利用針對(duì)確定抗原產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫應(yīng)答的重組酵母進(jìn)行的接種的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及用來針對(duì)確定抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的重組乳酸克魯維酵母、制備這些酵母、以及將其用于針對(duì)含有這些抗原的病原體和惡性細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防接種。DSM2540720111129DSM2540520111129DSM2540620111129【專利說明】利用針對(duì)確定抗原產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫應(yīng)答的重組酵母進(jìn)行的接種發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及用來針對(duì)確定抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的重組酵母、制備這些酵母、以及將其用于針對(duì)含有這些抗原的病原體和惡性細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防接種。[0002]技術(shù)現(xiàn)狀[0003]疫苗被用來預(yù)防疾?。A(yù)防性疫苗）或者治療已患上的疾?。庖咧委熜砸呙纾?。預(yù)防接種計(jì)劃已在過去大約100年中為減少傳染病作出了很大貢獻(xiàn)。自從大約20年以來才開發(fā)使用免疫治療性疫苗，用于治療病毒、細(xì)菌或寄生蟲引起的持續(xù)感染，或者治療致癌疾病。接種的目的是針對(duì)病原體或者惡性（腫瘤基因）細(xì)胞誘導(dǎo)（基本上是T和NK細(xì)胞介導(dǎo)的）細(xì)胞免疫應(yīng)答和/或者（基本上是B細(xì)胞/抗體介導(dǎo)的）體液免疫應(yīng)答。[0004]傳統(tǒng)疫苗均含有弱毒或者滅活形式的完整病原體，包括其基因物質(zhì)、DNA或者RNA形式的核酸。制備這些傳統(tǒng)疫苗大多需要特殊安全措施和/或者使用試驗(yàn)動(dòng)物和/或者使用細(xì)胞培養(yǎng)物；通常還必須使用冷鏈進(jìn)行存放和運(yùn)輸，很麻煩。此外還有制備過程中（例如源自試驗(yàn)動(dòng)物或者細(xì)胞培養(yǎng)物）的物質(zhì)在接種個(gè)體中產(chǎn)生副作用或者引起病原體意外復(fù)活的潛藏危險(xiǎn)。即使診斷方面也存在問題：例如對(duì)家畜進(jìn)行接種時(shí)，可能無法將接種后的動(dòng)物與自然感染的動(dòng)物區(qū)別開來，使得基于新感染檢測(cè)的預(yù)警系統(tǒng)可能會(huì)失靈。因此開發(fā)了僅含有病原體部分結(jié)構(gòu)的"亞單位"疫苗，前提條件是已經(jīng)知道相應(yīng)病原體的"主要抗原"。主要抗原大多是免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別的病原體表面成分，例如病毒包膜或者病毒衣殼的蛋白，這些也能在不存在完整病毒顆粒的情況下誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或者細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且能在宿主中誘導(dǎo)對(duì)病毒的免疫記憶。由于"亞單位接種"缺少病原體的典型成分，因此可以通過鑒別診斷區(qū)分接種個(gè)體與自然感染的個(gè)體；因此所討論的也是"亞單位標(biāo)記疫苗"。許多亞單位疫苗的缺點(diǎn)是制備復(fù)雜，而且免疫原性經(jīng)常不充分：可以高效培育病原體本身（有以上所述的限制），必須采用基因技術(shù)，以成本高昂而且大多效率低下的方法制備其主要抗原，并且必須以很大的花費(fèi)將其凈化。所獲得的亞單位疫苗很敏感，同樣必須進(jìn)行冷藏運(yùn)輸，穩(wěn)定性很小。鑒于這些原因，大多數(shù)疫苗均基于包含完整病原體的傳統(tǒng)原理。例如，防治傳染性家禽法氏囊?。↖BD)的大多數(shù)疫苗目前多數(shù)基于引起IBD的傳染性法氏囊病病毒（IBDV)的弱毒或者滅活病毒。[0005]人們嘗試使用佐劑來彌補(bǔ)亞單元疫苗的免疫原性較弱的問題。佐劑是經(jīng)驗(yàn)證明有免疫刺激作用的物質(zhì)，能夠以非特異性而且經(jīng)常很少令人理解的方式增強(qiáng)免疫反應(yīng)。迄今為止僅僅批準(zhǔn)了很少供人使用的佐劑，例如在美國(guó)獲準(zhǔn)用于人的佐劑是鋁鹽、氫氧化鋁和磷酸鋁。然而鋁鹽配方會(huì)引起相關(guān)疫苗的儲(chǔ)存困難。此外這些佐劑無法與所有抗原一起發(fā)揮充分的作用。[0006]可以采用基因技術(shù)在不同的宿主細(xì)胞中制備外源蛋白，大多數(shù)亞單元疫苗均屬于外源蛋白。除了腸內(nèi)細(xì)菌大腸桿菌之外，還將可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和各種真菌確立為宿主體系?？梢杂锰貏e低廉的成本大規(guī)模培育細(xì)菌和真菌之類的微生物體系。數(shù)十年以來已經(jīng)按常規(guī)將酵母、畢赤酵母和克魯維酵母菌屬的酵母細(xì)胞用來表達(dá)外源蛋白。與細(xì)菌相比，酵母細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是真核生物，也就是在很多方面等同于動(dòng)物細(xì)胞，并且能夠以天然或者近似天然的形式，以低廉成本在酵母中制備真核生物蛋白，也就是在動(dòng)物細(xì)胞中形成并且/或者必須能夠起作用的蛋白（Bathurst，1994;Gellissen&Hollenberg，1997)。以往僅僅將酵母用于生產(chǎn)外源蛋白，并且從酵母細(xì)胞中提純蛋白，將其用作亞單位疫苗。近期以來才嘗試將酵母本身或者將酵母的細(xì)胞碎片作為疫苗。[0007]自從大約5年以來嘗試將釀酒酵母（"面包酵母"，S.cervisiae)本身用于接種疫苗：試驗(yàn)結(jié)果表明，可以通過皮下給藥的釀酒酵母的抗原表達(dá)細(xì)胞激活樹突狀細(xì)胞，并且可以產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)某些抗原的應(yīng)答。已證實(shí)這種細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有防護(hù)作用，也就是進(jìn)行疫苗接種之后，在接種后的動(dòng)物中產(chǎn)生的腫瘤少于對(duì)照動(dòng)物。目前也在腫瘤疾病的免疫治療應(yīng)用中測(cè)試該方法（Stubbsetal.,2001;Luetal.,2004)。[0008]對(duì)基于酵母的疫苗接種進(jìn)行描述的現(xiàn)有技術(shù)所公開的以下資料均為專業(yè)人士熟悉：[0009]例如20090304741、5830463、10738646和20070166323這一系列美國(guó)專利均描述了使用含有至少一種重組抗原的釀酒酵母進(jìn)行免疫治療。已證明這些酵母能有效刺激免疫反應(yīng)，尤其是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。[0010]W0/2006/044923公開了重組表達(dá)丙型肝炎病毒（HCV)的不同蛋白的酵母（釀酒酵母），所述酵母能夠引起對(duì)這些HCV蛋白的免疫應(yīng)答，主要是T細(xì)胞應(yīng)答，并且應(yīng)將其用來作為治療慢性丙型肝炎的疫苗。[0011]W0/2007/092792描述了使用重組釀酒酵母治療流感病毒感染，使用不同酵母菌株的組合，給服這些酵母菌株可引起T細(xì)胞誘導(dǎo)，也就是可引起細(xì)胞免疫應(yīng)答。[0012]W0/2011/032119涉及了對(duì)基于酵母的患者免疫治療的療效加以改進(jìn)的方法。該方法包括一種基于酵母的藥劑，該藥劑能調(diào)控CD4+TH17細(xì)胞的生產(chǎn)或者存活。[0013]沒有哪一個(gè)專利中證明可使用酵母誘導(dǎo)對(duì)傳染病或腫瘤的保護(hù)性體液免疫應(yīng)答(本申請(qǐng)書的主題）。此外要么使用了釀酒酵母，或者使用了巴斯德畢赤酵母，但是沒有使用乳酸克魯維酵母（本申請(qǐng)書的主題）。[0014]與釀酒酵母一樣，乳酸克魯維酵母（K.Iactis)也具有GRASStatus(GRAS:generallyregardedassafe/公認(rèn)為安全），也就是適合用于動(dòng)物或者人（vanOoyenetal.2006)。盡管形貌非常類似于面包酵母，這兩個(gè)菌種早在一億多年之前就從共同的祖先朝向不同的方向進(jìn)化。因此乳酸克魯維酵母的很多特性有別于釀酒酵母。其中幾個(gè)區(qū)別對(duì)于生物技術(shù)應(yīng)用有很大意義。釀酒酵母的進(jìn)化產(chǎn)生了專門進(jìn)行酒精發(fā)酵的新陳代謝，因此喪失了祖先的很多基因。但是酒精發(fā)酵對(duì)于大多數(shù)酵母來說并不典型。如果存在氧并且線粒體呼吸真正允許以更多效率從糖轉(zhuǎn)化輸出能量，那么當(dāng)葡萄糖濃度很高時(shí)就會(huì)在釀酒酵母中進(jìn)行酒精發(fā)酵。可通過"葡萄糖抑制"在很大程度上抑制細(xì)胞"發(fā)電站"線粒體的功能。乳酸克魯維酵母在線粒體的功能調(diào)節(jié)方面明顯有別于釀酒酵母（ChenandClark-Walker,1995,Clark-Walker，2007)。與釀酒酵母相比，乳酸克魯維酵母屬于"Crabtree陰性"酵母。此類酵母在嚴(yán)格有氧條件下通常不會(huì)形成乙醇，而是通過線粒體活性將葡萄糖完全降解成CO2并且形成ATP。該生理學(xué)特性十分重要，因?yàn)榭稍诖笠?guī)模發(fā)酵時(shí)顯著提高生物質(zhì)收率，使用這些酵母作為重組蛋白的生產(chǎn)菌能顯著降低成本。此外對(duì)乳酸克魯維酵母的研究已證明，己糖激酶介導(dǎo)的葡萄糖信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的突變能夠改善異源基因表達(dá)（Donninietal.，2004)。呼吸基因的葡萄糖抑制作用降低是"Crabtree陰性"酵母的特征，并且可能與此類酵母中觀察到的更好外源基因表達(dá)有關(guān)聯(lián)。[0015]乳酸克魯維酵母和釀酒酵母還在細(xì)胞壁葡聚糖成分中有很大差異（Backhausetal.，2011);懷疑這些差異的原因是高爾基體中參與糖蛋白成熟的糖基轉(zhuǎn)移酶不同：釀酒酵母中的糖蛋白含有多得多的磷酸甘露糖，乳酸克魯維酵母中的糖蛋白則主要含有終端N-乙酰葡萄糖胺（RaschkeandBallou,1972)。認(rèn)為釀酒酵母和乳酸克魯維酵母之間的這些區(qū)別在蛋白糖基化和分泌時(shí)以及在細(xì)胞壁生物合成過程中對(duì)于異源表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位、折疊、穩(wěn)定性以及免疫原性有很大的影響（Uccellettietal.，2004)。[0016]W0/2010/054649描述了乳酸克魯維酵母的一種重組體系的制備。在所述的應(yīng)用示例中使用從菌株VAK367-D4得到的重組菌株針對(duì)各種不同的抗原進(jìn)行粘膜或者口服疫苗接種。但是口服/粘膜疫苗接種的缺點(diǎn)在于，必須使用大量的疫苗才能實(shí)現(xiàn)保護(hù)性免疫?！緦＠綀D】【附圖說明】[0017]附圖1所示為通過同源重組為出發(fā)菌株VAK367-D4制備具有外源基因IBDVVP2的疫苗株VAK887的示意圖。轉(zhuǎn)化含有IBDV菌株D78的VP2基因的質(zhì)粒Klp3-MCS(SEQIDNo.:10)，通過同源重組將VP2外源基因插入染色體的LAC4基因位點(diǎn)之中，該基因位點(diǎn)已由于插入U(xiǎn)RA3基因而被破壞。重組為宿主基因組時(shí)將URA3基因替換成VP2基因，并且重新制備LAC4基因；選擇不含尿嘧啶的乳糖培養(yǎng)基，即可獲得重組酵母菌株。隨后通過KIGAL80啟動(dòng)子控制LAC4(β-半乳糖苷酶）的表達(dá)，通過LAC4啟動(dòng)子控制VP2基因的表達(dá)。[0018]附圖2Α所示為通過菌株VAK887表達(dá)IBDVVP2,使用VP2特異性抗體進(jìn)行Western印跡分析，與源菌株（VAK367)對(duì)照，并且與感染了IBDV的雞細(xì)胞對(duì)照。附圖2B所示為重組IBDVVP2以及突變IBDVVP2-T2S在不同的表達(dá)VP2的乳酸克魯維酵母變異體中的表達(dá)分析。原始乳酸克魯維酵母變異體VP2(VAK887)僅僅表達(dá)了適量的病毒蛋白。將VP2的氨基酸位置2上的蘇氨酸替換成絲氨酸，可以在乳酸克魯維酵母菌株VP2-T2S(VAK888)中提高VP2蛋白表達(dá)?？梢赃M(jìn)一步提高的方式的增加KIGAIA基因計(jì)量（VP2-T2S_GAL4=VAK890)，或者使用酵母密碼子優(yōu)化的合成VP2基因（〇VP2-T2S=VAK910)。[0019]附圖3證明在90°C溫度下對(duì)本發(fā)明所述的酵母進(jìn)行2小時(shí)熱滅活沒有導(dǎo)致重組的VP2-T2S蛋白喪失（附圖3A)。在SDSPAGE上從顆粒飼料中未滅活的酵母、滅活酵母以及酵母中各自分離等量的蛋白，與感染和沒有感染IBDV的家禽細(xì)胞中的細(xì)胞裂解液進(jìn)行對(duì)照，在Western印跡中使用抗-VP2-抗體進(jìn)行測(cè)試。附圖3還證明變異體VAK890中VP2-T2S的量約為每個(gè)酵母細(xì)胞〇.7fg異源蛋白（附圖3B)。這里在Western印跡中對(duì)定量的凈化VP2-T2S進(jìn)行了著色，與所抽取的乳酸克魯維酵母（菌株VAK890)的發(fā)酵罐中一定數(shù)量細(xì)胞中的VP2進(jìn)行對(duì)照，使用密度計(jì)分析結(jié)果。[0020]附圖4對(duì)照使用乳酸克魯維酵母變異體VAK890的完整酵母細(xì)胞進(jìn)行口服接種，解釋以皮下給藥方式使用乳酸克魯維酵母變異體VAK890的完整熱滅活酵母細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行接種。附圖4A所示為免疫方案：進(jìn)行了三次皮下免疫，各休息兩周；兩次飼喂兩周進(jìn)行對(duì)照。最后一次給服酵母之后兩周（箭頭）從經(jīng)過治療的小鼠體內(nèi)抽取血清樣品，在IBDV特異性ELISA(附圖4B)和IBDV中和試驗(yàn)中檢出存在抗VP2抗體（附圖4C)。附圖4D使用表達(dá)VP2的乳酸克魯維酵母（菌株KlVP2-T2S_GAL4(VAK890))治療過的小鼠與使用野生型乳酸克魯維酵母（菌株VAK367)治療后的小鼠相比具有更高的抗體/中和抗體滴定量。此外還證明了皮下給服的乳酸克魯維酵母（菌株VAK890)與使用乳酸克魯維酵母（菌株VAK890)飼喂的小鼠相比具有明顯更高的抗體/中和抗體滴定量。但是口服乳酸克魯維酵母（菌株890)免疫的小鼠與使用野生型乳酸克魯維酵母（菌株VAK367)相比也增大了抗體/中和抗體滴定量。[0021]附圖5所示為使用乳酸克魯維酵母變異體VP2-T2S_GAL4(VAK890)的熱滅活完整酵母細(xì)胞對(duì)雞進(jìn)行口服和皮下疫苗接種。要么使用短時(shí)間1/1/1/1/1方案（1周飼喂，1周休息，1周飼喂，以此類推）或者使用較長(zhǎng)的2/2/2方案進(jìn)行口服疫苗接種（附圖5A)。疫苗接種之后1周或者2周休息之后，使用IBDV(菌株Edgar)以每個(gè)動(dòng)物100EID50的濃度感染所有經(jīng)過治療的動(dòng)物（病毒challenge;黑色條柱）。在口服疫苗接種之后，尤其在應(yīng)用延長(zhǎng)的治療方案之后，可以在多個(gè)動(dòng)物中檢測(cè)出病毒中和抗體的滴定量增大。而使用重組乳酸克魯維酵母進(jìn)行皮下疫苗接種則相反，在所有經(jīng)過治療的動(dòng)物中產(chǎn)生了較高的病毒中和抗體滴定量（附圖5B、C;IBDV特異性ELISA，IBDV中和試驗(yàn)）。沒有使用重組乳酸克魯維酵母治療后的動(dòng)物在感染IBDV之后死亡，無論使用了哪一種治療方案。與此相比，對(duì)照組中的死亡率為10?35%(附圖5C)。對(duì)經(jīng)過治療后的動(dòng)物的法氏囊中的病變進(jìn)行分析，結(jié)果證明在應(yīng)用延長(zhǎng)的治療方案之后，大約10%口服治療的動(dòng)物在接種IBDV之后沒有病毒感染征兆：使用了所謂的"病變?cè)u(píng)分得分1、2感染或者幾乎沒有感染受損的法氏囊；得分3、4感染受損的法氏囊和嚴(yán)重受損的法氏囊。與此相比，皮下給服重組乳酸克魯維酵母菌株VAK890的所有動(dòng)物均表現(xiàn)出完全的IBDV疫苗免疫保護(hù)（附圖5C)。[0022]附圖6所示為載體Klp3-MCS(SEQIDNo.:10)的結(jié)構(gòu)示意圖。[0023]本發(fā)明的說明：[0024]專用人士均熟悉現(xiàn)有技術(shù)將重組酵母用于皮下疫苗接種的方法：Stubbsetal.,(2001)Nat.Med.7:625-629；StubbsandWiIson(2002)Curr.Opin.Mol.Ther.4：35-40；ffansleyetal.,(2008)Clin.CancerRes.14:4316-4325；US5,830,463,W0/2006/044923;W0/2007/092792undW0/2011/032119。但是在這些出版文獻(xiàn)的實(shí)施例中所研究的僅僅是釀酒酵母。"酵母"是呈單細(xì)胞生長(zhǎng)的真核微生物的總稱，經(jīng)過數(shù)百萬年的差異進(jìn)化，目前具有極為不同的特性（釀酒酵母和乳酸克魯維酵母大約進(jìn)化了一億年）。如果使用釀酒酵母和乳酸克魯維酵母對(duì)諸如動(dòng)物或者人之類的高等真核生物進(jìn)行疫苗接種，則應(yīng)以這樣的認(rèn)識(shí)為出發(fā)點(diǎn)：釀酒酵母引發(fā)的免疫應(yīng)答與乳酸克魯維酵母引發(fā)的免疫應(yīng)答有很大區(qū)別。這不僅適用于對(duì)酵母中表達(dá)的外源抗原的免疫應(yīng)答，而且也適用于對(duì)酵母自身抗原的免疫應(yīng)答。如果使用完整的釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行皮下免疫，就會(huì)產(chǎn)生T細(xì)胞誘導(dǎo)，也就是細(xì)胞免疫應(yīng)答。迄今為止現(xiàn)有技術(shù)并未證明使用重組釀酒酵母以簡(jiǎn)單途徑（也就是直接施用表達(dá)單個(gè)抗原的菌株）實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的防護(hù)性體液免疫應(yīng)答。[0025]以上述背景為出發(fā)點(diǎn)，本發(fā)明的任務(wù)在于提供一種能夠用來針對(duì)某些抗原產(chǎn)生防護(hù)性體液免疫應(yīng)答的方法。另一任務(wù)在于提供一種能夠用來區(qū)別接種個(gè)體與自然感染個(gè)體的亞單位標(biāo)記疫苗。另一任務(wù)在于制備一種同時(shí)具有很強(qiáng)佐劑特性并且因此而具有很強(qiáng)免疫原性的亞單位標(biāo)記疫苗。[0026]制備一種基于酵母并且允許將外源基因靶向整合到酵母基因組之中的表達(dá)體系，即可解決這些任務(wù)?？梢岳迷擉w系快速（也就是在幾周之內(nèi)）制備表達(dá)外源基因的重組酵母?？梢栽诎l(fā)酵罐中以低廉成本大量（例如千克范圍（kg))繁殖這些酵母。采用調(diào)控表達(dá)和補(bǔ)料分批法進(jìn)行發(fā)酵，也可以表達(dá)該酵母體系中的細(xì)胞毒性抗原。在表達(dá)外源基因之后對(duì)酵母進(jìn)行熱滅活，然后可以作為粉末進(jìn)行儲(chǔ)運(yùn)，無需進(jìn)行冷卻。可以直接使用酵母粉末，也就是不需要繼續(xù)分級(jí)，要么作為乳化液或者丸劑（參見實(shí)施例），或者作為亞單位標(biāo)記疫苗。通過以下兩個(gè)因素保證抗原表達(dá)以及有效防護(hù)性免疫所需的佐劑效應(yīng)：（i)可以對(duì)所表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行靶向基因改造，（ii)表達(dá)酵母中的外源蛋白，并且以口服或者皮下形式直接使用酵母；酵母本身具有很強(qiáng)的佐劑效應(yīng)。首選皮下給藥。已制備一種重組酵母菌株；該酵母菌株表達(dá)一種特異性病毒抗原，并且可以將其用于本發(fā)明所述的皮下疫苗接種方法之中。已實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)病毒感染的完全預(yù)防性防護(hù)作用。僅僅使用了非常少量的酵母（若為家禽中的皮下給藥，則在毫克范圍內(nèi)（mg))。僅需2?3次給藥，就能實(shí)現(xiàn)該防護(hù)作用。[0027]本發(fā)明所述的方法不僅適用于人類醫(yī)療領(lǐng)域，而且也適用于獸醫(yī)領(lǐng)域。首選將本發(fā)明所述的方法應(yīng)用于獸醫(yī)領(lǐng)域。[0028]利用酵母執(zhí)行本發(fā)明所述的方法。適用的酵母例如是酵母菌屬、畢赤酵母菌屬和克魯維酵母菌屬的酵母。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用酵母菌屬和克魯維酵母菌屬的酵母執(zhí)行本發(fā)明所述的方法。尤其優(yōu)先使用釀酒酵母和乳酸克魯維酵母（K.Iactis)。在最優(yōu)先的實(shí)施方式中，使用乳酸克魯維酵母執(zhí)行本發(fā)明所述的方法。[0029]乳酸克魯維酵母屬于具有GRASStatus(GRAS!generallyregardedassafe/公認(rèn)為安全）的"食品級(jí)"酵母。與數(shù)千年以來經(jīng)過實(shí)踐考驗(yàn)作為食品添加劑的面包酵母一樣，奶制品行業(yè)中經(jīng)常使用的乳酸克魯維酵母也是適用于食品行業(yè)的無害酵母。[0030]除了"現(xiàn)有技術(shù)"所述的發(fā)酵方法之外，乳酸克魯維酵母與釀酒酵母相比還有能表達(dá)異源基因的諸多優(yōu)點(diǎn)。乳酸克魯維酵母屬于"petitenegative/弱陰性"酵母，也就是說，線粒體DNA的損失是致命的（由于線粒體膜電位驟降（Chenetal.,1995;Clark-Walker,2007))。線粒體功能與隨Ca2+變化的信號(hào)傳導(dǎo)、活性氧化合物的生產(chǎn)、細(xì)胞的應(yīng)激應(yīng)答、蛋白糖基化以及細(xì)胞壁完整性密切相關(guān)。因此線粒體功能對(duì)重組糖蛋白的生產(chǎn)和細(xì)胞壁的成分有決定性影響。[0031]就酵母和哺乳動(dòng)物而言，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生的蛋白N-糖基化的前期步驟相同。但是在高爾基體中發(fā)生的步驟則相互不同。存在于高爾基體中的羰基轉(zhuǎn)移酶在不同的酵母菌種中各不相同，因此導(dǎo)致細(xì)胞壁中的糖蛋白成分有所差異。在乳酸克魯維酵母中，糖蛋白具有終端N-乙酰葡萄糖胺，與釀酒酵母的磷酸甘露糖相反（Raschke和Ballou，1972)。這可能會(huì)在接種疫苗時(shí)大大影響相應(yīng)酵母菌種對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激。[0032]蛋白糖基化/分泌和細(xì)胞壁生物合成期間的化合物表明改變了al，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶（KIOCHl)的乳酸克魯維酵母突變體中的重組蛋白的分泌作用有所改善（Uccellettietal.，2004)。蛋白糖基化過程中的變化還會(huì)影響重組蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位，重組蛋白在分泌過程中會(huì)由于錯(cuò)誤折疊而受到抑制。[0033]乳酸克魯維酵母是可以使用乳糖作為碳源和能量源的少數(shù)酵母種類之一。乳糖是一種價(jià)格便宜的糖，可作為乳清的成分大量產(chǎn)生（例如奶制品業(yè)的副產(chǎn)品）。乳酸克魯維酵母可以利用乳糖達(dá)到與利用葡萄糖類似的生長(zhǎng)率。已對(duì)調(diào)控參與乳糖代謝的基因進(jìn)行了大量研究。β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子（LAC4)可以用來調(diào)控異源基因表達(dá)和重組蛋白的生產(chǎn)(vanOoyenetal.，2006，Breunigetal.,2000)。由于減少了葡萄糖阻遏作用，在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培育的乳酸克魯維酵母培養(yǎng)物中加入乳糖，就能快速高效地誘導(dǎo)基因的異源表達(dá)。[0034]按照本發(fā)明所述，通過基因技術(shù)方法生成乳酸克魯維酵母菌株，適宜是VAK367-D4和該菌株的變異體，該菌株允許將外源基因靶向整合在酵母基因組的LAC4位點(diǎn)上（附圖1)。該整合僅需要通過相應(yīng)構(gòu)建的質(zhì)粒執(zhí)行一個(gè)步驟；可以在不使用抗生素抗性基因的情況下選擇重組菌株，將乳糖加入到培養(yǎng)基之中，就可以通過LAC4啟動(dòng)子誘導(dǎo)重組菌株中的外源基因表達(dá)?？梢酝ㄟ^該方法在幾周內(nèi)生成整合了外源基因的乳酸克魯維酵母細(xì)胞并且描述其特性。該體系的兩個(gè)方面很重要：一方面能夠以可重現(xiàn)的方式培育含有定量外源蛋白的酵母細(xì)胞（附圖2、3)，另一方面當(dāng)用于對(duì)可塑性（易改變的）抗原（例如流感抗原血凝素）進(jìn)行疫苗接種時(shí)，可以在短時(shí)間內(nèi)生成新的酵母菌株，例如當(dāng)出現(xiàn)新的潛在流行流感病毒株的時(shí)候。新生成的重組乳酸克魯維酵母菌株極有可能具有與試驗(yàn)菌株類似的特性(例如在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)特性）。將反式激活因子KIGaM的基因整合到酵母基因組之中還可以顯著提高外源基因的表達(dá)率（Kugeretal.，1990)。[0035]在另一種實(shí)施方式中，使用一種特殊的乳酸克魯維酵母菌株VAK367-D4及其后代執(zhí)行本發(fā)明所述的方法。生成了一系列（VAK)基于乳酸克魯維酵母菌株VAK367-D4構(gòu)建的重組變異體?？傊@些變異體能誘導(dǎo)表達(dá)大量外源蛋白，或者該外源蛋白的結(jié)構(gòu)域，或者與異種蛋白結(jié)構(gòu)域融合的該外源蛋白的結(jié)構(gòu)域。所使用的異種蛋白結(jié)構(gòu)域可用來靶向刺激免疫應(yīng)答（佐劑），或者靶向分隔酵母細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白。除了佐劑效應(yīng)之外，分隔所表達(dá)的外源蛋白對(duì)于優(yōu)化表達(dá)或者表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)而言很重要。[0036]在另一種實(shí)施方式中，使用VAK367-D4及其后代作為亞單位標(biāo)記疫苗來執(zhí)行本發(fā)明所述的方法。使用僅僅表達(dá)規(guī)定蛋白抗原（外源蛋白）的重組乳酸克魯維酵母作為疫苗，鑒別診斷過程中辨別接種疫苗的個(gè)體與自然感染的個(gè)體。這些重組乳酸克魯維酵母菌株（參見實(shí)施例）的其中一種已被成功用于口服和皮下接種。皮下給藥獲得了對(duì)接種對(duì)象的完全保護(hù)作用。本發(fā)明所述的"外源蛋白"指的是能夠在人或者動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)某種病原體或者致癌變異細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答、尤其可產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫應(yīng)答的所有肽、多肽和蛋白。外源蛋白可以源自于已描述其抗原特性的任何病原體或腫瘤，所述抗原能夠單獨(dú)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，尤其能誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫應(yīng)答。[0037]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，外源蛋白可以源自于已描述其抗原特性的病原體（病毒，細(xì)菌，寄生蟲），所述抗原能夠單獨(dú)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，尤其能誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫應(yīng)答。舉例如下：[0038]源自于寄牛蟲的外源蛋白[0039]美洲鉤蟲；十二指腸鉤蟲：ASP蛋白，分解血紅蛋白的蛋白酶[0040]利什曼原蟲：gp63,46kD前鞭毛體抗原，LACK[0041]瘧原蟲：CSP蛋白，CSA-I，CSA-3,EXPl，SSP2,STARP，SALSA，MSPl，MSP2,MSP3，AMA-1,GLURP,Pfs25,Pfs28,Pvs25,Pvs28,Pfs48/45,Pfs230[0042]血吸蟲：TP1，Sm23,ShGSTs26和28,副肌球蛋白，寄生蟲肌球蛋白，Sml4[0043]源自于細(xì)菌的外源蛋白[0044]結(jié)核分支桿菌：Ag85A，Hsp65,R8307,19kD，45kD，10.4[0045]幽門螺桿菌：VacA，LagA，NAP,hsp，脲酶，過氧化氫酶[0046]A群鏈球菌：M，SCPA肽酶，外毒素SPEA和SPEC，纖維連接蛋白結(jié)合蛋白[0047]肺炎鏈球菌：PspA，PsaA，BHV3,BHV4[0048]鼠傷寒沙門氏菌：Vi抗原[0049]志賀菌：LPS[0050]霍亂弧菌：CTB[0051]大腸桿菌ETEC:LT，LT-ST，CTB[0052]鼠疫耶爾森菌：F1，V[0053]源自腫瘤細(xì)朐/腫瘤的外源蛋白（腫瘤相關(guān)抗原，TAA)[0054]CEA[0055]5T4[0056]MUCl[0057]MARTI[0058]HER-2[0059]尤其優(yōu)先詵用源自病毒的外源蛋白。[0060]杯狀病毒科（諾瓦克，HEV):NV60kD;HEV0RF2[0061]呼腸弧病毒科（輪狀）：VP7,VP4[0062]逆轉(zhuǎn)錄病毒科（HIV):Gag，Pol,Nef，Env，gpl60,gpl20,gpl40,gp41[0063]黃病毒科（黃病毒屬：WNV，Dengue，YF，TBE，JEV):preM-Env，NS3,NS4,NS5[0064]黃病毒科（瘟病毒屬BVDV，CSFV，BDV。丙型肝炎病毒屬HCV):El，E2，EKNS(Pesti)，C,NS3,NS4,NS5[0065]嗜肝DNA病毒科（HBV):HBS抗原[0066]副粘病毒科（副粘病毒亞科:PIV-l，PIV-2,腮腺炎病毒，仙臺(tái)病毒，PIV-2，PIV-4，麻疫病毒）：M，HN，N，F(xiàn)[0067]副粘病毒科（肺炎病毒亞科：RSV):F，G，SH，M[0068]彈狀病毒科（狂犬?。篏[0069]皰疹病毒科（EBV，HSV2):gp350/220(EBV)，gB2,gD2(HSV)[0070]冠狀病毒科（SARS):CoV，N，M，S[0071]正粘病毒科（流感A，B):HA，NA,Ml，M2,NP[0072]乳頭瘤病毒科：L2,E6,E7[0073]在本發(fā)明最優(yōu)先的實(shí)施方式中，外源蛋白源自雙RNA病毒科家族的代表性病毒，例如IBD病毒，并且能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，尤其是保護(hù)性體液免疫應(yīng)答。[0074]在本發(fā)明的一種優(yōu)先實(shí)施方式中，產(chǎn)生乳酸克魯維酵母VAK367-D4變異體VP2(VAK887)作為外源蛋白表達(dá)形成衣殼的傳染性法氏囊病病毒（IBDV菌株D78)的VP2抗原（SEQIDN0.:1和2)。尤其優(yōu)先選用乳酸克魯維酵母VAK367-D4變異體VP2-T2S(VAK888)，該變異體中氨基酸位置2上的VP2蛋白已變異（蘇氨酸替換成絲氨酸Jagadishetal.(1991))，并且具有與SEQIDNR.:3和4一致的核苷酸序列或氨基酸序列。[0075]在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)生優(yōu)化的乳酸克魯維酵母VAK367-D4變異體，VP2T2S_GAL4,該變異體中氨基酸位置2上的VP2蛋白已變異（SEQIDNO.:3和4)，并且還含有至少兩個(gè)KIGAL4基因（VAK890)。尤其優(yōu)先選用乳酸克魯維酵母VAK367-D4變異體，OVP2-T2S，在其中通過酵母密碼子優(yōu)化的SEQIDNO.:5核苷酸序列對(duì)VP2突變抗原進(jìn)行編碼，或者在其中重組表達(dá)的VP2突變抗原具有與SEQIDNO.:6-致的氨基酸序列。優(yōu)化的乳酸克魯維酵母〇VP2-T2S_GAL4變異體（VAK911)具有以下優(yōu)點(diǎn)：[0076]-還通過突變使得外源蛋白穩(wěn)定。[0077]-可以通過反式激活因子的過度表達(dá)，以及/或者通過序列的密碼子優(yōu)化實(shí)現(xiàn)VP2表達(dá)的顯著提高（附圖2)。[0078]-整合附加的KIGAL4基因也與這種乳酸克魯維酵母變異體的生長(zhǎng)率較高有關(guān)聯(lián)。[0079]-這種乳酸克魯維酵母變異體在高細(xì)胞密度發(fā)酵以及所表達(dá)的VP2蛋白的數(shù)量方面有很高的可重現(xiàn)性（附圖3)。[0080]已按照布達(dá)佩斯條約于2011年11月29日在德國(guó)微生物菌種保藏中心DSMZ(地址：Inhoffenstrasse7B，38124Braunschweig，Deutschland)寄存了按照本發(fā)明所述產(chǎn)生的乳酸克魯維酵母VP2-T2S_GAL4變異體，寄存編號(hào)DSM25405,該變異體作為外源蛋白重組表達(dá)IBDV的VP2突變抗原，并且含有KIGAL4反式激活因子基因的其它拷貝（VAK890)。已按照布達(dá)佩斯條約于2011年11月29日在德國(guó)微生物菌種保藏中心DSMZ(地址：Inhoffenstrasse7B，38124Braunschweig，Deutschland)寄存了按照本發(fā)明所述產(chǎn)生的乳酸克魯維酵母〇VP2-T2S變異體，寄存編號(hào)DSM25406,該變異體作為外源蛋白重組表達(dá)IBDV的突變和密碼子優(yōu)化的VP2抗原（VAK910)。[0081]已按照布達(dá)佩斯條約于2011年11月29日在德國(guó)微生物菌種保藏中心DSMZ(地址：Inhoffenstrasse7B，38124Braunschweig，Deutschland)寄存了按照本發(fā)明所述產(chǎn)生的乳酸克魯維酵母〇VP2-T2S變異體，寄存編號(hào)DSM25407,該變異體作為外源蛋白重組表達(dá)IBDV的突變和密碼子優(yōu)化的VP2抗原，并且含有KIGAL4反式激活因子基因的其它拷貝(VAK911)。[0082]另一種實(shí)施方式涉及將本發(fā)明所述的重組酵母用在一種產(chǎn)生保護(hù)性免疫尤其是保護(hù)性體液免疫的方法之中，這種方法包括以下步驟：[0083]a)培育、繁殖本發(fā)明所述的重組酵母，[0084]b)收獲、滅活酵母，[0085]c)按照一種待確定的免疫方案施用重組酵母，[0086]d)滴定測(cè)定所形成的抗體，并且/或者[0087]e)證實(shí)免疫。[0088]可以用任何常規(guī)可用的方法培育、繁殖本發(fā)明所述的重組酵母，尤其優(yōu)先選用能以低廉成本實(shí)現(xiàn)較高細(xì)胞產(chǎn)率的方法，包括發(fā)酵閥，尤其是高細(xì)胞密度發(fā)酵法。已證明特別適宜使用補(bǔ)料分批發(fā)酵操作程序進(jìn)行發(fā)酵。[0089]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，以口服/粘膜或者皮下施用重組酵母的方式實(shí)現(xiàn)防護(hù)性體液免疫。在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，皮下施用重組酵母。在本發(fā)明所述的方法中，尤其優(yōu)先使用乳酸克魯維酵母、特別是轉(zhuǎn)基因變異體VAK367-D4和由此得到的變異體VAK890及其變異體進(jìn)行皮下施用。在本發(fā)明所述的方法中應(yīng)使用滅活/殺死的重組酵母細(xì)胞。在培育并且表達(dá)外源基因之后將酵母干燥，接著將其滅活?？梢杂萌魏纬Ｒ?guī)可用的方法進(jìn)行滅活。特別適合在本發(fā)明所述的方法中使用熱滅活（例如在90°C溫度下進(jìn)行2小時(shí)熱滅活）。對(duì)于口服/粘膜免疫，例如可以使用較短的1/1/1/1免疫方案（1周飼喂，1周休息，1周飼喂，以此類推），或者使用較長(zhǎng)的2/2/2方案（2周飼喂，2周休息，2周飼喂，以此類推）。對(duì)于皮下接種，例如可以每隔兩周進(jìn)行兩次或三次注射（附圖4和5)。[0090]可使用所有常規(guī)方法來證實(shí)免疫。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，測(cè)試病毒中和抗體的滴定量來證實(shí)免疫。例如可以進(jìn)行特異性ELISA測(cè)試或者中和試驗(yàn)。在中和試驗(yàn)中給一定數(shù)量的IBD病毒摻入免疫動(dòng)物或者對(duì)照動(dòng)物的定量血清。隨后通過如此處理后的病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)是否抑制感染（中和）。也可以在"攻擊"試驗(yàn)中，例如在"病毒攻擊"試驗(yàn)中檢查是否免疫成功。為此可對(duì)經(jīng)過治療的動(dòng)物施用一定劑量的病原微生物或病毒，該劑量通常不會(huì)導(dǎo)致未免疫的動(dòng)物得病。如果動(dòng)物在攻擊試驗(yàn)之后沒有得病，則證實(shí)免疫成功（附圖5)。最后也可以通過免疫組織化學(xué)證實(shí)免疫。在攻擊之后檢查病原體的靶器官是否感染或者病變（附圖5)。[0091]根據(jù)本發(fā)明已證明可以將從VAK367-D4得到的重組乳酸克魯維酵母變異體成功用于皮下注射接種。實(shí)施例中所述的菌株變異體VAK890能表達(dá)傳染性法氏囊病病毒(IBDV;菌株D78)的VP2抗原。IBDV的VP2涉及形成病毒衣殼的蛋白。已知引發(fā)對(duì)VP2抗原的體液免疫應(yīng)答就足以保護(hù)感染生物，預(yù)防相關(guān)病毒（IBDV)引起繼發(fā)感染。一方面可以通過量化病毒中和抗體來誘發(fā)有效的體液免疫應(yīng)答，另一方面則在病毒攻擊之后通過"病毒攻擊試驗(yàn)"和免疫組織化學(xué)證實(shí)預(yù)防性免疫應(yīng)答。按照本發(fā)明所述，可以將重組乳酸克魯維酵母或者源自菌株VAK367-D4的重組克魯維酵母確定為90?100%有效的皮下注射保護(hù)性疫苗（90?100%相當(dāng)于疫苗接種的"黃金標(biāo)準(zhǔn)"附圖4和5)。因此已將重組乳酸克魯維酵母或者源自菌株VAK367-D4的重組乳酸克魯維酵母確定為針對(duì)傳染性病原體（例如病毒）的"亞單位"標(biāo)記疫苗。這意味著使用病毒的單個(gè)免疫原性蛋白亞單位作為抗原。用作"亞單位"標(biāo)記疫苗意味著可以將其用來區(qū)別免疫生物與未免疫的感染生物。例如使用一種不僅能檢測(cè)免疫用抗原的對(duì)應(yīng)抗體、而且也能檢測(cè)傳染性病原體的另一種抗原的對(duì)應(yīng)抗體的差異診斷方法，就能進(jìn)行區(qū)別。使用源自菌株VAK367-D4的重組克魯維酵母菌株VAK890(DSM25405)進(jìn)行免疫，可以針對(duì)相應(yīng)的病毒抗原產(chǎn)生很高的抗體滴定量?？梢宰C明這些抗體能中和病毒。憑經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)可以通過該特性和所測(cè)定的高滴定量得出這種體液免疫應(yīng)答足以保護(hù)生物，防止相關(guān)病毒引起的繼發(fā)感染?？梢葬槍?duì)IBDV提供最終證據(jù)。產(chǎn)生高滴定量的病毒中和抗體在雞模型中與完全防止接種動(dòng)物繼發(fā)病毒感染有關(guān)聯(lián)（附圖5)。使用乳酸克魯維酵母，尤其是轉(zhuǎn)基因變異體VAK367-D4及其后代，例如乳酸克魯維酵母VP2-T2S_GAL4(VAK890)，與傳統(tǒng)方法相比具有以下主要優(yōu)點(diǎn)：[0092]1.與釀酒酵母相比，乳酸克魯維酵母的主要基本優(yōu)點(diǎn)已在經(jīng)歷數(shù)百萬年與釀酒酵母分歧的乳酸克魯維酵母生理學(xué)特性方面得到了證明，可用于表達(dá)外源基因。[0093]2.并非通過質(zhì)粒載體、而是將外源基因靶向穩(wěn)定整合到乳酸克魯維酵母基因組的確定基因位點(diǎn)之中以后表達(dá)外源基因。這樣就能在非選擇性條件下使得蛋白表達(dá)有很高的重現(xiàn)性。這方面很重要，可通過在發(fā)酵罐中培養(yǎng)酵母菌株，以能夠重現(xiàn)的方式產(chǎn)生疫苗。對(duì)于菌株VAK367-D4及其后代的口服接種原理已有描述（WO20101054649A2)。本發(fā)明現(xiàn)已證明，使用少量酵母進(jìn)行皮下接種，菌株VAK367-D4及其后代、尤其是乳酸克魯維酵母VP2-T2S_GAL4(VAK890)和oVP2-T2S_GAL4(VAK911)就能引起有效的病毒感染防護(hù)作用。[0094]3.可以誘導(dǎo)基因表達(dá)，并且提高轉(zhuǎn)錄激活因子Gal4的濃度和/或者對(duì)外源基因的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化使之適合于酵母宿主，就能進(jìn)一步提高基因表達(dá)。確定補(bǔ)料分批發(fā)酵操作程序，也能高效生產(chǎn)細(xì)胞毒性抗原。[0095]4.將外源蛋白整合到VAK367-D4及其后代之中是"一步法"。也就是大約3周之內(nèi)就能產(chǎn)生新的重組菌株并且描述其特性；這一點(diǎn)特別重要，可針對(duì)改變后的病毒變異體快速開發(fā)有效疫苗。[0096]5.通過皮下施用乳酸克魯維酵母類型的重組酵母尤其是菌株VAK367-D4的重組酵母及其后代，不僅能在小鼠體內(nèi)、而且也能在雞體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。可想而知過程很簡(jiǎn)單：將定量滅活（熱殺死）酵母細(xì)胞分2?3次注射到接種對(duì)象的皮下。最后一次注射之后兩周檢查接種對(duì)象的血清檢查是否存在抗原特異性抗體以及功能?？梢酝ㄟ^病毒中和試驗(yàn)證實(shí)該免疫應(yīng)答主要、但并非僅僅基于中和抗體的產(chǎn)生（保護(hù)性體液免疫應(yīng)答）。因此可以通過乳酸克魯維酵母在皮下應(yīng)用中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答基本上有別于可以通過釀酒酵母誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，主要是T細(xì)胞應(yīng)答。因此乳酸克魯維酵母的皮下應(yīng)用方法基本上不同于釀酒酵母的皮下應(yīng)用方法：乳酸克魯維酵母可以作為亞單位疫苗應(yīng)用于能夠產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫應(yīng)答的抗原（例如病毒抗原，如傳染性法氏囊病病毒、IBDV的VP2抗原或者流感病毒的抗原血凝素HA)，而釀酒酵母則可以作為亞單位疫苗應(yīng)用于能夠產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗原（例如丙型肝炎病毒的NS3蛋白，或者如Her-2之類的腫瘤抗原）。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答形式的這些差別估計(jì)應(yīng)歸因于上述釀酒酵母和乳酸克魯維酵母細(xì)胞極為不同的特性。[0097]總之本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有技術(shù)作出了很大貢獻(xiàn)，并且與現(xiàn)有技術(shù)相比能提供很多有益的實(shí)施方式：[0098]?發(fā)明人已成功制備了能夠用來區(qū)別接種個(gè)體與自然感染個(gè)體的亞單位標(biāo)記疫苗。[0099]?還可以制備同時(shí)具有佐劑特性并且因此有很強(qiáng)免疫原性的亞單位標(biāo)記疫苗。[0100]?可以多次應(yīng)用本發(fā)明所述的亞單位標(biāo)記疫苗。[0101]?本發(fā)明所述的亞單位標(biāo)記疫苗能在接種對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)性保護(hù)性免疫應(yīng)答和免疫記憶。[0102]?也可以利用本發(fā)明制備細(xì)胞毒性抗原的對(duì)應(yīng)疫苗。[0103]?本發(fā)明所述的方法能夠以盡可能快的速度產(chǎn)生新的疫苗變異體。[0104]?接種方法的成本非常低廉。[0105]?制備本發(fā)明所述的疫苗不需要試驗(yàn)動(dòng)物，或者培養(yǎng)物中不需要使用動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。[0106]?本發(fā)明所述的疫苗對(duì)溫度不敏感，無需冷卻即可進(jìn)行儲(chǔ)運(yùn)。[0107]?在本發(fā)明所述的方法中不使用活的重組細(xì)胞或者生物。[0108]?使用本發(fā)明所述的方法不僅能夠?qū)⒁呙绲挠昧?、而且也能將?shí)現(xiàn)保護(hù)性免疫所需的應(yīng)用次數(shù)限制在最低水平。實(shí)施例[0109]L產(chǎn)生乳酸克魯維酵母菌株VAK367-D4(metAura3-51ac4::ScURA3)。[0110]用于異源表達(dá)外源蛋白的出發(fā)菌株VAK367具有以下特性：允許以高細(xì)胞密度進(jìn)行培養(yǎng)，不會(huì)釋放可檢出的細(xì)胞內(nèi)蛋白。就此而言，該菌株有別于很多近親的乳酸克魯維酵母菌株。通過菌株CBS2359的兩輪誘變（CentraalbureauvoorSchimmelcultureshttp://www.fungalbiodiversitycentre.com)得到菌株VAK367,該菌株是氨基酸蛋氨酸和核苷堿基尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。已利用基因工程方法從菌株VAK367得到菌株VAK367-D4(已于2009年11月18日寄存在fcaunschweig德國(guó)微生物菌種保藏中心DSMZ，寄存編號(hào)DSM23097)，方法是借助質(zhì)粒pD4-2將LAC4基因的序列+358?+1181替換成ScURA3基因。菌株VAK367-D4現(xiàn)在允許將外源基因整合在LAC4位點(diǎn)上，無需附加的標(biāo)記，方法是選擇乳糖生長(zhǎng)。利用一種合適的整合載體，例如Klp3-MCS(附圖6)，通過同源重組適當(dāng)替換阻斷盒，從而在失去ScURA3標(biāo)記的情況下重建完整的LAC4基因。（附圖1)[0111]2.產(chǎn)生一種允許誘導(dǎo)表達(dá)外源基因的整合載體。[0112]載體：Klp3_MCS[0113]載體：Klp3_MCS(SEQIDNO.:10)[0114]載體Klp3-MCS(SEQIDNO.:10)(附圖6)涉及一種基于YRp7的大腸桿菌載體，該載體在酵母中不會(huì)自主復(fù)制，因?yàn)橐褎h除了ARSl序列。[0115]Klp3-MCS(SEQIDNO.:10)含有乳酸克魯維酵母LAC4啟動(dòng)子以及能夠通過同源重組整合在LAC4位點(diǎn)上的序列。[0116]已在LAC4啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)之間插入了含有TEFl終止子和KIGAL80啟動(dòng)子的DNA片段，因此在通過同源重組重建之后，可以在KIGAL80啟動(dòng)子的控制下表達(dá)LAC4閱讀框。通過轉(zhuǎn)錄因子KIGal4與LAC4啟動(dòng)子共同調(diào)控KIGAL80啟動(dòng)子（Zenkeetal.1993)。這種設(shè)計(jì)能夠通過測(cè)量LAC4編碼的β-半乳糖苷酶追蹤誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。Klp3-MCS(SEQIDNO.:10)允許通過多克隆位點(diǎn)（MCS)中的其中一個(gè)唯一切位點(diǎn)在LAC4啟動(dòng)子和TEFl終止子之間插入外源基因（附圖6)。進(jìn)行整合時(shí)利用合適的限制酶消化所得到的質(zhì)粒，使得表達(dá)盒與大腸桿菌載體序列分開。在轉(zhuǎn)化為乳酸克魯維酵母VAK367-D4之后，對(duì)表達(dá)盒進(jìn)行染色體整合；所得到的菌株不含細(xì)菌序列。[0117]3.表達(dá)傳染性法氏囊病病毒（IBDV變異體D78)的VP2抗原的乳酸克魯維酵母變異體。[0118]制備重組酵母菌株[0119]借助以下寡核苷酸從質(zhì)粒pD78A(Icardetah，2008)擴(kuò)增針對(duì)IBDVD78VP2編碼的cDNA:[0120]IBDV_Ascl_fwd(5，-GGCGCGCCGATGACAAACCTGCAAGATC-3，）（SEQIDNO.:7)，含有Ascl限制酶切位點(diǎn)，以及[0121]VP2_Notl_rev[0122](5，-ATAAGAATGCGGCCGCTCACACAGCTATCCTCCTTATG-3，）[0123](SEQIDNO.:8)含有Notl限制酶切位點(diǎn)。[0124]將以下核苷酸對(duì)用于生成VP2-T2S:[0125]IBDV_S：T_Ascl_fwd[0126](S'-GGCGCGCCGATGTCTAACCTGCAAGATCAAACCCA-3/)[0127](SEQIDNO.:9)，和VP2_Notl_rev(s.〇·)。[0128]在檢查并且確認(rèn)核苷酸序列之后，通過Ascl和Notl切位點(diǎn)將擴(kuò)增的DNA片段克隆到載體Klp3-MCS(SEQIDNO.:10)之中（附圖6)。然后整合到基因組之中（附圖1)。具體來說，利用限制酶EcoRI消化整合質(zhì)粒，并且將消化的片段轉(zhuǎn)化為感受態(tài)VAK367-D4細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平鋪在YEH)培養(yǎng)基上，在30°C溫度下過夜培養(yǎng)。為了查出陽性菌落，將含有乳糖作為碳源的SM培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化板加倍，并且在30°C溫度下培養(yǎng)2天。繼續(xù)研究該方法所鑒別的陽性克隆。[0129]按照常規(guī)方法執(zhí)行附加KIGAL4基因拷貝的基因組整合（Kugeretal.(1990)。密碼子優(yōu)化遵循釀酒酵母算法（mr.gene.com，Raabetal.,2010)。直接合成密碼子優(yōu)化的DNA片段。合成時(shí)已經(jīng)嵌入了5'Ascl和3'Notl限制酶切位點(diǎn)（mr.gene.com，Regensburg，Deutschland)。接著克隆到載體Klp3_MCS(SEQIDNO.:10)之中。[0130]Western印跡分析。[0131]將細(xì)胞團(tuán)塊重現(xiàn)懸浮于B60緩沖液之中（50mMHEPES-KOHpH7.3;60mM醋酸鉀；5mM醋酸鎂；0.1%TritonX100;10%甘油；ImM氟化鈉；20mM磷酸甘油；IOmMMgCl2;ImMDTT;蛋白酶完全抑制劑（Roche))，然后利用玻璃微珠用力攪拌使其分解。離心分離提取物(14000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘，溫度4°C)，然后測(cè)定蛋白濃度。利用SDS-PAGE在12%凝膠中分離40μg蛋白提取物。然后將蛋白轉(zhuǎn)移到膜片上。使用a-IBDV兔抗血清（1:15,000;Granzowetal·，1997)和羊抗兔HRP偶聯(lián)抗體（1:3000，SantaCruzBiotechnology,Inc.)，利用常規(guī)方法進(jìn)行Western印跡分析。[0132]Northern印跡分析。[0133]為了完全提取RNA，將5ml酵母培養(yǎng)物放在冰上冷卻。在ProtK緩沖液（IOOmMTris/HClpH7.9，150mMNaCl，25mMEDTA，1%SDS)和50mg蛋白酶K(Fermentas)中利用玻璃微珠強(qiáng)力晃動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞裂解。將樣品在35°C溫度下培養(yǎng)1小時(shí)，然后萃取RNA，使用乙醇沉淀，并且重新懸浮于DEPC水中。與Engler-Blum等人1993年描述的一樣進(jìn)行了Nothern分析，但是有一些偏差。在1%甲醛-瓊脂凝膠上分離全部RNA中的5μg，并且將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上（AmershamHybondTM-N+，GEHealthcare)。使用DIG標(biāo)記的RNA探針在68°C溫度下培養(yǎng)膜，在有DIG-NTPs(Roche)存在的情況下通過體外轉(zhuǎn)錄PCR片段制備該探針。使用封閉液處理印跡，然后使用抗DIG堿性磷酸酶標(biāo)記抗體（Roche)進(jìn)行培養(yǎng)。利用常規(guī)方法測(cè)定堿性磷酸酶的活性。[0134]異源表達(dá)VP2的定量化。[0135]使用Saugar等人2005所述改進(jìn)的操作程序。einerHefekultur，diemiteinem印isomalenVP2Plasmid(pADHl-P_VP2-T2S)在選擇性培養(yǎng)基（0·67%ΥΝΒ，2%葡萄糖和以下添加劑：llmg/lAde;14mg/lTyr;各38mg/lHis，Trp，Arg，Met;48mg/lPhe;各58mg/ILeu，lie，Lys，Val，Thr)對(duì)已使用附加型VP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的20000DE酵母培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。在收獲并且用蒸餾水洗滌之后，在裂解緩沖液（IOmMTris(pH8.0)，150mMNaCl，20mMCaCl2,ImMEDTA，蛋白酶完全抑制劑（Roche)，pH8.0)利用玻璃微珠將細(xì)胞分解。離心分離所得到的蛋白提取物（以10,OOOg離心力在4°C溫度下分離1小時(shí)），使可溶部分在蔗糖緩沖液中形成20%(w/v)蔗糖墊（IOmMTrispH8.0,150mMNaCl，20mMCaCl2;含有蛋白酶完全抑制劑（Roche))。以170,OOOg離心力在4°C溫度下離心分離3小時(shí)之后，將團(tuán)塊溶解于200μ1蔗糖緩沖液之中，然后以114,OOOg離心力在蔗糖緩沖液中以20?53%蔗糖梯度繼續(xù)離心分離17小時(shí)。該梯度被收集在700μ1部分中，然后利用SDS-PAGE和Western印跡對(duì)其進(jìn)行分析。以這種方式可以濃縮、提純異源表達(dá)VP2的寡聚蛋白復(fù)合物?？梢詸z出蛋白，并且可以利用SDSPAGE和考馬斯染色對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定蛋白含量（未顯示）。然后將純化的VP2作為標(biāo)準(zhǔn)用在含有抗VP2抗體的對(duì)比Western印跡之中。比較不同發(fā)酵中一定數(shù)量酵母細(xì)胞的VP2含量（附圖3)。[0136]酵母發(fā)酵和熱滅活。[0137]在配有四個(gè)整備2升發(fā)酵罐的DasGip平行生物反應(yīng)器系統(tǒng)（DasGipAG，JUlien，Deutschland)中進(jìn)行所有試驗(yàn)發(fā)酵。通過OrganobalanceGmbH公司（德國(guó)柏林）或者在自備實(shí)驗(yàn)室10升工作容量的BiostatED生物反應(yīng)器（B.BraunBiotech,Melsungen,Deutschland)中進(jìn)行生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵。以補(bǔ)料分批法執(zhí)行所有生產(chǎn)流程。使用含有2%酵母提取物和1%蛋白胨的復(fù)合培養(yǎng)基和20%乳糖補(bǔ)料液。將酵母培養(yǎng)物的溫度保持在30°C，并且將p02控制在30%飽和度。在發(fā)酵期間加入2MNaOH或者2MH3PO4將pH值保持在5.0。[0138]冷凍干燥酵母，然后在90°C溫度下進(jìn)行2小時(shí)熱滅活，以備在小鼠和雞體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。在使用該方法之后，每克細(xì)胞干重少于10個(gè)活細(xì)胞。[0139]4.小鼠皮下注射[0140]為了給小鼠皮下注射表達(dá)傳染性沙氏囊病病毒（IBDV變異體D78)的VP2抗原的乳酸克魯維酵母變異體（VAK890)，將用于第一次注射的干粉酵母與完全福氏佐劑（CFA)混合；在其它注射中將酵母與不完全福氏佐劑（IFA)混合（每200μICFA或者IFA100μg酵母材料）。每個(gè)個(gè)體每次免疫/加強(qiáng)注射200μ1乳化液（含有100μg酵母）。因此每次皮下免疫給老鼠個(gè)體施用的VP2用量大約相當(dāng)于ISng(附圖3)。初次注射（0天）之后，每隔兩周"加強(qiáng)"兩次（第14天和第28天；附圖4)。再經(jīng)過兩周之后，麻醉殺死動(dòng)物獲取血清。[0141]5.雞皮下注射[0142]將表達(dá)傳染性沙氏囊病病毒（IBDV變異體D78)的VP2抗原的5mg干粉乳酸克魯維酵母變異體（VAK890)溶解于750μ1磷酸鹽緩沖液/生理鹽水（PBS)以及500μ1滅菌蒸餾水之中，制備含有1.25mlIFA的乳化液，用于給雞進(jìn)行皮下注射。在第0天、第14天以及第28天注射500μ1該乳化液（含有Img酵母）（附圖5)。因此給雞個(gè)體每次免疫施用的VP2用量大約相當(dāng)于180ng(附圖3、4)。[0143]6.病毒"攻擊"[0144]接種之后（附圖5)在第42天以口服方式使接種的雞感染IBDV菌株"Edgar"的100EID50,經(jīng)過六天之后測(cè)定死亡率。隨后麻醉殺死動(dòng)物獲取血清，從動(dòng)物中取出法氏囊，首先將其在10%中性緩沖福爾馬林中固定24小時(shí)，接著將其埋入石蠟之中。[0145]7.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)。[0146]通過市面上可以買到的ELISA試劑盒IDEXXFlockChek?IBDELISAkit(IDEXXLaboratories,Inc.)測(cè)定接著對(duì)象的血清中的IBDV特異性抗體滴定量。若為接種小鼠的血清，則使用與制造商不同的第二抗體（SigmaAldrich)。[0147]8.中和試驗(yàn)。[0148]根據(jù)Sch^der等人2000年所述的操作程序進(jìn)行中和試驗(yàn)，測(cè)定病毒中和抗體的濃度。[0149]9.免疫組織化學(xué)。[0150]從埋入石蠟中的法氏囊制備4微米厚的器官切片。去除石蠟之后，按照標(biāo)準(zhǔn)程序使用蘇木精和伊紅將其著色。在顯微鏡下研究樣品，以1?4評(píng)分等級(jí)確定"病變記分"（1=正常至10%卵泡萎縮；2=10?30%卵泡萎縮；3=30?70%卵泡萎縮；4=>70%萎縮）。[0151]結(jié)果[0152]制備、優(yōu)化表達(dá)IBDVVP2的乳酸克魯維酵母菌株[0153]制備整合了IBDVVP2基因的不同乳酸克魯維酵母變異體。使用優(yōu)化的變異體進(jìn)行接種試驗(yàn)，該變異體中氨基酸位置2上的VP2蛋白已變異（蘇氨酸替換成絲氨酸Jagadishetal.(1991))，并且還包括串聯(lián)整合了至少兩個(gè)KIGAL4基因（變異體VP2-T2S_GAL4;菌株VAK890)。還通過突變使得外源蛋白穩(wěn)定；通過過度表達(dá)反式激活因子可以顯著提高VP2表達(dá)（附圖2)。整合附加的KIGAL4基因也與這種乳酸克魯維酵母變異體的生長(zhǎng)率較高有關(guān)聯(lián)。對(duì)相關(guān)表達(dá)VP2的乳酸克魯維酵母菌株VAK890的生長(zhǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使得酵母能夠以高密度和可重現(xiàn)的表達(dá)VP2的量進(jìn)行發(fā)酵。完成制備之后冷凍干燥酵母，并且在90°C溫度下滅活2小時(shí)。已經(jīng)證實(shí)了滅活：每克滅活酵母材料少于10個(gè)存活酵母細(xì)胞。測(cè)定了每個(gè)酵母細(xì)胞的VP2含量：菌株VAK890每個(gè)酵母的異源VP2蛋白含量約為0.7fg(附圖3)。[0154]小鼠和雞皮下注射[0155]如上所述進(jìn)行免疫；最后一次注射之后兩周檢查經(jīng)過治療的接種對(duì)象的血清中是否存在中和抗體。為此使用了IBDV特異性ELISA，并且進(jìn)行了IBDV中和試驗(yàn)（附圖4和5)。還利用接種后的雞進(jìn)行了"病毒攻擊"試驗(yàn)。給動(dòng)物的病毒劑量為每個(gè)動(dòng)物100EID50強(qiáng)毒性IBDV菌株"Edgar"，這一濃度會(huì)導(dǎo)致未接種的家禽患上明顯的法氏囊病，死亡率約為10?35%(附圖OT)。在"病毒攻擊"試驗(yàn)之后，通過免疫組織化學(xué)檢查接種對(duì)象的法氏囊有無感染癥狀和病變，并且通過"病變?cè)u(píng)分"（附圖5)描述其特性。[0156]無論是用小鼠進(jìn)行的試驗(yàn)，還是用雞進(jìn)行的試驗(yàn)，均證明可以通過皮下注射乳酸克魯維酵母菌株VAK890在所有經(jīng)過治療的動(dòng)物中產(chǎn)生很高的病毒中和抗體滴定量（附圖4B、4C;附圖5B、5C)。同樣能夠證明可保護(hù)所有接種的雞免遭病毒攻擊，并且實(shí)際上在其法氏囊中沒有任何病毒感染癥狀（附圖5)。所有皮下接種了乳酸克魯維酵母菌株VAK890的動(dòng)物均表現(xiàn)出對(duì)VP2有顯著的體液免疫應(yīng)答。在一次加強(qiáng)接種之后就能觀察到該免疫應(yīng)答，據(jù)此推斷：使用不完全福氏佐劑進(jìn)行兩次注射（免疫和一次加強(qiáng)），就足以形成保護(hù)。使用乳酸克魯維酵母菌株VAK890接種的所有雞均得到了保護(hù)，沒有繼發(fā)病毒感染（附圖5)。[0157]縮寫[0158]ARSl自主復(fù)制序列；引起復(fù)制的DNA上的核苷酸序列[0159]AscI限制性核酸內(nèi)切酶AscI[0160]CFA完全福氏佐劑[0161]DNA脫氧核糖核酸[0162]DEPC焦碳酸二乙酯[0163]OIG-NTP地高辛-核苷三磷酸[0164]DSMZ德國(guó)微生物菌種保藏中心[0165]DTT二硫蘇糖醇[0166]E.coli大腸桿菌[0167]EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI[0168]EDTA乙二胺四醋酸[0169]EID50雞蛋或雞胚感染劑量-使50%感染雞蛋引起感染所需的傳染性病毒數(shù)量[0170]ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[0171]GAL4酵母特異性轉(zhuǎn)錄激活因子[0172]GRAS公認(rèn)為安全[0173]HEPES2_(4_(2_羥乙基）_1_哌嗪基）-乙烷磺酸[0174]HpaI限制性核酸內(nèi)切酶HpaI[0175]HRP辣根過氧化物酶[0176]IBDV傳染性法氏囊病病毒[0177]IFA不完全福氏佐劑[0178]K.Iactis乳酸克魯維酵母[0179]KIGAL4對(duì)KIGal4/Lac9蛋白編碼的乳酸克魯維酵母基因[0180]KIGAL80對(duì)KIGal80蛋白編碼的乳酸克魯維酵母基因[0181]LAC4對(duì)半乳糖苷酶編碼的乳酸克魯維酵母基因[0182]NotI限制性核酸內(nèi)切酶NotI[0183]ODE光密度單位[0184]PBS磷酸鹽緩沖液/生理鹽水[0185]PCR聚合酶鏈反應(yīng)[0186]RNA核糖核酸[0187]S.cerevisiae釀酒酵母[0188]SalI限制性核酸內(nèi)切酶SalI[0189]SDS十_燒基硫酸納[0190]SDS-PAGE使用SDS條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳[0191]TEFlArxulaadeninivorans基因[0192]對(duì)轉(zhuǎn)錄因子EF-Ialpha進(jìn)行編碼[0193]VP2形成衣殼的I6DV病毒蛋白[0194]VP2-T2S氨基酸位置2上的蘇氨酸替換成絲氨酸的VP2[0195]VAK疫苗株[0196]YEPD酵母提取物蛋白胨葡萄糖[0197]YRp7釀酒酵母-大腸桿菌穿梭載體，基因數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)U03501(Botsteinetal.,1979)[0198]參考文獻(xiàn)清單[0199]Backhaus,K.etal.Milkandsugar!RegulationofcellwallsynthesisinthemilkyeastKluyveromyceslactis.EuropeanJournalofCellBiology90,745-750(2011).[0200]Bathurst,I.C.ProteinExpressioninYeastasanApproachtoProductionofRecombinantMalariaAntigens.TheAmericanJournalofTropicalMedianeandHygiene50,20-26(1994).[0201]BotsteinD，F(xiàn)alco,S.C.，Stewart，S.E.，Brennan，M.，Scherer，S.，Stinchcomb，D.T.,Struhl,K.&Davis,R.W.Sterilehostyeast(SHY)：aeukaryoticSystemofbiologicalContainmentforrecombinantDNAexperiments.Gene8,17-24(1979)·[0202]Breunigetal.RegulationofprimarycarbonmetabolisminKluyveromyceslactis.EnzymeMicrobialTechnology26,771-780(2000).[0203]Chen,X.J.&Clark-Walker,G.D.Specificmutationsinalpha-andgamma-subunitsofFl-ATPaseaffectmitochondrialgenomeintegrityinthepetite-negativeyeastKluyveromyceslactis.EMBOJournal14,3277-3286(1995).[0204]Clark-Walker,G.D.TheFl-ATPaseinhibitorInhl(IFl)affectssuppressionofmtDNAloss-lethalityinKluyveromyceslactis.FEMSYeastResearch7，665-674(2007).[0205]Donnini,C.etal.ImprovedProductionofHeterologousProteinsbyaGlucoseRepression-DefectiveMutantofKluyveromyceslactis.AppliedandEnvironmentalMicrobiology70,2632-2638(2004).[0206]Engler-Blum,G.,Meier,M.,Frank,J.Muller,G.A.ReductionofbackgroundProblemsinnonradioactivenorthernandsouthernblotanalysesenableshighersensitivitythan32P_basedhybridizations.AnalyticalBiochemistry210，235-244(1993).[0207]GellissenG.&HoIlenbergC.P.Applicationofyeastsingeneexpressionstudies：acomparisonofSaccharomycescerevisiae，HansenulapolymorphaandKluyveromyceslactis-areview.Gene190,87-97(1997).[0208]Granzow,H.etal.Asecondformofinfectiousbursaldiseasevirus-associatedtubulecontainsVP4.JournalofVirology71,8879-8885(1997).[0209]Jagadish，M.N.，Laughton，D.L，Azad，A.A.&Macreadie，I.G.Stablesynthesisofviralprotein2ofinfectiousbursaldiseasevirusinSaccharomycescerevisiae.Gene108,275-279(1991).[0210]Icard,A.H.,Seilers,H.S.,&Mundt,E.Detectionofinfectiousbursaldiseasevirusisolateswithunknownantigenicpropertiesbyreversegenetics.AvianDisease52,590-598.(2008)[0211]Kuger，P.，G0decke，A.&Breunig，K.D.AmutationintheZn-fingeroftheGAL4homologLAC9resultsinglucoserepressionofitstarge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V，N，M，S;正粘病毒科（流感A，B):HA，NA，M1，M2，NP;以及乳頭瘤病毒科：L2,E6,E7。27.根據(jù)權(quán)利要求22?26中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，外源蛋白選自雙RNA病毒科家族的代表性病毒。28.根據(jù)權(quán)利要求22?27中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，外源蛋白是傳染性法氏囊病病毒（IBDV)的VP2抗原。29.根據(jù)權(quán)利要求22?28中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，VP2抗原源自傳染性法氏囊病病毒（IBDV)菌株D78。30.根據(jù)權(quán)利要求22?29中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，通過選自SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:5的核苷酸序列對(duì)傳染性法氏囊病病毒（IBDV)的VP2抗原進(jìn)行編碼。31.根據(jù)權(quán)利要求22?30中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，傳染性法氏囊病病毒（IBDV)的VP2抗原具有選自SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:4和SEQIDNO.:6的氨基酸序列。32.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，乳酸克魯維酵母菌株選自：乳酸克魯維酵母VAK367-D4890DSM25405，乳酸克魯維酵母VAK367-D4910DSM25406,以及乳酸克魯維酵母VAK367-D4911DSM25407。33.根據(jù)權(quán)利要求22?31中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，外源蛋白是傳染性法氏囊病病毒（IBDV)的VP2突變抗原。34.根據(jù)權(quán)利要求22?32中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，外源蛋白是傳染性法氏囊病病毒（IBDV)的VP2密碼子優(yōu)化抗原。35.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，乳酸克魯維酵母菌株選自乳酸克魯維酵母VAK890、VAK910和VAK911。36.將權(quán)利要求1?35中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母用于皮下接種方法之中。37.利用重組酵母進(jìn)行皮下接種的方法，特征在于所述方法包括以下步驟：a)培育、繁殖本重組酵母，b)收獲、滅活酵母，c)按照一種待確定的免疫方案施用重組酵母，d)滴定測(cè)定所形成的抗體，并且/或者e)證實(shí)免疫。38.利用重組酵母進(jìn)行皮下接種的方法，其特征在于，在所述方法中使用權(quán)利要求1?35中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的重組酵母。39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的方法，其特征在于，利用皮下注射權(quán)利要求1?35中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述重組酵母的完整酵母細(xì)胞針對(duì)所表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)生特異性免疫。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，針對(duì)病原體或者腫瘤的外源蛋白產(chǎn)生特異性免疫。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，外源蛋白源自于權(quán)利要求13?31中任一項(xiàng)所述的寄生蟲、細(xì)菌或者病毒。42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，針對(duì)細(xì)胞毒性抗原產(chǎn)生特異性免疫。43.根據(jù)權(quán)利要求37?42任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，利用皮下注射權(quán)利要求1?35中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述重組酵母的完整酵母細(xì)胞針對(duì)所表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)生體液免疫。44.根據(jù)權(quán)利要求37?43任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，利用皮下注射權(quán)利要求1?35中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述重組酵母的完整酵母細(xì)胞針對(duì)所表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫。45.對(duì)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述外源蛋白的對(duì)應(yīng)免疫應(yīng)答進(jìn)行檢測(cè)和定量化的特異性ELISA方法。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的ELISA方法，對(duì)IBDVVP2蛋白和/或者IBDVVP2T2S突變蛋白的對(duì)應(yīng)免疫應(yīng)答進(jìn)行檢測(cè)和定量化。47.對(duì)根據(jù)權(quán)利要求37?44中任一項(xiàng)所述進(jìn)行了免疫的個(gè)體的血清中的中和抗體進(jìn)行證實(shí)的方法。48.針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求37?44中任一項(xiàng)所述進(jìn)行了免疫的個(gè)體的血清中的IBDVVP2蛋白和/或者IBDVVP2-T2S突變蛋白和/或者OVP2-T2S密碼子優(yōu)化蛋白證實(shí)中和抗體的方法。49.通過抗原攻擊證實(shí)權(quán)利要求37?44中任一項(xiàng)所述免疫的方法。50.通過病毒抗原或者病毒攻擊證實(shí)權(quán)利要求37?44中任一項(xiàng)所述免疫的方法。51.使用IBDVVP2蛋白和/或者IBDVVP2-T2S突變蛋白和/或者OVP2-T2S密碼子優(yōu)化蛋白進(jìn)行攻擊證實(shí)權(quán)利要求37?44中任一項(xiàng)所述免疫的方法。52.寡核苷酸，具有與SEQIDNO.:7、SEQIDNO.:8或者SEQIDNO.:9-致的核酸序列。53.具有外源基因的表達(dá)載體，其特征在于，所述外源基因具有與SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:3或者SEQIDNO.:5-致的核酸序列。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的表達(dá)載體，其特征在于，外源基因包含針對(duì)IBDVVP2蛋白或者IBDVVP2-T2S蛋白編碼的自然核苷酸序列或者密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。55.根據(jù)權(quán)利要求53或54中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其特征在于，外源基因針對(duì)IBDVVP2蛋白利用與SEQIDNO.:2-致的氨基酸序列進(jìn)行編碼，或者針對(duì)IBDVVP2-T2S蛋白利用與SEQIDNO.:4-致的氨基酸序列進(jìn)行編碼。56.根據(jù)權(quán)利要求53?55中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其特征在于，表達(dá)載體是載體Klp3或者Klp3-MCS(SEQIDNO.:10)?！疚臋n編號(hào)】A61K39/00GK104428417SQ201280062015【公開日】2015年3月18日申請(qǐng)日期:2012年12月12日優(yōu)先權(quán)日:2011年12月13日【發(fā)明者】K·布羅伊尼希,S-E·貝倫斯申請(qǐng)人:哈雷-維滕貝格馬丁-路德大學(xué)