雙特異性t細胞活化劑抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雙特異性抗體，其具有連接子與鉸鏈序列的組合，以形成具有生物學顯著性的連接子-鉸鏈界面域。此些連接子-鉸鏈界面域使兩個分子共價相連，維持所連分子的生物學活性(標靶結(jié)合)，穩(wěn)定新分子的生物學特性(溶解性和4℃穩(wěn)定性)，維持所連分子的化學、生物化學和物理性質(zhì)(細胞毒性)，和調(diào)節(jié)所連分子的生物學特性(活化T淋巴細胞而無顯著增殖跡象)。需要連接子(GGGGS)與鉸鏈(CPPCP)序列兩者來建立功能性連接子-鉸鏈界面域，因為缺失任一組分均會引起T淋巴細胞介導的活性顯著喪失。
【專利說明】雙特異性T細胞活化劑抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及制備雙特異性或多特異性生物分子，例如雙特異性抗體的方法，和其 產(chǎn)物。特定來說，本發(fā)明是有關(guān)用于分子交聯(lián)的新穎交聯(lián)子和使用其的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 組合具有不同功能的生物分子可產(chǎn)生具有所要或改良性質(zhì)的新分子。舉例來說， 組合分子可具有雙重功能并且可具有改良的穩(wěn)定性。組合生物分子的常見方法為使用化學 連接劑將這些分子交聯(lián)。然而，當化學交聯(lián)時，組合分子的生物學活性并不總是得以保存。 因此，仍需要用于生物分子交聯(lián)的更好方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明涉及制備雙特異性或多特異性生物分子，例如雙特異性抗體（BsAb)的方 法，和由此制得的產(chǎn)物。特定來說，本發(fā)明是有關(guān)用于連接生物分子的新穎連接子-鉸鏈 域，和使用其的方法。
[0004] 本發(fā)明的一個方面涉及稱為"連接子-鉸鏈域"（LHD)的蛋白質(zhì)域。根據(jù)本發(fā)明 的一個實施例的LHD包括連接子序列和鉸鏈序列，其中所述連接子序列包含甘氨酸-甘氨 酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸（GGGGS)，并且所述鉸鏈序列包含半胱氨酸-脯氨酸-脯氨 酸-半胱氨酸-脯氨酸（CPPCP)。LHD可包括兩個或兩個以上連接子序列。LHD域的實例 可包括 SEQ ID N0 :1、SEQ ID N0 :2、SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5 或 SEQ ID NO :6的序列。
[0005] 本發(fā)明的一個方面涉及具有上述LHD域的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的蛋 白質(zhì)可進一步包括一個N末端部分，其經(jīng)肽鍵融合到蛋白質(zhì)域的N末端；和/或一個C末端 部分，其經(jīng)肽鍵融合到蛋白質(zhì)域的C末端。N末端部分和C末端部分可各獨立地為肽、全長 免疫球蛋白或抗體的單鏈可變區(qū)片段（ScFv)。舉例來說，N末端部分和C末端部分的一者 可包括T淋巴細胞活化域，所述T淋巴細胞活化域包含抗⑶3抗體或抗⑶3抗體的單鏈可 變區(qū)片段（ScFv)，而N末端部分和C末端部分的另一者可包括腫瘤識別域，所述腫瘤識別域 包含抗⑶20抗體或抗⑶20抗體的單鏈可變區(qū)片段（ScFv)?；蛘撸琋末端部分包含抗腫瘤 特異性標記、發(fā)炎疾病標記、自體免疫性疾病標記或過敏癥相關(guān)標記。
[0006] 本發(fā)明的一個方面涉及生物分子，各生物分子包含上述蛋白質(zhì)的二聚體，所述二 聚體的鉸鏈序列之間具有二硫鍵。生物分子維持T淋巴細胞活化能力，或生物分子維持抗 體結(jié)合到抗原的能力。生物分子可具有改良的溶解性、穩(wěn)定性和藥物動力學。
[0007] 本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點由以下實施方式和隨附權(quán)利要求書將顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1A到1E顯示示意圖，其說明根據(jù)本發(fā)明實施例的各種雙特異性抗體（BsAb)的 構(gòu)筑體。
[0009] 圖2A和2B顯示電泳結(jié)果，說明IgG-FLΛH BsAb的聚集。
[0010] 圖3顯不各種BsAb在長期儲存后的穩(wěn)定性。
[0011] 圖4顯示LHD中無鉸鏈的BsAb和根據(jù)本發(fā)明實施例的具有各種連接子長度的 BsAb的結(jié)合親和力。
[0012] 圖5A到5C顯示根據(jù)本發(fā)明實施例的各種BsAb的細胞毒性。
[0013] 圖6顯示根據(jù)本發(fā)明實施例的BsAb誘導PBMC增殖。
[0014] 圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的LHD融合BsAb的藥物動力學（PK)分析。

【具體實施方式】
[0015] 本發(fā)明的實施例涉及制備雙特異性或多特異性生物分子，例如雙特異性抗體的方 法，和其產(chǎn)物。本發(fā)明的一些實施例是有關(guān)用于分子交聯(lián)的新穎交聯(lián)子和使用其的方法。 本發(fā)明的交聯(lián)子可包含連接子域和鉸鏈域。因此，這些交聯(lián)子可稱為"連接子-鉸鏈域"或 LHD。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，連接子域可具有甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸 (GGGS)的序列，并且鉸鏈域可具有半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-脯氨酸（CPPCP) 的序列。一些交聯(lián)劑可包含一個或多個連接子序列。鉸鏈序列可使含有這些序列的分子的 二聚體之間形成二硫鍵。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，這些LHD可用于構(gòu)建雙特異性或多特異性生物分子。所述 生物分子可為抗體，也就是，雙特異性或多特異性抗體。在本說明書中，雙特異性抗體可稱 為 "BsAb"。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明實施例的雙特異性抗體可包含LHD，其經(jīng)由肽鍵連接到免疫球蛋白 (IgG)的恒定區(qū)片段（Fc)，也就是，融合蛋白IgG-Fc-LHD。兩個特異性配位體結(jié)合部分可連 接到此融合蛋白的N末端和C末端，而產(chǎn)生雙特異性生物分子。位于LHD-IgG Fc的N末端 或C末端的特異性配位體結(jié)合部分可為蛋白質(zhì)或肽。這些部分的實例可包括抗體的單鏈可 變區(qū)（稱為"ScFv"）或結(jié)合特異性配位體（包括抗原）的肽。
[0019] 本發(fā)明的雙特異性生物分子可具有抗體樣結(jié)構(gòu)并且稱為"雙特異性抗體"或BsAb。 下文將描述一些實例以說明本發(fā)明的實施例。雖然僅描述有限數(shù)目個實例，但所屬領(lǐng)域的 技術(shù)人員會了解，這些實例可具有其它變型或變化形式而不悖離本發(fā)明的范疇。
[0020] 實例
[0021] 構(gòu)建靶向⑶20的雙特異性抗體（具有LHD的BsAb)
[0022] 為改良多特異性分子的生物學功能性，構(gòu)建包含連接子-鉸鏈界面域（LHD)的雙 特異性抗體（BsAb)并且測試其功能。如本文所述，"連接子-鉸鏈"界面域（"LHD"）包括 構(gòu)建一個或多個甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸（GGGGS或G4S連接子）連接 子序列和單一的半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-脯氨酸（CPPCP鉸鏈）鉸鏈序列。 (表 1)。
[0023] 表 1
[0024] 連接子-鉸鏈域序列的清單
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種包含連接子序列和鉸鏈序列的蛋白質(zhì)域（LHD)，其中所述連接子序列包含甘 氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸，且所述鉸鏈序列包含半胱氨酸-脯氨酸-脯氨 酸-半胱氨酸-脯氨酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)域，其中所述蛋白質(zhì)域包含兩個或兩個以上連接子序 列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)域，其中所述蛋白質(zhì)域包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO: 2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5或SEQIDN0 :6的序列。
4. 一種包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)域的蛋白質(zhì)，其進一步包含經(jīng)由肽鍵融合到 所述蛋白質(zhì)域的N末端的N末端部分和經(jīng)由肽鍵融合到所述蛋白質(zhì)域的C末端的C末端部 分。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其中所述N末端部分和所述C末端部分各自獨立地 為全長免疫球蛋白或抗體的單鏈可變區(qū)片段（ScFv)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其中所述N末端部分和所述C末端部分中的一者包 含含有抗CD3抗體或抗CD3抗體的單鏈可變區(qū)片段（ScFv)的T淋巴細胞活化域，而所述N 末端部分和所述C末端部分的另一者包含含有抗CD20抗體或抗CD20抗體的單鏈可變區(qū)片 段（ScFv)的腫瘤識別域。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其中所述N末端部分包含抗腫瘤特異性標記、發(fā)炎疾 病標記、自體免疫性疾病標記或過敏癥相關(guān)標記。
8. -種包含根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)的二聚體的生物分子，其 包含介于所述二聚體的鉸鏈序列之間的二硫鍵。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子維持T淋巴細胞活化能力。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子維持抗體結(jié)合到抗原的能力。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子在表達、產(chǎn)生或純化期間維持 溶解性。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子的促有絲分裂性低于抗CD3單 株抗體的促有絲分裂性。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物分子，其中所述生物分子能夠在不低于抗CD3單株抗體 誘導的水準的水準下誘導⑶69和⑶25表達。
【文檔編號】A61K39/395GK104144949SQ201280063059
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日
【發(fā)明者】徐悠深, 許壽山, 張銘一, 張銘傳, 阮大同 申請人:財團法人生物技術(shù)開發(fā)中心