未治療的小鼠相比。免疫染色、采集和分析如圖2所述進(jìn)行?？贵w：倉(cāng) 鼠抗小鼠 CDllc(BD生物科學(xué)公司（BD Bioscience))、大鼠抗小鼠 IL-10、IL-12、IFN-γ、 TNF-a (BioLegend 公司（BioLegend))、抗倉(cāng)鼠 Alexa Fluor594、抗大鼠 Alexa Fluor488。
[0099] 實(shí)例 3
[0100] 之前，我們報(bào)道了息肉病相關(guān)的炎癥在遺傳性息肉病的小鼠模型中變?yōu)槿?性的，所述小鼠模型發(fā)展脾腫大并且血清促炎性細(xì)胞因子的水平升高（Gounaris et al. (2008)PL〇S One3 : e2916(Gounaris 等人，2008年，《PLoS One》，第 3卷，第 e2916頁(yè)））。 年老的充滿(mǎn)息肉的小鼠也發(fā)展脾腫大（圖5A)。用NCK2025治療使脾臟尺寸顯著減低，而用 NCK56治療顯示出類(lèi)似的趨勢(shì)，然而其沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性（圖5A)。脾臟尺寸減低與 脾臟中的CD4效應(yīng)T-細(xì)胞相對(duì)頻率增加和Tregs減低（圖5B)、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞減低（圖 5C)相關(guān)聯(lián)。類(lèi)似但不顯著的趨勢(shì)也可見(jiàn)于MLN中（圖5B、C)。這些變化對(duì)應(yīng)于血清中IL-10 以及促炎性細(xì)胞因子水平顯著下降但I(xiàn)L-22增加（圖6)。過(guò)濾單細(xì)胞懸浮液（40 μ m)，并 且使用Ack裂解緩沖液（BioWhittaker公司（BiOWhittaker))裂解血細(xì)胞（RBC)。洗滌細(xì) 胞，然后用Fe block(BD生物科學(xué)公司（BD Bioscience))溫育。排除死細(xì)胞（LIVE/DEAD紫 死細(xì)胞染色試劑盒（LIVE/DEAD Violet Dead cell Stain kit);英杰公司（Invitrogen))。 抗體：CDllc FITC(HL3)、GRlAPC(RB6-8C5)、CD4Percp(RM4-5)、CD25 生物素（7D4)和鏈霉抗 生物素蛋白 FITC 得自 BD Pharmingen 公司（BD Pharmingen) ;F4/80Percp(BM8)和 CDllb PE-Cy7(Ml/70)得自 Biolegend 公司（Biolegend)。數(shù)據(jù)用 BDFACSCanto II 獲取，并且使 用FlowJo軟件（Tree Star公司（Tree Star))進(jìn)行分析。多重ELISA根據(jù)制造商的指示 (密理博公司（Millipore))在已過(guò)濾（0. 22mm)血清上進(jìn)行。結(jié)果使用LuminexlOO儀器獲 取并使用xponent軟件（Luminex公司（Luminex Corporation))進(jìn)行分析。我們的發(fā)現(xiàn)同 時(shí)表明NCK2025施用至具有確立的息肉的小鼠可下調(diào)炎癥，并且重置局部和全身性免疫， 而在該模型中親代NCK56菌株產(chǎn)生中間響應(yīng)。
[0101] 實(shí)例 4
[0102] Tregs在癌癥中具有雙重作用，不僅增加總數(shù)以及抑制保護(hù)性T-細(xì)胞免疫性，而 且通過(guò)抑制炎癥而防止癌癥。在癌癥和慢性炎癥中，Tregs可喪失其抗炎特性。這可通過(guò) ROR Y t的表達(dá)和Foxp3的喪失而發(fā)生，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化為T(mén)H17細(xì)胞?；蛘撸鼈兛晒脖磉_(dá)Foxp3 和ROR Y t，保持T-細(xì)胞抑制特性，但獲得促炎功能。在兩種情況下，Tregs的抗炎特性喪失 是促使致病性炎癥逐步升級(jí)的關(guān)鍵因素 （Blatner et al.，（2010)Proc Natl Acad Sci U S A107 :6430 (Blatner等人，2010年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第107卷，第6430頁(yè)））。鑒于用 NCK2025治療的小鼠中炎癥的減低，我們假設(shè)NCK2025治療有助于Treg抗炎特性的恢復(fù)。腸 道組織的免疫染色揭示了 NCK2025治療小鼠的息肉中Foxp3+細(xì)胞的密度減低（圖4D)。這 未必揭示Tregs的致病性亞型與保護(hù)性亞型的相對(duì)比率。實(shí)際上，NCK2025治療的小鼠顯示 出息肉侵潤(rùn)性F 〇xp3+R0R γ t_良性Tregs的密度顯著增加（圖4E)，以及F〇xp3+R0R γ t+促炎 性Tregs密度的對(duì)應(yīng)下降（圖4F);用親代NCK56治療的小鼠顯示出中間響應(yīng)（圖4E、F)。 表達(dá)ROR Y t的非Tregs的水平?jīng)]有因 NCK2025發(fā)生改變，而促炎性⑶4+IFN γ +T-細(xì)胞減低 (圖4G、H)。這些觀察結(jié)果清楚地表明NCK2025治療小鼠的息肉微環(huán)境中促炎性與抗炎性 Tregs的平衡的變化，以及炎性輔助T-細(xì)胞的對(duì)應(yīng)減低。我們的發(fā)現(xiàn)突出了分別分析Treg 各亞型的重要性，并且提示了 NCK2025能改善患有息肉病的小鼠的Treg保護(hù)功能。數(shù)據(jù)通 過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)雙尾2型進(jìn)行分析，與未治療的小鼠相比。免疫染色、采集和分析如圖3所 述進(jìn)行。抗體：小鼠抗小鼠⑶4 (Abeam公司（Abeam))、大鼠抗小鼠 IFN-γ (BioLegend公司 (BioLegend))、大鼠抗小鼠 Foxp3 (ebiosciences 公司（ebiosciences))、兔抗小鼠 RoR Y、 抗大鼠 Alexa Fluor488、抗小鼠 Alexa Flour594、抗兔 Alexa Fluor488。
[0103] 因此，患有癌癥前期結(jié)腸息肉的小鼠中的病理炎癥可通過(guò)有益微生物的口服治療 重置為保護(hù)模式。健康腸道免疫性處于平衡狀態(tài)，該狀態(tài)允許針對(duì)病原體的準(zhǔn)確和快速的 保護(hù)響應(yīng)，同時(shí)縮減致病性炎癥過(guò)程。該平衡通過(guò)微生物群驅(qū)動(dòng)的炎癥和Tregs的IL-IO 依賴(lài)性炎癥抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)。促炎性和抗炎性⑶4+T-細(xì)胞二者通過(guò)其與⑶Ilc+DC的相互作 用而分化和活化。調(diào)節(jié)性或促炎性DC通過(guò)其細(xì)胞因子的表達(dá)被識(shí)別，所述細(xì)胞因子例如 引起胸腺外Tregs的生成的IL-10,以及促炎性細(xì)胞因子，促炎性細(xì)胞因子包括將T-細(xì)胞 定向于THl或TH17譜系（36、37)的IL-12和TNF-α。腸道衍生的DC在將腸道歸巢特性 以⑶103和視黃酸依賴(lài)性方式賦予這些T-細(xì)胞中具有顯著作用（Mora et al.，（2003) Nature424 : 88 (Mora等人，2003年，《自然》，第424卷，第88頁(yè)））。通過(guò)磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶 基因的缺失來(lái)喪失LTA消除了嗜酸乳桿菌與腸道相互作用的免疫刺激組分，從而導(dǎo)致炎癥 和免疫性的質(zhì)量的變化。雖然腸道以及脾臟中促炎性細(xì)胞的密度下調(diào)，但效應(yīng)T-細(xì)胞的相 對(duì)密度增加，并且Tregs減少。這些變化反映了 NCK2025治療小鼠中健康免疫性的重置。該 治療的有趣結(jié)果是息肉侵潤(rùn)性Treg亞型的變化。癌癥炎癥由Tregs調(diào)節(jié)，其在息肉病和癌 癥中趨于回復(fù)到促炎性表型（Gounaris et al.，（2009)Cancer Res69 : 5490(Gounaris 等 人，2009年，《癌癥研究》，第69卷，第5490頁(yè)））。在本研究中，用NCK2025 口服治療顯著增 加了抗炎性Tregs相對(duì)于炎性Tregs的比率。我們預(yù)期該變化對(duì)于腸道中的炎癥從致病性 水平恢復(fù)至健康水平是關(guān)鍵的。
【權(quán)利要求】
1. 一種減少哺乳動(dòng)物中的息肉病的方法，所述方法包括將治療有效量的細(xì)菌施用于哺 乳動(dòng)物，所述細(xì)菌經(jīng)基因修飾以減少所述細(xì)菌表面上的脂磷壁酸（LTA)展示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有發(fā)展息肉病或結(jié)腸直腸癌的風(fēng) 險(xiǎn)因素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述風(fēng)險(xiǎn)因素是腫瘤抑制基因的突變。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述腫瘤抑制基因是結(jié)腸腺瘤性息肉病（APC)基 因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有至少一種息肉。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有至少一種在胃腸道 中的息肉或至少一種在直腸中的息肉。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有至少一種贅生性息 肉。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述贅生性息肉是腺瘤性息肉。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述腺瘤性息肉位于所述哺乳動(dòng)物的胃腸道中或 位于直腸中。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述息肉是惡性息肉。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用治療有效量的細(xì)菌減少息 肉內(nèi)有絲分裂活性。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述息肉內(nèi)有絲分裂活性的減少包括Ki-67+或 TUNEL+細(xì)胞的減少。
13. 根據(jù)權(quán)利要求5-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)與健康相鄰組織比較時(shí)，所述息 肉以息肉內(nèi)炎癥為特征。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述施用治療有效量的細(xì)菌減少所述息肉內(nèi)炎 癥。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述息肉內(nèi)炎癥的減少包括至少一種選自以下 的細(xì)胞類(lèi)型的密度的減少：肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、Grl+粒 細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和促炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求5-10或13-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用治療有效量的細(xì) 菌減少息肉內(nèi)骨髓細(xì)胞密度、息肉內(nèi)肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)嗜中性粒 細(xì)胞計(jì)數(shù)、息肉內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞計(jì)數(shù)或息肉內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用治療有效量的細(xì)菌減少脾 臟尺寸、脾臟巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)或脾臟粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
18. -種抑制哺乳動(dòng)物中的息肉病的方法，所述方法包括將治療有效量的細(xì)菌施用于 哺乳動(dòng)物，所述細(xì)菌經(jīng)基因修飾以減少所述細(xì)菌表面上的脂磷壁酸（LTA)展示。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有發(fā)展息肉病或結(jié)腸直腸癌的 風(fēng)險(xiǎn)因素。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述風(fēng)險(xiǎn)因素是腫瘤抑制基因的突變。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述腫瘤抑制基因是結(jié)腸腺瘤性息肉病（APC) 基因。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是馴養(yǎng)動(dòng)物。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是耕作動(dòng)物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌是益生菌。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述益生菌是乳酸菌。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述乳酸菌是乳桿菌（Lactobacillus)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述乳桿菌是嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus)〇
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述嗜酸乳桿菌是以ATCC登錄號(hào)PTA-11587保 藏的嗜酸乳桿菌NCK2025。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌與至少一種其他細(xì)菌菌株 組合施用。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述至少一種其他細(xì)菌菌株是益生菌。
【文檔編號(hào)】A61K35/744GK104321065SQ201280061005
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月20日
【發(fā)明者】M·莫哈馬扎德, 托德·克萊恩哈默 申請(qǐng)人:北卡羅來(lái)納州立大學(xué), M·莫哈馬扎德