輔助性t細胞誘導多肽的修飾的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了能夠?qū)崿F(xiàn)有效抗原呈遞的腫瘤抗原特異性的Th誘導多肽和使用它們的抗腫瘤劑。
【專利說明】輔助性T細胞誘導多肽的修飾

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及輔助性T細胞(Th)誘導多肽的修飾分子和含有修飾分子的抗腫瘤劑等。

【背景技術】
[0002]在針對腫瘤的免疫中，CDS+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)作為殺死腫瘤細胞的效應物起關鍵作用。另外，已經(jīng)報道，⑶4+輔助性T (Th)細胞，特別是Thl型Th細胞，是誘導有效的抗腫瘤免疫活性所必需的(非專利文獻1- 4)。迄今為止，關于Th細胞在抗腫瘤免疫方面的作用已經(jīng)做出多篇報道；并且CTL的分化和生長的誘導(非專利文獻5)、提供能夠直接活化CTL的抗原呈遞細胞(APC)并通過抗原向APC的交叉呈遞來活化CTL (非專利文獻6、7)、對CTL和APC的抗細胞凋亡效應(非專利文獻8、9)、幫助記憶⑶8 T細胞生長的功能以及外周庫的保持和繁殖(非專利文獻10、11)、CTL向腫瘤組織中滲入的誘導(非專利文獻12，13)等是已知的。
[0003]關于使用抗腫瘤免疫來治療惡性腫瘤的方法已經(jīng)做出許多研究。例如，在使用結(jié)合HLA (人白細胞抗原；下述的人MHC將被稱作HLA) I類的、誘導CTL的腫瘤抗原特異性多肽的免疫療法中，將所述多肽單獨施用或者與非甲基化的脫氧CpG、Toll-樣受體配體或佐劑(諸如Flt3)—起施用。但是，通過這樣的方法，CTL可以生長，但難以活化至足以作為效應物的水平，并且臨床應答是有限的。作為一種新的抗腫瘤免疫療法，還考慮這樣的免疫療法，其使用結(jié)合HLA I類的、誘導CTL的腫瘤抗原多肽和結(jié)合HLA II類的、誘導Th細胞的腫瘤抗原多肽。但是，這樣的方法不一定活化腫瘤抗原特異性的Th細胞，而是相反，可能誘導抑制針對腫瘤抗原的調(diào)節(jié)性T細胞(Tms)，由此導致抗腫瘤免疫可能被抑制(非專利文獻14)。具體地，在抗腫瘤免疫中，由于靶抗原是在個體自己體內(nèi)在生理學上產(chǎn)生的腫瘤抗原，免疫系統(tǒng)會將腫瘤抗原視作它自己的組分，通常不會表現(xiàn)出侵襲性應答。這是因為，阻止T細胞的自體反應性的“自體耐受性”的固有系統(tǒng)會造成識別自體抗原并與其強烈反應的未成熟T細胞的細胞死亡，并在功能上抑制與自體抗原溫和地或較弱地反應的剩余T細胞。因此，腫瘤抗原的粗心施用非?？赡苷T導TMg和抑制針對腫瘤的免疫應答。為了排除這種可能性，發(fā)明人曾經(jīng)通過包括以下步驟的方法成功地誘導了抗腫瘤免疫:使用非腫瘤抗原百日咳疫苗(其含有結(jié)合HLA I類的、誘導CTL的腫瘤抗原多肽)作為佐劑來誘導針對第三方抗原百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的Th細胞,并用Th細胞培養(yǎng)腫瘤抗原特異性的CTL (專利文獻I)。具體地，由于在該方法中使用百日咳博德特氏菌全細胞疫苗，可以有效地誘導表現(xiàn)出高CTL誘導活性的Thl型Th細胞。但是，關于腫瘤抗原特異性的Thl細胞的誘導，由于上述的調(diào)節(jié)性T細胞的問題，尚不存在確定的誘導方法。
[0004][文件列表]
[專利文獻]
專利文獻 1: W02008/096831 [非專利文獻]非專利文獻 1: Fallarino 等人，J Immunol 165，5495-5501，2000 非專利文獻 2: Jin 等人，Int J Cancer 111，558-567，2004 非專利文獻 3: Nishimura 等人，JExpMed 190, 617-627，1999 非專利文獻 4: Xie 等人，JExpMed 207, 651-667，2010 非專利文獻 5: Keene 和 Forman, JExpMed 155，768-782，1982 非專利文獻 6: Bennett 等人，Nature 393，478-480，1998 非專利文獻 7: Ridge 等人，Nature 393，474-478，1998 非專利文獻 8: Kennedy 和 Celis, J Immunol 177，2862-2872，2006 非專利文獻 9: Mueller 等人，J Immunol 176，7379-7384，2006 非專利文獻 10: Janssen 等人，Nature 852-856，2003 非專利文獻 11: Shedlock 和 Shen, Science 300, 337-339，2003 非專利文獻 12: Marzo 等人，J Immunol Methods 165，6047-6055，2000 非專利文獻 13: Wong 等人，J Immunol 3112-3131，2008 非專利文獻 14: Yamazaki 等人，Blood 110，4293-4302，2010。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明的一個目的是，提供腫瘤抗原特異性的Th誘導多肽的修飾分子和使用它們的抗腫瘤劑。
[0006]解決問題的方式
發(fā)明人注意到包括免疫接種MHC (主要組織相容性復合物)I類結(jié)合肽來誘導CTL的常規(guī)免疫接種方案的一個嚴重問題是不能實現(xiàn)足夠抗腫瘤活性，即使當腫瘤特異性的CTL存在時，因為它不會充分地滲入腫瘤組織中。因此，發(fā)明人研究了腫瘤特異性的T細胞滲入進腫瘤組織中的機制，并注意到，體內(nèi)實體瘤消退通常不僅與腫瘤組織中的CTL有關，而且與Th細胞的滲入有關。以前的報道在這點上是達成共識的。通常，由于T細胞(Th和CTL)在血液中循環(huán)遍及全身，它們被血管內(nèi)皮細胞阻止，不可直接接觸腫瘤組織。發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞會攝取在附近的細胞凋亡性腫瘤細胞，并將腫瘤抗原衍生的多肽呈現(xiàn)給血管內(nèi)皮細胞的MHC II類，以將腫瘤特異性的Th細胞招引進腫瘤組織中。發(fā)明人還觀察至丨J，侵入腫瘤組織中的Th會分泌IFN- Y，并且IFN- Y誘導趨化因子(1-TAC、IP-10、Mig)在血管內(nèi)皮細胞中的表達，由此促進高度表達CXCR-3(其為這些IFN-Y依賴性的趨化因子的受體)的CTL在腫瘤中的滲入，從而使實體瘤消退。因此，就該活性而言，腫瘤特異性的Th細胞理想地是Thl型Th。該發(fā)現(xiàn)已經(jīng)使得下述方面顯而易見:開發(fā)一種用于有效地誘導腫瘤抗原特異性的Th細胞的方法是開發(fā)造成實體瘤消退的免疫接種方案的關鍵技術。在本申請中，注意向這些多肽添加修飾，所述修飾會賦予對酶的抗性，所述酶降解結(jié)合MHC II類的多肽、誘導Th對這些多肽的消化。所以，如下所述，可以使Th誘導效率增加數(shù)百倍。已經(jīng)澄清，該效應是非常有利的(特別當用腫瘤抗原多肽在體內(nèi)免疫活體時)，并且是誘導針對腫瘤抗原(其為通常難以誘導Th細胞的自身抗原)的Th細胞所必需的修飾。也就是說，證實了通過根據(jù)Th細胞的多肽識別效率給結(jié)合MHC II類的多肽添加修飾，可以顯著增加誘導效率?；谶@些想法，發(fā)明人進行了許多研究并完成了本發(fā)明。
[0007] 因此，本發(fā)明提供了
[1]分離的多肽的修飾分子，其源自腫瘤特異性的抗原且結(jié)合MHCII類分子；
[2][I]的修飾分子，其中所述修飾是向分離的多肽的C端側(cè)和/或N端側(cè)添加幾個氨基酸；
[3][2]的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的C端側(cè)的氨基酸是由下式(I)表示的氨基酸序列:
X1-X2-X3-X4 (I)
其中
[1]Xl表示生物素化的Lys，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表示一個氨基酸或單鍵，且X4表示一個氨基酸或羧基(條件是，當X3是Ρι.ο時，那么X4表示一個氨基酸)，
[2]Xl表示一個除了生物素化的Lys以外的氨基酸或單鍵，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表不Pro,且X4表不一個氨基酸,或
[3]Xl表示一個除了生物素化的Lys以外的氨基酸或單鍵，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表示一個除了 Pro以外的氨基酸或單鍵，且X4表示β -Ala)；
[4][3]的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的C端側(cè)的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中
(1)Xl表示生物素化的Lys，X2表示一個氨基酸或單鍵，X3表示一個氨基酸或單鍵，且X4表示一個氨基酸或羧基(條件是，當X3是Ρι.ο時，那么X4表示一個氨基酸)，或
(2)Xl表示單鍵，X2表示單鍵，X3表示Pro，且X4表示一個氨基酸；
[5][4]的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的C端側(cè)的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中
Xl表示生物素化的Lys, X2表示單鍵，X3表示單鍵,且X4表示Gly或羧基，
Xl表示單鍵，X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示Ala或β -Ala,或 Xl表示生物素化的Lys, X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示β -Ala ；
[6][2]-[5]中的任一項的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的N端側(cè)的氨基酸是由下式(II)表示的氨基酸序列:
Υ1-Υ2-Υ3 (II)
其中
(1)Yl表示Pro，Y2表示幾個氨基酸或單鍵，且Y3表示一個氨基酸或單鍵，或
(2)Yl表示一個除了 Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示幾個氨基酸或單鍵，且Y3表示生物素化的Lys
(條件是，不包括其中從N端計的第二個氨基酸是Pro的氨基酸序列)；
[7][6]的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中
(1)Yl表示Pro，Y2表示一個氨基酸或單鍵，且Y3表示一個氨基酸或單鍵，或
(2)Yl表示一個除了 Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示一個氨基酸或單鍵，且Y3表示生物素化的Lys
(條件是，不包括其中從N端計的第二個氨基酸是Pro的氨基酸序列)；
[8][7]的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中
Yl表示Pro，Y2表示Ser，Y3表示單鍵，
Yl表示氨基，Y2表示Ser,且Y3表示生物素化的Lys,或 Yl表示Pro, Y2表示Ser,且Y3表示生物素化的Lys ；
[9][1]-[8]中的任一項的修飾分子，其中所述分離的多肽包含源自WTl、PSA、MAGE-3、存活素、CEA、酪氨酸酶、丙型肝炎病毒或EB病毒的氨基酸序列，且結(jié)合MHC II類分子；
[10][9]的修飾分子，其中所述分離的多肽包含源自WTl的氨基酸序列且結(jié)合MHC II類分子；
[11]分離的多肽,其包含由SEQID NO: 37,SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 40顯示的氨基酸序列；
[12]抗腫瘤劑，其包含[1]_[10]中的任一項的修飾分子或[11]的分離的多肽；
[13][12]的抗腫瘤劑，所述抗腫瘤劑還包含分離的多肽，所述多肽源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC I類分子；
[14][12]或[13]的抗腫瘤劑，所述抗腫瘤劑還包含佐劑；
[15][14]的抗腫瘤劑，其中所述佐劑是百日咳疫苗；
[16]治療腫瘤的方法，所述方法包括:給患者施用有效量的[12]-[15]中的任一項的抗腫瘤劑；
[17]用于治療腫瘤的組合物，其包含[1]_[10]中的任一項的修飾分子或[11]的分離的多肽、源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC I類分子的分離的多肽和佐劑；
[18][1]-[10]中的任一項的修飾分子或[11]的分離的多肽在生產(chǎn)抗腫瘤劑中的用途；
[19]一種檢查試驗對象是否具有結(jié)合在修飾分子中所含的分離多肽的MHC II類分子的方法，所述方法包括:培養(yǎng)從試驗對象衍生出的抗原呈遞細胞群體和[1]_[10]中的任一項的修飾分子，和證實所述抗原呈遞細胞群體和所述修飾分子的結(jié)合；
[20]—種檢查肽是否可以結(jié)合抗原呈遞細胞的方法，所述方法包括:培養(yǎng)抗原呈遞細胞，所述細胞表達特定MHC II類分子和具有經(jīng)修飾的N端和/或C端的任意肽，和證實所述抗原呈遞細胞和所述肽的結(jié)合；等。
[0008]本發(fā)明的效果
使用本發(fā)明的腫瘤抗原特異性的Th誘導多肽的修飾分子，可以比以前顯著更有效地將腫瘤特異性抗原呈遞在抗原呈遞細胞的MHC II類分子上，并且可以更有效地誘導腫瘤抗原特異性的Th細胞。所以，腫瘤抗原特異性的Th細胞可以滲入腫瘤組織中。此外，假如該Th細胞已經(jīng)滲入腫瘤組織中，CTL會引導滲入腫瘤組織中并殺死腫瘤細胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1，上圖顯示了滲入實體瘤(EL4腫瘤和E.G7 (表達OVA基因的EL4)腫瘤)中的PKH-標記的D011.10的數(shù)目。下圖顯示了脾中的PKH陽性細胞的數(shù)目。KO顯示了 MHCII類(1-Aeb) KO小鼠；KO — Fl顯示了用MHC II類KO小鼠的骨髓移植的CBFl小鼠；且Fl — KO顯示了作為其反轉(zhuǎn)的骨髓嵌合小鼠。
[0010]圖2顯示了在將F2-1Ad細胞(其已經(jīng)攝入每個腫瘤細胞2天)或OVAII脈沖的F2-1Ad細胞和DOll.10細胞溫育24小時以后，D011.10細胞中的CD69陽性細胞的比例。
[0011]圖3顯示了在將F2-1Ad細胞(在有或沒有氯喹存在下與OVA—起呈遞抗原3天)和D011.10細胞溫育24小時以后，D011.10細胞中的CD69陽性細胞的比例。
[0012]圖4顯示了在將F2_IAd細胞(在有或沒有氯喹存在下已經(jīng)攝入每個腫瘤細胞2天)或OVAII脈沖的F2-1Ad細胞和D011.10細胞溫育24小時以后，D011.10細胞中的CD69陽性細胞的比例的對比。
[0013]圖5顯示了遷移穿過用不同濃度的OVAII脈沖的F2_IAd細胞層的D011.10細胞的數(shù)目，和識別類似地處理的F2-1Ad細胞且變成⑶69陽性的D011.10細胞的數(shù)目的比例。
[0014]圖6是已經(jīng)吞噬EL4-EGFP細胞或EG7-EGFP細胞的內(nèi)皮細胞的顯微照片。黑色箭頭顯示了含有在細胞內(nèi)發(fā)射綠色EGFP熒光腫瘤細胞碎片的內(nèi)皮細胞。白色箭頭顯示了尚未包含在細胞內(nèi)發(fā)射綠色EGFP熒光的腫瘤細胞的內(nèi)皮細胞。
[0015]圖7的圖顯示了在內(nèi)皮細胞下面螺動的D011.10細胞的數(shù)目。用η顯示了計數(shù)的內(nèi)皮細胞的總數(shù)。垂直條顯示了標準差(SD)的范圍。用星號標記這樣的組合:其通過Student氏t_檢驗顯示出測量的數(shù)目的P〈0.05的統(tǒng)計顯著差異。
[0016]圖8顯示了用活化Th或CTL的OVA衍生多肽免疫的小鼠中的抗腫瘤作用。EL4是移植給每只免疫小鼠的EL4腫瘤；EG7是移植給相同小鼠的EG7腫瘤；0VA_I是CTL誘導肽；OVA-1I是Th誘導妝 ；且λ是第二方抗原妝。
[0017]圖9顯示了滲入CBFl小鼠的EL4或Ε.G7-0VA (EG7)腫瘤的、PKH-標記的OT-1的數(shù)目。CXCR3_是CXCR3基因缺陷型CTL ;且IFN- Y _是IFN- Y基因缺陷型Th細胞。
[0018]圖10顯示了當用Th或CTL或二者過繼免疫具有腫瘤塊的小鼠時的抗腫瘤作用。用于評價的小鼠的數(shù)目是:7 (對于PBS注射組)，7 (對于D011.10單獨轉(zhuǎn)移組)，8 (對于OT-1單獨轉(zhuǎn)移組)，和8 (對于用D011.10和OT-1轉(zhuǎn)移的組)。
[0019]圖11顯示了識別每種OVII的修飾分子的D011.10細胞的增殖。
[0020]圖12顯示了當使用含有未經(jīng)熱滅活的FCS的培養(yǎng)基時，識別每種OVII的修飾分子的D011.10細胞的增殖。
[0021]圖13顯示了當使用含有熱滅活的FCS的培養(yǎng)基時，識別每種OVII的修飾分子的D011.10細胞的增殖。
[0022]圖14顯示了當使用不含卡托普利的培養(yǎng)基時，每種OVII的修飾分子對D011.10細胞的增殖。
[0023]圖15顯示了當使用含有卡托普利的培養(yǎng)基時，每種OVII的修飾分子對D011.10細胞的增殖。
[0024]圖16顯示了當使用無血清培養(yǎng)基時，每種OVII的修飾分子對D011.10細胞的增殖。
[0025]圖17顯示了每個生物素化的OVII的修飾分子對在CHl-1Ad細胞上表達的1-Ad分子的結(jié)合能力。
[0026]圖18顯示了每個生物素化的OVII的修飾分子對D011.10細胞的增殖。
[0027]圖19顯示了每個生物素化的OVII的修飾分子對D011.10細胞的增殖。
[0028]圖20顯示了每個生物素化的或非生物素化的OVII的修飾分子對DOl1.10細胞的增殖。
[0029]圖21顯示了每種OVII的修飾分子對血清肽酶的消化抗性。在a._d.中，使用小鼠血清作為血清，在e.中，使用人血清作為血清，且在f.中，使用MCC肽作為核心肽來替代OVII 肽。
[0030]圖22顯示了 OVII肽的消化實驗，其中使用含有卡托普利的緩沖液。
[0031]圖23顯示了 OVII肽的消化實驗，其中使用含有鄰菲咯啉的緩沖液。
[0032]圖24顯示了 OVII肽的消化實驗，其中使用含有苯丁抑制素的緩沖液。
[0033]圖25顯示了底物肽的消化實驗，其中使用抗原呈遞細胞的ACE活性的抑制劑。水平軸顯示了底物添加以后的溫育時間，垂直軸顯示了熒光單位。
[0034]圖26顯示了使用每種OVII的修飾分子體內(nèi)免疫接種時，⑶69陽性的D011.10細胞的比率。
[0035]圖27顯示了使用WA36的修飾分子體內(nèi)免疫接種時，IFN- Y陽性的Th細胞的比率。
[0036]圖28顯示了使用W332的修飾分子，具有HLA-DR15的人外周血單核細胞(PBMC)中的、體外W332反應性的Th細胞誘導活性。進行細胞內(nèi)IFNy染色和⑶4染色，通過流式細胞計進行分析，并顯示了 CD4陽性細胞中的細胞內(nèi)IFNy陽性細胞的比率。
[0037]圖29表明，A: PbW332bPP結(jié)合表達HLA-DR分子的CH1-DR4細胞，和B:C—F各自顯示了 5只小鼠的平均腫瘤生長曲線。在垂直軸上顯示了腫瘤的長直徑和與其垂直的最大短直徑的乘積。垂直條顯示了標準差(SD)的范圍。C:該圖顯示了 FBL3紅白血病細胞的腫瘤生長曲線，所述FBL3紅白血病細胞接種給用單獨的百日咳博德特氏菌全細胞疫苗(Wc)(其為佐劑)免疫的CBFl小鼠。D:該圖顯示了用W332肽免疫的小鼠中的FBL3腫瘤的生長曲線，所述W332肽誘導Wc和WTl腫瘤抗原特異性的Th細胞。E:該圖顯示了用Dbl26肽免疫的小鼠中的FBL3腫瘤的生長曲線，所述Dbl26肽誘導識別Wc和WTl腫瘤抗原的CTL。F:該圖顯示了用Wc和W332和Db 126免疫的小鼠中的FBL3腫瘤的生長曲線。
[0038]圖30顯示了肽與活抗原呈遞細胞上的MHC II類分子的結(jié)合活性的競爭測定。
[0039]圖31顯示了肽與活抗原呈遞細胞上的HLA-DR4分子的結(jié)合活性的競爭測定。

【具體實施方式】
[0040]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)首次發(fā)現(xiàn)，腫瘤特異性的Th細胞會識別在血管內(nèi)皮細胞的MHC II類分子上呈遞的腫瘤特異性抗原衍生的多肽并遷移至腫瘤組織。為了在生理條件下活化識別活生物體中的特定腫瘤抗原的Th細胞，需要將腫瘤特異性的抗原蛋白包含抗原呈遞細胞(APC)中并使由其消化產(chǎn)生的多肽呈遞至抗原呈遞細胞的HLA II類分子。也可能通過直接添加合成肽來繞過消化步驟并將多肽呈遞至HLA II類分子APC。但是，當將腫瘤特異性抗原衍生的多肽施用給靶標時，得到的結(jié)果提示以下可能性:所述多肽被存在于血液中或抗原呈遞細胞表面上的蛋白(肽)降解酶降解，并且不會充分地呈遞在MHC II類分子上。為了將腫瘤特異性抗原衍生的多肽有效地呈遞在抗原呈遞細胞上，本發(fā)明提供了源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC II類分子的分離的多肽(在下文中有時被稱作本發(fā)明的抗原肽)的修飾分子(有時被稱作本發(fā)明的修飾分子)。
[0041 ] 在本說明書的肽和蛋白中，根據(jù)肽標記中的常規(guī)實踐，左端是N端(氨基端)，右端是C端(羧基端)。
[0042]在本說明書中，腫瘤的例子包括:惡性實體瘤諸如腎癌、肺癌、食管癌(包括胃腸癌)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腦腫瘤、頭和頸腫瘤、肉瘤等，白血病和血液產(chǎn)生的惡性腫瘤。在這些中，可以特別地提及表達腫瘤特異性抗原的腫瘤。這些腫瘤可以是在晚期。所述腫瘤特異性抗原可以不僅包括在正常組織或正常細胞中不表達、但是在腫瘤組織或腫瘤細胞中表達的抗原，而且包括與正常組織或正常細胞的表達水平相比在腫瘤組織或腫瘤細胞中顯示出顯著高表達水平的抗原。這樣的腫瘤特異性抗原的例子包括具有誘導免疫反應(諸如抗體產(chǎn)生、細胞免疫等)的活性的蛋白(肽)。在這些中，更優(yōu)選的是這樣的腫瘤特異性抗原:通過加工和片段化從其得到被MHC II類分子識別的多肽，以誘導刺激細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的T細胞(Thl細胞)。使用具有約7-20個氨基酸、更優(yōu)選約9-17個氨基酸、進一步優(yōu)選約9-15個氨基酸的長度的多肽，作為源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC II類分子的分離多肽。由MHC II類分子加工和識別的腫瘤特異性抗原的例子包括WTl (威爾曼瘤-1)、PSA (前列腺特異性的抗原)、MAGE-3、CEA、存活素、酪氨酸酶等，優(yōu)選WT1?？商鎿Q地，由MHC II類分子識別的另一種腫瘤特異性抗原可以是源自病毒的蛋白，所述病毒在感染人(包括哺乳動物)時造成前述腫瘤。這樣的抗原表示源自與惡性腫瘤的發(fā)展密切相關的病毒集合的蛋白，例如，源自與惡性腫瘤的發(fā)展密切相關的病毒集合(諸如丙型肝炎病毒和EB病毒)的蛋白或含有其氨基酸序列的一部分的肽。所述腫瘤特異性抗原衍生的多肽可以是全長蛋白或部分肽，只要它具有作為抗原的免疫原性。具體地，可以優(yōu)選地使用在W000/06602、W000/26249、W02006/030770等中描述的那些作為這樣的腫瘤特異性抗原(在WTl的情況下)。更具體地，可以提及W332(KRYFKLSHLQMHSRKH; SEQ ID NO:1)、WA36 (PVLDFAPPGASAYGS; SEQ ID NO: 2)等作為WTl 抗原衍生的多肽?？梢詢?yōu)選地使用 PSA221-240 (GVLQGITSWGSEPCALPERP; SEQ ID NO:3)作為PSA衍生的多肽，可以優(yōu)選地使用243-258 (KKLLTQHFVQENYLEY; SEQ ID NO: 4)作為MAGE-3衍生的多肽，可以優(yōu)選地使用321-333 (LffffVNNQSLPVSP; SEQ ID NO: 5)和653-667 (YACFVSNLATGRNNS; SEQ ID NO: 6)作為 CEA衍生的多肽，可以優(yōu)選地使用 97-111(TLGEFLKLDRERAKN; SEQ ID NO: 7)作為存活素衍生的多肽，可以優(yōu)選地使用175-185(EIWRDIDFAHE; SEQ ID N O: 8)作為酪氨酸酶衍生的多肽，更具體地，可以優(yōu)選地使用在WO2005/105993 等中描述的 SEQ ID NO: 184 的氨基酸N0.789-797 (ALYGVWPLL; SEQ ID NO:9)、氨基酸 N0.111-130 (DPRRRSRNLGKVIDTFTCGL; SEQ ID NO: 10)、氨基酸 N0.161-180(SVNYATGNLPGCSFSIFLLA; SEQ ID NO: 11)作為丙型肝炎病毒肽。可以優(yōu)選地使用LMP-1159-175 (YLQQNWffTLLVDLLffLL; SEQ ID NO: 12)作為 EB 病毒肽。
[0043]本發(fā)明的修飾分子是結(jié)合MHC II類分子的分離的多肽，其被修飾成，當將本發(fā)明的抗原肽在體內(nèi)施用或在體外添加時，不會被蛋白(肽)降解酶降解或不會被蛋白(肽)降解酶容易地降解。在這里，所述肽降解酶的例子包括:血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶(ACE)、二肽基肽酶IV (DPPIV;⑶26)、氨肽酶N (⑶13)、氨肽酶P等。盡管ACE具有從肽鏈的C端釋放二肽的活性，它不可釋放由Pro-X組成的二肽。DPPIV具有從二肽釋放含有脯氨酸殘基的二肽(X-P1)的活性，所述二肽具有在肽鏈的N端的第二個位置處的脯氨酸殘基。盡管CD13具有從肽鏈的N端釋放氨基酸的活性，它不可切割X-Pro。氨基肽酶P具有從肽鏈的N端釋放氨基酸的活性并且也切割X-Pro。應用于本發(fā)明的抗原肽的修飾沒有特別限制，只要所述修飾分子對蛋白(肽)降解酶具有抗性，與抗原一起被MHC II類分子呈遞，并且MHC II類分子-本發(fā)明的修飾分子(或本發(fā)明的抗原肽)的復合物會被Th細胞的TCR識別。其例子包括:從本發(fā)明的抗原肽刪除幾個氨基酸，向本發(fā)明的抗原肽添加幾個氨基酸，在本發(fā)明的抗原肽中插入幾個氨基酸，將本發(fā)明的抗原肽的幾個氨基酸置換為其它氨基酸，和它們的組合，優(yōu)選向本發(fā)明的抗原肽添加幾個氨基酸。在這里，幾個意味著I個或多個(I個至約30個，優(yōu)選I個至約10個，更優(yōu)選幾個(I個至5個))氨基酸。
[0044]當將幾個氨基酸添加至、插入或置換本發(fā)明的抗原肽時，要添加、插入或置換的氨基酸可以是 20 種天然氨基酸(Gly、Ala、Leu、lie、Val、Arg、Lys、Glu、Gin、Asp、Asn、Cys>Met、His、Pro、Phe, Tyr, Thr, Ser、Trp)或修飾的或非天然的氨基酸(例如，生物素化的氨基酸(例如，生物素化的Lys (其中生物素與ε氨基共價地鍵合的Lys)、Ν°-生物素化的氨基酸、乙?；陌被?其中N端氨基被乙?；陌被?、2_氨基己二酸、3-氨基己二酸、β -Ala、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2，3- 二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥賴氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸等)。另外，它還可以含有天然存在的20種α -氨基酸、β -氨基酸(例如，β -Ala)、Y -氨基酸等。盡管這些氨基酸可以是疏水的或親水的，親水的氨基酸是優(yōu)選的。在這里，疏水的氨基酸是指Ile、Leu、Val、Ala、Phe、Pro、Met、Trp、Tyr和Gly,且堿性的氨基酸是指Arg、Lys和His,酸性的氨基酸是指Asp、Glu,且親水的中性氨基酸是指Asn、Gin、Ser、Thr和Cys。在這些氨基酸中，α_氨基酸可以是L形式或D形式或這些的混合物，優(yōu)選L形式。當將氨基酸添加至抗原肽時，添加的位置沒有特別限制，只要它對肽降解酶的降解和MHC II類分子呈遞的抗原具有抗性。它通常是本發(fā)明的抗原肽的N端和/或C端。
[0045]此外，要添加的幾個氨基酸(肽)可以是直鏈肽或支鏈(樹枝狀聚合物類型)肽。例如，當本發(fā)明的修飾分子含有在側(cè)鏈中具有氨基的氨基酸諸如Arg、Lys等時，支鏈可以通過結(jié)合肽的氨基和其它氨基酸或羧基而形成。另外，當本發(fā)明的修飾分子含有在側(cè)鏈中具有羧基的氨基酸諸如Glu、Asp等時，支鏈可以通過結(jié)合肽的羧基和其它氨基酸或氨基而形成。此外，當本發(fā)明的修飾分子含有Cys時，支鏈還可以經(jīng)由與其它Cys或含有其它Cys的肽的二硫鍵而形成。
[0046]可以添加至本發(fā)明的抗原肽的C端側(cè)的氨基酸是前述氨基酸，優(yōu)選由下式(I)表示的氨基酸序列:
X1-X2-X3-X4 (I)
其中
(1)Xl表示生物素化的Lys，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表示一個氨基酸或單鍵，且X4表示一個氨基酸或羧基(條件是，當X3是Ρι.ο時，那么X4表示一個氨基酸)，
(2)Xl表示一個除了生物素化的Lys以外的氨基酸或單鍵，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表不Pro,且X4表不一個氨基酸,或
(3)Xl表示一個除了生物素化的Lys以外的氨基酸或單鍵，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表示一個除了 Pro以外的氨基酸或單鍵，且X4表示β -Ala)。
[0047]在本說明書中，Xn是單鍵意味著，在Xn中基本上不存在氨基酸，并且與X(η-l)的氨基酸的不對稱碳原子鍵合的羧基和與X(n+1)的氨基酸的不對稱碳原子鍵合的氨基通過肽鍵的單鍵而連接。因此，例如，式(I)的氨基酸序列(其中Xl表示生物素化的Lys，X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示β -Ala)是由生物素化的Lys-Pro-β -Ala表示的氨基酸序列。
[0048]更優(yōu)選地，可以添加至本發(fā)明的抗原肽的C端側(cè)的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中
(1)Xl表示生物素化的Lys，X2表示一個氨基酸或單鍵，X3表示一個氨基酸或單鍵，且X4表示一個氨基酸或羧基(條件是，當X3是Ρι.ο時，那么X4表示一個氨基酸)，或
(2)Xl表示單鍵，X2表示單鍵，X3表示Pro，且X4表示一個氨基酸。
[0049]進一步優(yōu)選地，可以添加至本發(fā)明的抗原肽的C端側(cè)的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中
Xl表示生物素化的Lys, X2表示單鍵，X3表示單鍵,且X4表示Gly或羧基，
Xl表示單鍵，X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示Ala或β -Ala,或 Xl表示生物素化的Lys, X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示β -Ala等。
[0050]最優(yōu)選地 ，可以添加至本發(fā)明的抗原肽的C端側(cè)的氨基酸是由式⑴表示的氨基酸序列，其中
Xl表示生物素化的Lys, Χ2表示單鍵，Χ3表示Pro,且X4表示β -Ala。
[0051]此外，可以添加至本發(fā)明的抗原肽的N端側(cè)的氨基酸是前述氨基酸，優(yōu)選由式
(II)表示的氨基酸序列:
Y1-Y2-Y3 (II)
其中
(1)Yl表示Pro，Y2表示幾個氨基酸或單鍵，且Y3表示一個氨基酸或單鍵，或
(2)Yl表示一個除了 Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示幾個氨基酸或單鍵，且Y3表示生物素化的Lys
(條件是，不包括其中從N端計的第二個氨基酸是Pro的氨基酸序列)。
[0052]在本說明書中，Yn是單鍵意味著與上述Xn是單鍵相同的情況。
[0053]更優(yōu)選地，可以添加至本發(fā)明的抗原肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列:其中
(1)Yl表示Pro，Y2表示一個氨基酸或單鍵，且Y3表示一個氨基酸或單鍵，或
(2)Yl表示一個除了 Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示一個氨基酸或單鍵，且Y3表示生物素化的Lys
(條件是，不包括其中從N端計的第二個氨基酸是Pro的氨基酸序列)。
[0054]進一步優(yōu)選地，可以添加至本發(fā)明的抗原肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列:其中
Yl表示Pro，Y2表示Ser，Y3表示單鍵，
Yl表示氨基，Y2表示Ser,且Y3表示生物素化的Lys,或 Yl表示Pro, Y2表示Ser,且Y3表示生物素化的Lys。
[0055]最優(yōu)選地，可以添加至本發(fā)明的抗原肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中Yl表示Pro, Y2表示Ser,且Y3表示生物素化的Lys。
[0056]通過將如上所述的氨基酸序列添加至源自前述WTl抗原的抗原肽(W332、WA36)的N端和/或C端，得到本發(fā)明的修飾分子的一個實施方案。具體地，可以提及含有SEQ IDNO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 40所示的氨基酸序列的分離多肽作為本發(fā)明的修飾分子。
[0057]本發(fā)明的修飾分子的C端可以是羧基(-C00H)、羧酸酯(_C00_)、酰胺(-CONH2)和酯(-C00R)中的任一個。
[0058]作為酷中的R，使用CV6烷基諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等；C3_8環(huán)燒基諸如環(huán)戍基、環(huán)己基等；C6_12芳基諸如苯基、α -蔡基等；苯基-Cp2烷基諸如苯甲基、苯乙基等；C7_14芳烷基諸如α-萘基-Cu烷基(例如，α-萘基甲基等)等；新戊酰氧基甲基等。
[0059]當本發(fā)明的修飾分子具有在C端以外的位置處的羧基(或羧酸酯)時，可以在本發(fā)明的修飾分子中將羧基酰胺化或酯化。在該情況下，使用在C端等處的上述酯作為酯。
[0060]此外，本發(fā)明的修飾分子還包括:其中N端氨基酸殘基(例如，甲硫氨酸殘基)的氣基被保護基(例如，C^6酸基諸如CV6燒酸基(例如，甲酸基、乙酸基等)等或生物素化等)保護的分子，其中通過體內(nèi)裂解產(chǎn)生的N端谷氨酰胺殘基是焦谷氨酸的分子，其中在分子的氨基酸側(cè)鏈上的取代基(例如，-OH、-SH、氨基、咪唑基、B引哚基、胍基基等)被合適保護基(例如，CV6?；T如CV6烷?；?例如，甲?；?，乙?；?等等)保護的分子，和其中糖鏈發(fā)生鍵合的分子，或者所謂的復合多肽諸如糖肽等等。
[0061]本發(fā)明的修飾分子可以是游離形式或鹽形式。作為本發(fā)明的修飾分子的鹽，可以提及與酸或堿形成的生理上可接受的鹽，且生理上可接受的酸加成鹽是特別優(yōu)選的。這樣的鹽的例子包括與無機酸(例如，氫氯酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，與有機酸(例如，醋酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽，等。
[0062]根據(jù)已知的肽合成方法，可以生產(chǎn)本發(fā)明的修飾分子。
[0063]肽合成方法可以是例如固相合成方法和液相合成方法中的任一種。可以如下生產(chǎn)修飾分子:將能夠構成本發(fā)明的修飾分子的部分肽或氨基酸與其余部分縮合，并除去得到的產(chǎn)物可能具有的任意保護基。
[0064]在這里，根據(jù)本身已知的方法，例如，在下面⑴-(V)中指出的方法，進行縮合和保護基除去:
i)M.Bodanszky和M.A.0ndett1: Peptide Synthesis, Interscience Publishers,New York (1966)
ii)Schroeder 和 Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)
iii)Nobuo Izumiya, 等人:Peptide Gose1-no-Kiso to Jikken (Basics andexperiments of peptide synthesis), Maruzen C0.出版(1975)
iv)Haruaki Yajima和 Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (B1chemicalExperiment) I, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)
v)Haruaki Yajima,編:Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Developmentof Pharmaceuticals),第 14 卷，Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten 出版。
[0065]通過公開已知的純化方法，可以純化和分離如此得到的修飾分子。在這里，作為純化方法的例子，可以提及溶劑萃取、蒸餾、柱色譜法、液相色譜法、重結(jié)晶、它們的組合等。
[0066]當通過上述方法得到的修飾分子是游離形式時，通過公開已知的方法或以此為基礎的方法，可以將它轉(zhuǎn)化成適當?shù)柠}；相反，當以鹽的形式得到修飾分子時，通過公開已知的方法或以此為基礎的方法可以將鹽轉(zhuǎn)化成游離形式或另一種鹽。
[0067]為了合成本發(fā)明的修飾分子，可以使用用于蛋白合成的普通商購可得的樹脂。作為這樣的樹脂的例子，可以提及氯甲基樹脂、羥基甲基樹脂、二苯甲基胺樹脂、氨基甲基樹脂、4-芐氧基苯甲醇樹脂、4-甲基二苯甲基胺樹脂、PAM樹脂、4-羥基甲基甲基苯基乙酰氨基甲基樹脂、聚丙烯酰胺樹脂、4-(2’，4’ - 二甲氧基苯基-羥基甲基)苯氧基樹脂、4-(2’，4’ - 二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)苯氧基樹脂、PEG-Wang樹脂等。使用這樣的樹脂，根據(jù)各種本身已知的縮合方法，根據(jù)期望的修飾分子的序列，將具有α -氨基和適當?shù)乇Ｗo的側(cè)鏈官能團的氨基酸縮合在所述樹脂上。在反應結(jié)束時，從樹脂切離本發(fā)明的修飾分子，并同時除去各種保護基，從而得到期望的本發(fā)明的修飾分子。
[0068]就受保護的氨基酸的上述縮合而言，可以使用可用于蛋白合成的各種活化試劑，且優(yōu)選地使用碳二亞胺。使用DCC、N，N’ - 二異丙基碳二亞胺、N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺等作為碳二亞胺。就使用這些碳二亞胺的活化而言，可以將受保護的氨基酸與抑制消旋的添加劑(例如，HOBt、HOOBt) —起直接加入到樹脂中，或者可以預先將受保護的氨基酸活化為對稱的酸酐或HOBt酯或HOOBt酯，然后加入到樹脂中。
[0069]用于活化受保護的氨基酸及其與樹脂的縮合的溶劑可以適當?shù)剡x自已知可用于蛋白縮合反應的溶劑。作為有用溶劑的例子，可以提及酸酰胺類諸如N，N-二甲基甲酰胺、N, N-二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮；鹵代烴類諸如二氯甲烷和氯仿；醇類諸如三氟乙醇；亞砜類諸如二甲亞砜；胺類諸如吡啶；醚類諸如二噁烷和四氫呋喃；腈類諸如乙腈和丙腈；酯類諸如乙酸甲酯和乙酸乙酯；它們的合適混合物；等。反應溫度適當?shù)剡x自已知可用于蛋白結(jié)合反應的范圍，且通常選自約-20°C至約50°C的范圍。通常使用1.5-4倍過量的活化的氨基酸衍生物。當使用茚三酮反應的試驗揭示縮合不充分時，通過在不消除保護基的情況下重復縮合反應，可以進行充分縮合。如果即使重復反應縮合仍不充分，使用乙酸酐或乙?；溥蚩梢詫⑽捶磻陌被嵋阴；?。
[0070]用于不應當參與原料反應的官能團的保護方法和保護基，除去保護基的方法，活化參與反應的官能團的方法等，可以適當?shù)剡x自公開已知的基團或公開已知的方式。
[0071]作為原料的氨基的保護基的例子，可以使用Z、Boc、叔戊氧基羰基、異冰片基氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷氧基羰基、三氟乙酰基、鄰苯二甲?；⒓柞；?、2-硝基苯基次橫酸基、二苯基硫代勝基、Fmoc等。
[0072]通過例如烷基酯化(例如，用甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、2-金剛烷基等進行直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基酯化)、芳烷基酯化(例如，芐基酯化、4-硝基芐基酯化、4-甲氧基芐基酯化、4-氯芐基酯化、二苯甲基酯化)、苯酰基酯化、芐氧基羰基酰肼化、叔丁氧基羰基酰肼化、三苯甲基酰肼化等，可以保護羧基。
[0073]通過例如酯化或醚化，可以保護絲氨酸的羥基。作為適合于該酯化的基團的例子，使用低級烷?；T如乙?；?、芳?；T如苯甲?；?、和從碳酸衍生出的基團諸如芐氧基羰基和乙氧基羰基等。另外，作為適合于醚化的基團的例子，可以提及芐基、四氫吡喃基、叔丁基等。
[0074]作為酪氨酸的酚羥基的保護基的例子，可以使用BzIXl2-Bz1、2-硝基芐基、Br-Z、叔丁基等。
[0075]作為組氨酸咪唑的保護基的例子，使用Tos、4_甲氧基-2，3，6_三甲基苯磺?；?、DNP、節(jié)氧基甲基、Bum、Boc、Trt、Fmoc 等。
[0076]作為除去(消除)保護基的方法的例子，使用:在有催化劑(諸如Pd-黑或Pd-碳)存在下在氫氣流中的催化還原；借助于無水氟化氫、甲磺酸、三氟甲烷-磺酸、三氟乙酸或其混合物溶液進行的酸處理；借助于二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等進行的堿處理；和用鈉在液氨中的還原等。通過上述的酸處理實現(xiàn)的消除反應通常在約_20°C至約40°C的溫度進行；通過加入陽離子清除劑，例如，茴香醚、苯酚、苯甲硫醚、間甲酚、對甲酚、二甲硫醚、1，4-丁二硫醇和1，2-乙二硫醇，有效地進行酸處理。并且，通過硫代苯酚處理除去用作組氨酸的咪唑的保護基的2，4- 二硝基苯基；通過在有1，2-乙二硫醇、1，4- 丁二硫醇等存在下的酸處理，以及通過使用稀氫氧化鈉溶液、稀氨等的堿處理，進行去保護，從而除去用作色氨酸的吲哚的保護基的甲?；?br> [0077]作為通過活化原料中的羧基而得到的那些化合物的例子，使用對應的酸酐、疊氮化物、活化的酯[與醇(例如，五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲醇、對硝基苯酚、Η0ΝΒ、Ν-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、或HOBt)形成的酯]等。作為通過活化原料中的氨基而得到的那些化合物的例子，使用對應的磷酰胺。
[0078]在另一種制備修飾分子的酰胺的方法中，例如，首先將羧基端氨基酸的α-羧基酰胺化并因此進行保護，并將肽(蛋白)鏈向氨基側(cè)延伸至期望的鏈長度，此后制備僅除去了肽鏈的N端α-氨基的保護基的蛋白等和僅除去了 C端羧基的保護基的蛋白等，并在上述的混合溶劑中縮合這兩種蛋白等。關于縮合反應的細節(jié)，與上面相同的內(nèi)容適用。在純化通過縮合得到的受保護的修飾分子以后，可以通過上述方法除去所有保護基，以產(chǎn)生期望的粗制的修飾分子。通過使用各種公開已知的純化方式純化該粗制的修飾分子并冷凍干燥主要級分，可以制備期望的修飾分子的酰胺。
[0079]為了得到修飾分子的酯，可以制備期望的修飾分子的酯，例如，通過將羧基端氨基酸的α-羧基與期望的醇縮合以產(chǎn)生氨基酸酯，然后以與修飾分子的酰胺相同的方式處理所述酯。
[0080]通過例如在下述實施例中描述的方法，可以證實如此得到的修飾分子具有MHC II類分子結(jié)合能力，或者還可以使用其它已知方法。
[0081]本發(fā)明的修飾分子對蛋白(肽)降解酶的降解具有抗性，且因此，抗原呈遞細胞可以有效地呈遞修飾分子(或抗原肽)。因此，本發(fā)明也提供了一種抗腫瘤劑，其含有分離的多肽的修飾分子(本發(fā)明的修飾分子)，所述修飾分子源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC II類分子。
[0082]作為本發(fā)明的抗腫瘤劑的治療靶標的腫瘤是，表達在所述抗腫瘤劑中含有的本發(fā)明抗原肽的腫瘤。腫瘤的例子包括:惡性實體瘤諸如腎癌、肺癌、胃腸癌(包括食管癌)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腦腫瘤、頭和頸腫瘤、肉瘤等，白血病，和血液產(chǎn)生的惡性腫瘤。
[0083]作為本發(fā)明的抗腫瘤劑的施用對象的動物是，具有免疫機制的哺乳動物，即，人類和除了人類以外的哺乳動物。除了人類以外的哺乳動物的例子包括猴、牛、馬、豬、綿羊、兔、狗、貓、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等。在這些中，人類是優(yōu)選的施用對象。
[0084]含有本發(fā)明的修飾分子的抗腫瘤劑是低毒性的，且可以作為液體或藥物組合物以合適的劑型口服地、透粘膜地(滴注、噴在鼻粘膜層上、吸入氣霧劑等)、透皮地或胃腸外地(例如，血管內(nèi)施用、皮下施用、真皮內(nèi)施用等)直接施用給人。
[0085]用于施用的藥物組合物可以含有本發(fā)明的修飾分子、藥理學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑、表面活性劑等。這樣的藥物組合物被提供為適合于口服、透粘膜、透皮或胃腸外施用的劑型。此外，為了賦予持續(xù)釋放能力，可以將它吸附至或嵌入在底物中。
[0086]使用注射劑、栓劑等作為用于胃腸外施用的組合物，且所述注射劑可以包括靜脈內(nèi)注射劑、皮下注射劑、真皮內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、滴注劑等的劑型。這樣的注射劑可以根據(jù)已知方法來制備。注射劑的制備方法包括:將上述本發(fā)明的修飾分子溶解、懸浮或乳化在通常用于注射的無菌水溶液或油溶液中。作為用于注射的水溶液，使用鹽水，即含有葡萄糖、其它助劑等的等滲溶液，并且它們可以與合適的增溶劑諸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子型表面活性劑[例如，聚山梨酯80、HC0-50 (氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50 mol)加成化合物)]等聯(lián)合使用。使用芝麻油、大豆油等作為油性液體，并且苯甲酸芐酯、苯甲醇等可以聯(lián)合用作增溶劑。優(yōu)選地將制備的注射劑填充在合適的安瓿中。通過將上述修飾分子與一般栓劑基質(zhì)混合，也可以制備用于直腸施用的栓劑。
[0087]用于口服施用的組合物的例子包括固體或液體劑型，其具體地為片劑(包括糖包衣片劑、膜包衣片劑)、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑(包括軟膠囊劑)、糖漿劑、乳劑、混懸液等。這樣的組合物可以根據(jù)已知方法來制備，且可以含有在藥學領域中常用的載體、稀釋劑或賦形劑。使用乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸鎂作為用于片劑的載體和賦形劑。
[0088]方便地以適合于活性成分劑量的藥物單位劑型的方式制備上述胃腸外或口服藥物組合物。這樣的藥物單位劑型的例子包括片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑(安瓿)和栓劑。優(yōu)選地，修飾分子的含量通常是每個單位劑型1- 3 mg上述修飾分子。
[0089]盡管含有本發(fā)明修飾分子的抗腫瘤劑的劑量隨施用的對象、靶癌癥的類型、癥狀、施用途徑等而變化，例如，通過靜脈內(nèi)注射將通常約0.001 mg - 10 g本發(fā)明的修飾分子的單劑量方便地施用給成年人每天約1- 5次、優(yōu)選約1- 3次。在其它胃腸外施用和口服施用的情況下，還可以施用與此相符的量。當癥狀特別嚴重時，可以根據(jù)癥狀來增加劑量。
[0090]前述抗腫瘤劑可以含有一種或多種其它活性成分，只要它當與本發(fā)明的修飾分子摻合時不會造成非優(yōu)選的相互作用。例如，本發(fā)明的抗腫瘤劑可以與其它藥物聯(lián)合使用，例如，烷化劑(例如，環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺等)、代謝拮抗劑(例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗腫瘤抗生素(例如，絲裂霉素、阿霉素等)、植物衍生的抗腫瘤劑(例如，長春新堿、長春地辛、泰素等)、順鉬、卡鉬、依托泊苷、伊立替康等?？梢詫⒈景l(fā)明的抗腫瘤劑和上述藥物同時地或以錯開的方式施用給患者。
[0091]另外，本發(fā)明的抗腫瘤劑可以進一步含有源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC I類分子的分離多肽。當含有結(jié)合MHC I類分子的腫瘤特異性抗原衍生的多肽時，可以同時地誘導Th細胞和CTL。在這里，結(jié)合MHC I類分子的腫瘤特異性抗原可以是這樣的腫瘤特異性抗原:通過加工和片段化從其得到被MHC II類分子識別的多肽。這樣的抗原的例子包括HER-2/neu、MART-l、NY-ES0-l、Gp-100、MUC-l、p53、前列腺特異性的抗原(PSA)、hTERT、WTl、存活素、CEA、MAGE-3、從一組與惡性腫瘤發(fā)生密切相關的病毒衍生出的蛋白等。在這些中，源自與本發(fā)明的抗原肽相同的來源腫瘤的特定抗原是優(yōu)選的，且例如可以提及WTl。盡管腫瘤特異性抗原衍生的多肽可以是全長蛋白，但是它可以是部分肽，只要它具有作為抗原的免疫原性。WTl抗原衍生的多肽的具體例子包括WlO (ALLPAVPSL; SEQ ID NO: 13)、W302(RVPGVAPTL; SEQ ID NO: 14)、W292 (GVFRGIQDV; SEQ ID NO: 15)等。
[0092] 盡管本發(fā)明的分離的多肽(其源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC I類分子)的氨基酸序列的長度沒有特別限制，只要它可以被MHC I類分子呈遞即可，但是它通常是約8個至約11個氨基酸，優(yōu)選約9個氨基酸。
[0093]此外，分離的多肽(其源自腫瘤特異性的抗原且結(jié)合MHC I類分子)可以是被修飾成避免被肽降解酶降解的修飾分子，象本發(fā)明的修飾分子一樣。修飾的實施方案可以與上面提及的本發(fā)明的修飾分子的實施方案相同，并且還可以根據(jù)關于本發(fā)明的修飾分子描述的前述合成方法和分離方法進行修飾分子的合成和分離。
[0094]另外，本發(fā)明的抗腫瘤劑可以進一步含有佐劑。佐劑的例子包括百日咳疫苗、結(jié)核分枝桿菌細胞壁骨架(BCG-CWS)、非甲基化的脫氧CpG、咪喹莫特、聚-1C、LPS、肽聚糖、To 11 -樣受體配體、Fl 13、a Gal-Cer、礦物油、植物油、明礬、鋁化合物、皂粘土、二氧化硅、胞壁酰二肽衍生物、胸腺素、白介素等。作為“百日咳疫苗”，可以提及:包含甲醛處理過的或熱處理過的百日咳博德特氏菌的細胞壁級分的全細胞百日咳疫苗，包含從百日咳博德特氏菌半純化或純化的組分(例如，百日咳毒素、纖維血凝素等)的無細胞百日咳疫苗等。關于如何制備百日咳疫苗，可以使用但不限于公開已知的方法?？梢允褂冒偃湛纫呙绲氖惺郛a(chǎn)品，其可得自例如，B1 Farma ( 印度尼西亞)等。
[0095]此外，本發(fā)明的修飾分子可以用于試驗試驗對象的抗原呈遞細胞是否表達在所述修飾分子中含有的本發(fā)明抗原肽可以結(jié)合的MHC II類分子。該方法使得能夠判斷試驗對象是否可以成為含有本發(fā)明的修飾分子的本發(fā)明抗腫瘤劑的施用對象。因此，本發(fā)明也提供了一種檢查試驗對象是否具有可結(jié)合本發(fā)明抗原肽的MHC II類分子的方法，所述方法包括:培養(yǎng)源自所述試驗對象和本發(fā)明的修飾分子的抗原呈遞細胞群體，和證實所述抗原呈遞細胞群體和所述修飾分子的結(jié)合。
[0096]接受本發(fā)明的試驗方法的試驗對象包括:要成為用前述抗腫瘤劑治療的對象的腫瘤患者，和疑似具有這樣的腫瘤的那些。
[0097]用于本發(fā)明的試驗方法的抗原呈遞細胞群體沒有特別限制，只要它收集自上述試驗對象。這樣的抗原呈遞細胞群體的例子包括體液諸如全血、淋巴液、腦脊髓液等和它們的級分等。特別優(yōu)選的是血液、淋巴液等，因為它們可以快速地和方便地回收，且對試驗對象具有較低侵襲性等。盡管最優(yōu)選的抗原呈遞細胞群體是新鮮和活的細胞，可以將它與0.1-1%低聚甲醛等輕微混合。作為要用作對照的細胞群體，可以使用表達不同基因型的MHCII類分子的細胞和不表達MHC II類分子的細胞群體。
[0098]可以如下測量本發(fā)明的修飾分子是否結(jié)合抗原呈遞細胞群體:例如，混合二者，將它們培養(yǎng)幾小時至過夜，除去游離肽，進一步使熒光標記的抗生物素蛋白試劑結(jié)合生物素肽(其結(jié)合至細胞表面上的MHC II類分子)，和通過流式細胞計量術測量與細胞結(jié)合的熒光的量。
[0099]使用施加于本發(fā)明抗原肽的N端和/或C端的修飾，可以檢查施加所述修飾的任意肽是否可以結(jié)合表達特定MHC II類分子的抗原呈遞細胞。因此，本發(fā)明也提供了一種檢查肽是否可以結(jié)合抗原呈遞細胞的方法，所述方法包括:培養(yǎng)抗原呈遞細胞，所述細胞表達特定MHC II類分子和具有經(jīng)修飾的N端和/或C端的任意肽，和證實所述抗原呈遞細胞和所述肽的結(jié)合。
[0100]可以從哺乳動物(優(yōu)選人)等或建立的細胞系回收抗原呈遞細胞，只要它表達特定MHC II類分子。盡管最優(yōu)選的抗原呈遞細胞是新鮮和活的細胞，可以將它與0.1-1%低聚甲醛等輕微混合。
[0101]使用具有約7-20個氨基酸、更優(yōu)選約9-17個氨基酸、進一步優(yōu)選約9_15個氨基酸的長度的肽作為任意肽。所述肽具有經(jīng)修飾的N端和/或C端，并且要施加的修飾是上述修飾。
[0102]也就是說，可以添加至所述肽的C端側(cè)的氨基酸優(yōu)選地是由下式⑴表示的氨基酸序列:
X1-X2-X3-X4 (I)
其中
(1)Xl表示生物素化的Lys，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表示一個氨基酸或單鍵，且X4表示一個氨基酸或羧基(條件是，當X3是Ρι.ο時，那么X4表示一個氨基酸)，
(2)Xl表示一個除了生物素化的Lys以外的氨基酸或單鍵，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表不Pro,且X4表不一個氨基酸,或
(3)Xl表示一個除了生物素化的Lys以外的氨基酸或單鍵，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表示一個除了 Pro以外的氨基酸或單鍵，且X4表示β -Ala)。
[0103]更優(yōu)選地，可以添加至本發(fā)明肽的C端側(cè)的氨基酸是由式⑴表示的氨基酸序列，其中
(1)Xl表示生物素化的Lys，X2表示一個氨基酸或單鍵，X3表示一個氨基酸或單鍵，且X4表示一個氨基酸或羧基(條件是，當X3是Ρι.ο時，那么X4表示一個氨基酸)，或
(2)Xl表示單鍵，X2表示單鍵，X3表示Pro，且X4表示一個氨基酸。
[0104]進一步優(yōu)選地，可以添加至本發(fā)明肽的C端側(cè)的氨基酸是由式⑴表示的氨基酸序列，其中
Xl表示生物素化的Lys, X2表示單鍵，X3表示單鍵,且X4表示Gly或羧基，
Xl表示單鍵，X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示Ala或β -Ala,或 Xl表示生物素化的Lys, X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示β -Ala等。
[0105]最優(yōu)選地，可以添加至本發(fā)明肽的C端側(cè)的氨基酸是由式⑴表示的氨基酸序列，其中
Xl表示生物素化的Lys, Χ2表示單鍵，Χ3表示Pro,且X4表示β -Ala。
[0106]此外，可以添加至所述肽的N端側(cè)的氨基酸是前述氨基酸，優(yōu)選由式(II)表示的氨基酸序列:
Y1-Y2-Y3 (II)
其中
(1)Yl表示Pro，Y2表示幾個氨基酸或單鍵，且Y3表示一個氨基酸或單鍵，或
(2)Yl表示一個除了 Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示幾個氨基酸或單鍵，且Y3表示生物素化的Lys
(條件是，不包括其中從N端計的第二個氨基酸是Pro的氨基酸序列)。
[0107]更優(yōu)選地，可以添加至所述肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列:其中
(1)Yl表示Pro，Y2表示一個氨基酸或單鍵，且Y3表示一個氨基酸或單鍵，或
(2)Yl表示一個除了 Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示一個氨基酸或單鍵，且Y3表示生物素化的Lys
(條件是，不包括其中從N端計的第二個氨基酸是Pro的氨基酸序列)。
[0108]進一步優(yōu)選地，可以添加至所述肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列:其中
Yl表示Pro，Y2表示Ser，Y3表示單鍵，
Yl表不一個氨基，Y2表不Ser,且Y3表不生物素化的Lys,或 Yl表示Pro, Y2表示Ser,且Y3表示生物素化的Lys。
[0109]最優(yōu)選地，可以添加至所述肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中Yl表示Pro，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys。
[0110]抗原呈遞細胞和任意修飾肽的接觸方法和培養(yǎng)方法可以遵循在前述試驗方法中描述的方法。也就是說，將本發(fā)明中的修飾施加于任意肽以賦予對消化酶的抗性和生物素修飾，所述肽作為指示肽結(jié)合至抗原呈遞細胞，例如，熒光標記的鏈霉親和素與其結(jié)合，并可以定量所述指示肽的結(jié)合量。此外，將具有消化抗性、但是沒有生物素修飾的修飾肽加入到該結(jié)合測量系統(tǒng)中，以觀察指示肽的結(jié)合的競爭性抑制，由此可以定量任意氨基酸序列的修飾肽對MHC II類分子的結(jié)合活性進行對比。
[0111]在本說明書中，在通過它們的代碼來表示堿基、氨基酸等的情況下，它們是基于根據(jù) IUPAC-1UB 生化命名委員會(Commiss1n on B1chemical Nomenclature)的常規(guī)代碼，或按照本領域中的普通代碼，其例子顯示在下面。對于可能具有光學異構體的氨基酸，呈現(xiàn)L形式，除非另外指出。
[0112]DNA:脫氧核糖核酸 cDNA: 互補的脫氧核糖核酸 A: 腺嘌呤
T:胸腺嘧啶
G:鳥嘌呤
C:胞嘧啶
RNA:核糖核酸
mRNA: 信使核糖核酸 dATP: 脫氧腺苷三磷酸 dTTP: 脫氧胸苷三磷酸 dGTP: 脫氧鳥苷三磷酸 dCTP: 脫氧胞苷三磷酸 ATP:腺苷三磷酸
EDTA: 乙二胺四乙酸 SDS:十二烷基硫酸鈉
Gly:甘氨酸
Ala:丙氨酸
Val:纈氨酸
Leu:亮氨酸
He:異亮氨酸Ser:絲氨酸
Thr:蘇氨酸
Cys:半胱氨酸
Met:甲硫氨酸 Glu: 谷氨酸
Asp:天冬氨酸 Lys: 賴氨酸
Arg:精氨酸 His: 組氨酸 Phe: 苯丙氨酸 Tyr: 酪氨酸 Trp: 色氨酸 Pro: 脯氨酸
Asn:天冬酰胺 Gln: 谷氨酰胺
pGlu:焦谷氨酸 See: 硒代半胱氨酸
β -Ala:β _丙氛酸。
實施例
[0113]在下面通過對實施例和參考實施例的參照來更詳細地解釋本發(fā)明，所述實施例不應解釋為限制性的。
[0114](細胞和小鼠)
使用由H.N.Eisen博士提供的EL4和E.G7-0VA (EG7)(已經(jīng)通過將OVA基因引入EL4中使其表達OVA蛋白)作為腫瘤細胞。使用D011.10細胞，其為⑶4 T細胞克隆，源自D011.10 TCR 轉(zhuǎn)基因小鼠(D011.1Otg) (Murphy, K.等人，Science 250: 1720-1723，1990)。將D011.10細胞每周刺激I次，并與溫育的BALB/c衍生的脾細胞一起在含有2%大鼠ConA上清液(RCS)的10%FCS DMEM中培養(yǎng)，所述脾細胞用輻射和0.75 μ M OVAII肽(ISQAVHAAHAEINEAGR)處理過。另外，由Nakano博士分配AND TCRtg，其識別與1-Ak結(jié)合的MCC肽。CHl細胞購自ATCC，并維持在10%FCS-1scove氏MDM (IMDM)中。使用pMX(由Kitamura博士分配)作為表達載體，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導來制備CHl-1Ad和CHl-1Ab細胞。將這些都以該串聯(lián)次序插入1-Ae和1-Aa鏈的cDNA中，IRES序列位于它們之間。F-2早(F2)細胞(作為CBFl小鼠衍生的UV轉(zhuǎn)化的細胞系)購自Riken B1Resource Center(Tsukuba)。以與上述CHl-1Ad細胞相同的方式建立F2_IAd細胞。
[0115](肽)
OVII (ISQAVHAAHAEINEA; SEQ ID NO: 17)是從已經(jīng)報告的卵白蛋白衍生的1-Ad結(jié)合表位 OVAII 323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR; SEQ ID NO: 16) (Shimonkevitz, R.等人，J Immunol 133: 2067-2074, 1984)中抽取第323個至第337個氨基酸序列得到的肽。MCC(NERADLIAYLKQATK; SEQ ID NO: 42)是細胞色素C肽的1-Ak-結(jié)合部分的第89個至第103個氛基酸序列(Buus, S.等人，Science 235: 1353-1358, 1987)。根據(jù)Fmoc方法手工地合成所述肽，并使用C18柱通過反相HPLC純化至不小于95%的純度。使用BSA作為標準品，通過 MicroBCA 測定(Pierce, Rockford, IL)確定肽濃度。使用 Fmoc-Lys (B1t)-OH,合成生物素化的肽。合成的肽顯示在表1中。
[0116]表 I

【權利要求】
1.分離的多肽的修飾分子，其源自腫瘤特異性的抗原且結(jié)合MHCII類分子。
2.根據(jù)權利要求1所述的修飾分子，其中所述修飾是將幾個氨基酸添加至分離的多肽的C端側(cè)和/或N端側(cè)。
3.根據(jù)權利要求2所述的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的C端側(cè)的氨基酸是由下式(I)表示的氨基酸序列:
X1-X2-X3-X4 (I) 其中 (1) Xl表示生物素化的Lys，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表示一個氨基酸或單鍵，且X4表示一個氨基酸或羧基(條件是，當X3是Ρι.ο時，那么X4表示一個氨基酸)， (2)Xl表示一個除了生物素化的Lys以外的氨基酸或單鍵，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表不Pro,且X4表不一個氨基酸,或 (3)Xl表示一個除了生物素化的Lys以外的氨基酸或單鍵，X2表示幾個氨基酸或單鍵，X3表示一個除了 Pro以外的氨基酸或單鍵，且X4表示β -Ala)。
4.根據(jù)權利要求3所述的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的C端側(cè)的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中 (1)Xl表示生物素化的Lys，X2表示一個氨基酸或單鍵，X3表示一個氨基酸或單鍵，且X4表示一個氨基酸或羧基(條件是，當X3是Ρι.ο時，那么X4表示一個氨基酸)，或 (2)Xl表示單鍵，X2表示單鍵，X3表示Pro，且X4表示一個氨基酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的C端側(cè)的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中 Xl表示生物素化的Lys, X2表示單鍵，X3表示單鍵,且X4表示Gly或羧基， Xl表示單鍵，X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示Ala或β -Ala,或 Xl表示生物素化的Lys, X2表示單鍵，X3表示Pro,且X4表示β -Ala。
6.根據(jù)權利要求2-5中的任一項所述的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的N端側(cè)的氨基酸是由下式(II)表示的氨基酸序列:
Y1-Y2-Y3 (II) 其中 (1)Yl表示Pro，Y2表示幾個氨基酸或單鍵，且Y3表示一個氨基酸或單鍵，或 (2)Yl表示一個除了 Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示幾個氨基酸或單鍵，且Y3表示生物素化的Lys (條件是，不包括其中從N端計的第二個氨基酸是Pro的氨基酸序列)。
7.根據(jù)權利要求6所述的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中 (1)Yl表示Pro，Y2表示一個氨基酸或單鍵，且Y3表示一個氨基酸或單鍵，或 (2)Yl表示一個除了 Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示一個氨基酸或單鍵，且Y3表示生物素化的Lys (條件是，不包括其中從N端計的第二個氨基酸是Pro的氨基酸序列)。
8.根據(jù)權利要求7所述的修飾分子，其中要添加至分離的多肽的N端側(cè)的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中Y1表示Pro，Y2表示Ser，Y3表示單鍵， Y1表示氨基，Υ2表示Ser,且Υ3表示生物素化的Lys,或 Y1表示Pro, Y2表示Ser,且Y3表示生物素化的Lys。
9.根據(jù)權利要求1-8中的任一項所述的修飾分子，其中所述分離的多肽包含源自WT1、PSA、MAGE-3、存活素、CEA、酪氨酸酶、丙型肝炎病毒或EB病毒的氨基酸序列，且結(jié)合MHC II類分子。
10.根據(jù)權利要求9所述的修飾分子，其中所述分離的多肽包含源自WTl的氨基酸序列且結(jié)合MHC II類分子。
11.分離的多肽,其包含由SEQID NO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 40顯示的氨基酸序列。
12.抗腫瘤劑，其包含根據(jù)權利要求1-10中的任一項所述的修飾分子或根據(jù)權利要求11所述的分離的多肽。
13.根據(jù)權利要求12所述的抗腫瘤劑，所述抗腫瘤劑還包含源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC I類分子的分離多肽。
14.根據(jù)權利要求12或13所述的抗腫瘤劑，所述抗腫瘤劑還包含佐劑。
15.根據(jù)權利要求14所述的抗腫瘤劑，其中所述佐劑是百日咳疫苗。
16.治療腫瘤的方法，所述方法包括:給患者施用有效量的根據(jù)權利要求12-15中的任一項所述的抗腫瘤劑。
17.用于治療腫瘤的組合物，其包含根據(jù)權利要求1-10中的任一項所述的修飾分子或根據(jù)權利要求11所述的分離的多肽、源自腫瘤特異性抗原且結(jié)合MHC I類分子的分離多肽、和佐劑。
18.根據(jù)權利要求1-10中的任一項所述的修飾分子或根據(jù)權利要求11所述的分離的多肽在生產(chǎn)抗腫瘤劑中的用途。
19.檢查試驗對象是否具有結(jié)合在修飾分子中所含的分離多肽的MHCII類分子的方法，所述方法包括:培養(yǎng)從試驗對象衍生出的抗原呈遞細胞群體和根據(jù)權利要求1-10中的任一項所述的修飾分子，和證實所述抗原呈遞細胞群體和所述修飾分子的結(jié)合。
20.檢查肽是否可以結(jié)合抗原呈遞細胞的方法，所述方法包括:培養(yǎng)抗原呈遞細胞，所述細胞表達特定MHC II類分子和具有經(jīng)修飾的N端和/或C端的任意肽，和證實所述抗原呈遞細胞和所述肽的結(jié)合。
【文檔編號】A61K39/12GK104136609SQ201280061671
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權日:2011年12月14日
【發(fā)明者】宇高惠子 申請人:國立大學法人高知大學