具有限定和動(dòng)態(tài)形狀的人工抗原遞呈細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】公開了包含非對(duì)稱人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)的組合物和方法。非球形aAPC更接近地模擬內(nèi)源性細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用，并可被用于抗原特異性免疫治療。
【專利說明】具有限定和動(dòng)態(tài)形狀的人工抗原遞呈細(xì)胞
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年12月9日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/568，751的權(quán)益，該美國臨時(shí)申請(qǐng)通過引用整體并入本文。
[0003]背景
[0004]幾何形狀與空間組織是許多生物系統(tǒng)中的關(guān)鍵組分。幾何形狀和空間組織的重要性可在免疫系統(tǒng)內(nèi)以各種方式，包括T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞(APC)相互作用過程中觀察到，其是T細(xì)胞命運(yùn)和效應(yīng)器功能的關(guān)鍵決定因素。隨著活化，APC，諸如樹突狀細(xì)胞(DC)，在其細(xì)胞形態(tài)方面具有導(dǎo)致在其整體細(xì)胞表面面積顯著增加的重大變化。細(xì)胞形態(tài)中的此類變化促進(jìn)與幼稚T細(xì)胞的相互作用，并最終影響T細(xì)胞的命運(yùn)和結(jié)局。T細(xì)胞活化還通過DC和T細(xì)胞膜之間稱為“免疫突觸”的大表面積的緊密膜并置(close membraneapposit1n)的形成來調(diào)節(jié)。Grakoui, A.，等人，The immunological synapse: a molecularmachine controlling T cell activat1n.Science285, 221-227(1999)。Monks, C.R.，等人,Three-dimens1nal segregat1n of supramolecular activat1n clusters in Tcells.Nature395, 82-86 (1998) o Lee, K.H.，等人，T cell receptor signaling precedesimmunological synapse format1n.Science295, 1539-1542 (2002)。因此，考慮幾何形狀和空間組織在研究生物反應(yīng)中是很重要的。
[0005]簡(jiǎn)單化的系統(tǒng)也促進(jìn)了有效的免疫應(yīng)答的研究。一個(gè)這樣的系統(tǒng)已開發(fā)了無細(xì)胞人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)。這些系統(tǒng)已通過將T細(xì)胞活化需要的蛋白偶聯(lián)(coupling)至顆粒來做出。最低限度地，T細(xì)胞活化需要細(xì)胞之間的兩組受體-受體相互作用。第一相互作用信號(hào)1，將主要組織相容性復(fù)合物(MHC)或替代物，諸如抗-⑶3結(jié)合至T細(xì)胞受體(TCR)。第二相互作用信號(hào)2，將APC上的共刺激受體，諸如B7.1，結(jié)合至T細(xì)胞上的配體，諸如⑶28。因此，aAPC已通過將傳遞信號(hào)I和信號(hào)2的蛋白偶聯(lián)至由一個(gè)范圍的材料，包括磁微粒制成的微珠的表面(圖2a)來產(chǎn)生，Oelke, M.,等人，Ex vivo induct1nand expans1n of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-1g-coated artificialantigen-presenting cells.Nat Med9，619-625.PMID:12074385(2003)。Ugelj S.，等人，In vivo administrat1n of artificial antigen-presenting cells activateslow-avidity T cells for treatment of cancer.Cancer Res69, 9376-9384(2009), polystyrene particles, Mescherj M.F.Surface contact requirements for activat1n ofcytotoxic T lymphocytes。 J Immunol149，2402-2405(1992)，and PLGA microparticles。Han，H.，等人，A novel system of artificial antigen-presenting cells efficientlystimulates Flu peptide-specific cytotoxic T cells in vitr0.B1chem B1phys ResCommun411，530-535 (2011) o Steenblock，E.R.，等人，An artificial antigen-presentingcell with paracrine delivery of IL_2impacts the magnitude and direct1n ofthe T cell response.J B1l Chem286，34883-34892 (2011)。Steenblock，E.R.和Fahmyj T.M.A comprehensive platform for ex vivo T cell expans1n based onb1degradable polymeric artificial antigen-presenting cells.Mol Therl6, 765-772.PMID:18334990(2008)。
[0006]已將此類系統(tǒng)廣泛地應(yīng)用至腫瘤免疫治療、疫苗接種、以及免疫抑制，并順從于在體內(nèi)或離體刺激T細(xì)胞,且提供免疫療法的可能的新穎轉(zhuǎn)化方法。Ugel, S.，等人，In vivoadministrat1n of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity Tcells for treatment of cancer.Cancer Res69，9376-9384 (2009)。Ndhlovu，Ζ.Μ.，等人,Dynamic regulat1n of funct1nally distinct virus-specific T cells.ProcNatl Acad Sci U S A107，3669-3674 (2010)。Ito，F(xiàn).，等人，Antitumor reactivity ofant1-CD3/ant1-CD28bead-activated lymphoid cells:1mplicat1ns for cell therapyin a murine model.J Immunother26，222-233 (2003) 0Lum，L G.，等人，Immune modulat1nin cancer patients after adoptive transfer of ant1-CD3/ant1-CD28_costimulated Tcells-phase I clinical trial.J Immunother24，408-419 (2001) oTaylor，P.A.，等人，Theinfus1n of ex vivo activated and expanded CD4 (+)CD25 (+)immune regulatorycells inhibits graft-versus-host disease lethality.Blood99，3493-3499(2002)。Balmertj S.C.and Little, S.R.，B1mimetic delivery with micro—and nanoparticles.Adv Mater24，3757-3778(2012)?
[0007]雖然有用，但信號(hào)I和信號(hào)2范例單獨(dú)不捕獲空間組織的平面形狀或相互作用的幾何形狀。開發(fā)用于體內(nèi)和體外有效剌激T細(xì)胞應(yīng)答的人工系統(tǒng)的在先工作并沒嘗試說明APC行為的這些方面。結(jié)果，迄今測(cè)試的所有顆粒系統(tǒng)已經(jīng)使用球形顆粒用于其aAPC平臺(tái)，其不像DC，對(duì)于給定的體積最小化表面積(圖2b)。
[0008]顆粒形狀最近才成為在用于藥物遞送的材料設(shè)計(jì)領(lǐng)域中感興趣的設(shè)計(jì)參數(shù)。形狀可在調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取的速率和機(jī)制中發(fā)揮作用，Wang，J.，等人，More effectivenanomedicines through particle design.Smal17, 1919-1931 (2011), can dramaticallyreduce internalizat1n by phagocytic cells,such as macrophages, Champ1n, J.A.和 Mitragotri，S.，Role of target geometry in phagocytosis.Proc NatlAcad Sci U S A103，4930-4934 (2006).Sharma，G.，等人，Polymer particle shapeindependently influences binding and internalizat1n by macrophages.J ControlReleasel47，408-412(2010)，can change the b1distribut1n of the drug deliveryvehicle, Champ1n, J.A.,等人，Particle shape:a new design parameter for micro-andnanoscale drug delivery carriers.J Control Releasel21，3-9(2007).Devarajanj P.V.，等人,Particle shape: a new design parameter for passive targeting insplenotropic drug delivery.J Pharm Sci99，2576-2581 (2010)，and can affect theability of a particle to bind a cell,in part, by increasing the surface areafor interact1n.Champ1n, J.A.,等人，Particle shape: a new design parameter formicro-and nanoscale drug delivery carriers.J Control Release 121，3-9 (2007).Harris, B.J.and Dalhaimerj P., Particle shape effects in vitro and in viv0.Front B1sci (Schol Ed) 4，1344-1353(2012).YoojJ.W.and Mitragotrij S.，Polymerparticles that switch shape in response to a stimulus.Proc Natl Acad Sci U SA107， 11205-11210(2010)。
[0009]概述
[0010]在一些方面，本發(fā)明公開的主題提供了人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，包括:(a)具有模擬細(xì)胞或微生物的形狀的非對(duì)稱形狀的三維微?；蚣{米顆粒；以及(b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。在某些方面，細(xì)胞或微生物選自由以下組成的組:細(xì)菌、古細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、藻類和病毒。在一些方面，細(xì)胞或微生物具有選自由以下組成的組的形狀:螺旋形(spiral)、立方體形、棒狀(rod)、逗號(hào)形(comma)、星形、正方形、柱形、多面體形、螺旋形(helix)、二十面體形、筒形(cylinder)、四面體形和角錐形。
[0011]在其他方面，本發(fā)明公開的主題提供了人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，該人工抗原遞呈細(xì)胞包括:(a)具有非對(duì)稱形狀的三維微粒或納米顆粒，其中非對(duì)稱形狀具有至少一個(gè)表面，所述表面具有沿著至少一個(gè)軸的選自以下范圍之一的曲率半徑:(a)約Inm至約1nm ； (b)約 Ilnm 至約 10nm ； (c)約 1lnm 至約 400nm ； (d)約 40Inm 至約 I μ m ; (e)約10 μ m至約20 μ m ; (f)約20 μ m至約100 μ m ;和(g)約101 μ m至約Imm ；以及(b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。
[0012]在又其他方面，本發(fā)明公開的主題提供了人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，該人工抗原遞呈細(xì)胞包括:(a)具有通過以下限定的非對(duì)稱形狀的三維微?；蚣{米顆粒:沿X-軸的維度(a)、沿y_軸的維度(b)、和沿Z-軸的維度(c),其中(a)、(b)、或(C)中的至少一個(gè)不等于至少一個(gè)其他維度(a)、(b)、或(c);以及(b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。在特定方面，非對(duì)稱形狀包括橢球(ellipsoid)，其可通過以下方程式中的一個(gè)來描述:a>b = c (長(zhǎng)橢球(prolate ellipsoid)) ;a>b>c (三軸捕球(tr1-axial ellipsoid)) jPa = b>c(扁捕球(oblate ellipsoid))。
[0013]在另一個(gè)方面 ，本發(fā)明公開的主題提供了用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法，該方法包括:
(a)提供人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，該人工抗原遞呈細(xì)胞包括:(i)具有通過以下限定的非對(duì)稱形狀的三維微?；蚣{米顆粒--沿X-軸的維度(a)、沿y_軸的維度(b)、和沿Z-軸的維度(c),其中(a)、(b)、或(C)中的至少一個(gè)不等于至少一個(gè)其他維度(a)、(b)、或(C);以及(?)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子，和能夠與T細(xì)胞上的除了 TCR外的受體相互作用以共刺激T細(xì)胞的一種或更多種分子；(b)使T細(xì)胞與aAPC接觸；以及(C)允許T細(xì)胞被調(diào)節(jié)。
[0014]在還另一個(gè)方面，本發(fā)明公開的主題提供了用于制造人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)的方法，所述人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)包括:具有通過以下限定的非對(duì)稱形狀的三維微?；蚣{米顆粒:沿X-軸的維度(a)、沿y_軸的維度(b)、和沿Z-軸的維度(C)，其中(a)、(b)、或(C)中的至少一個(gè)不等于至少一個(gè)其他維度(a)、(b)、或(c);以及能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子，該方法包括:(a)提供或制備多個(gè)微?；蚣{米顆粒；(b)制備包含多個(gè)微?；蚣{米顆粒的膜；(c)拉伸包含多個(gè)微?；蚣{米顆粒的膜以形成具有非對(duì)稱形狀的多個(gè)三維微粒或納米顆粒；(d)收獲具有非對(duì)稱形狀的多個(gè)三維微粒或納米顆粒；以及(e)將具有非對(duì)稱形狀的多個(gè)三維微粒或納米顆粒偶聯(lián)至能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。
[0015]在又另外的方面，本發(fā)明公開的主題提供了用于拉伸膜的裝置。
[0016]上文已經(jīng)描述了本發(fā)明公開的主題的某些方面，由本發(fā)明公開的主題全部或部分來解決，當(dāng)結(jié)合作為本文以下最佳描述的所附實(shí)施例和附圖時(shí)，其他方面隨著說明書進(jìn)行將變得明顯。
[0017]附圖簡(jiǎn)述
[0018]因此，已概括地描述了本發(fā)明公開的主題，現(xiàn)在將參考附圖，附圖不一定按比例繪制，并且其中:
[0019]圖1顯示了可被改變的本發(fā)明公開的人工細(xì)胞參數(shù)的代表性實(shí)施方案和用于實(shí)現(xiàn)改變的方法；
[0020]圖2A-2I是，(A)是aAPC的原理圖；(B-D)是建模為球形的T細(xì)胞與以下之間的相互作用的原理圖:(B)球形；(C)橢球(AR2.83 ;拉伸比2);和(D)抗原遞呈細(xì)胞(APC) ； (E)由SEM(2000x放大倍率)對(duì)球形和橢球PLGA微粒的表征(比例尺相應(yīng)于10 μ m) ； (F)微粒的大小分布；(G)施加在膜上的拉伸度(STR)與產(chǎn)生的橢球微粒的縱橫比(aspect rat1,AR)的比較(預(yù)測(cè)的AR = STR3/2) ；(H)在從球形和橢球微粒合成aAPC過程中蛋白的偶聯(lián)效率(η = 2);以及⑴經(jīng)一周的過程，在PBS (ρΗ7.4)中在37°C蛋白從微粒的表面釋放；
[0021]圖3A-3D顯示了響應(yīng)于特定aAPC劑量、蛋白密度、和aAPC形狀的特異性T細(xì)胞增殖:(上圖)與非相關(guān)(A)相比，拉伸的(Str，實(shí)線)和未拉伸的顆粒(NS，虛線)在最高的蛋白劑量(在偶聯(lián)過程中4yg 二聚體/mg PLGA)下在3劑量的顆粒(Bl-Dl)下的CFSE稀釋數(shù)據(jù)；(B2-D2)在向T細(xì)胞添加具有指示的劑量、形狀(黑色為拉伸的/非球形，白色為未拉伸的/球形)、和蛋白密度的顆粒后7天的T細(xì)胞增殖(擴(kuò)增倍數(shù)/100，000個(gè)細(xì)胞)；
[0022]圖4A-4C顯示了對(duì)于已被拉伸不同量的顆粒的T細(xì)胞響應(yīng)。響應(yīng)于施加了不同拉伸的aAPC的0.01mg顆粒/100，000個(gè)細(xì)胞劑量的特異性T細(xì)胞增殖:(A)暴露于不同拉伸的aAPC之后的CFSE稀釋；(B)對(duì)于差異拉伸的aAPC，經(jīng)歷0_1輪、2_3輪、4_5輪、6_7輪增殖的細(xì)胞的比例；以及(C)將aAPC加入T細(xì)胞后7天的T細(xì)胞增殖(擴(kuò)增倍數(shù)/100，000個(gè)細(xì)胞)；
[0023]圖5顯示了未拉伸的(上圖)或拉伸的(下圖)PLGA微粒的掃描電鏡照片；
[0024]圖6A-6B顯示了(a)將aAPC加入T細(xì)胞后5天的T細(xì)胞增殖(擴(kuò)增倍數(shù)/100，000個(gè)細(xì)胞)；以及(b)將aAPC加入T細(xì)胞后5天的T細(xì)胞活力；Str =拉伸的,Nonstr =未拉伸的；
[0025]圖7A-7B顯示了(a)將aAPC加入T細(xì)胞后7天的T細(xì)胞增殖(擴(kuò)增倍數(shù)/100，000個(gè)細(xì)胞)；以及(b)將aAPC加入T細(xì)胞后7天的T細(xì)胞活力；Str =拉伸的,Nonstr =未拉伸的；
[0026]圖8A-8E顯示了 aAPC (綠色)與T細(xì)胞(紅色)的綴合物形成的共聚焦成像:(A)綴合物顯示為細(xì)胞和顆粒之間的緊密膜并置的區(qū)域，其中T細(xì)胞形態(tài)重排成為獨(dú)特的帽子；(B)非拉伸的；以及(C)拉伸的aAPC形成細(xì)胞-珠綴合物，對(duì)拉伸的aAPC更頻繁地觀察到細(xì)胞-珠綴合物；(D-E)對(duì)裝載非相關(guān)MHC-肽的顆粒未觀察到綴合物形成；(F)相比于與未拉伸的aAPC溫育的T細(xì)胞的1.78% ±043%，觀察到與拉伸的aAPC溫育的T細(xì)胞的
4.634 ± 0.9%已形成綴合物(P = 0.01);以及(E)與一個(gè)拉伸的、非球形相關(guān)aAPC相互作用的單一 T細(xì)胞的延時(shí)圖像；相隔兩秒獲得的圖像；
[0027]圖9A-9C顯示了體內(nèi)腫瘤預(yù)防模型:㈧實(shí)驗(yàn)方案和時(shí)間線；⑶單獨(dú)注射了癌細(xì)胞和T細(xì)胞或還注射了非相關(guān)拉伸的(非相關(guān))、相關(guān)未拉伸的(未拉伸的)、和相關(guān)拉伸的顆粒(拉伸的)的小鼠的腫瘤尺寸測(cè)量。AUC=曲線下的面積。*p = 0.02對(duì)非相關(guān)；**p=0.0009對(duì)非相關(guān)。關(guān)于拉伸相關(guān)和未拉伸相關(guān)的比較,P = 0.13 ;以及(C)生存曲線-當(dāng)腫瘤大小達(dá)到200mm2時(shí)，將小鼠處死并宣布“死亡”。與未拉伸的相關(guān)顆粒(P = 0.05)、拉伸的非相關(guān)顆粒(P = 0.004)、和單獨(dú)T細(xì)胞(p = 0.05)相比,皮下注射拉伸的顆粒導(dǎo)致增加的生存；
[0028]圖10A-10D顯示了，aAPC經(jīng)一周在生理?xiàng)l件下沒有改變其形狀:新鮮制備的aAPC (a)和37。。下PBS中溫育(b) I天、(c) 3天、(d) 7天的aAPC的掃描電鏡照片(SEM)。計(jì)算的縱橫比:(a) 3.71、(b) (c) (d)；
[0029]圖11顯示了熒光標(biāo)記的MHC 二聚體或二聚體+2mg微粒/孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0030]圖12A-12C顯示了 PMEL T細(xì)胞與如所示的差異拉伸的aAPC的(A)0.01mg/100, 000 個(gè)細(xì)胞、(B)0.lmg/100, 000 個(gè)細(xì)胞、和(C) lmg/100, 000 個(gè)細(xì)胞溫育后的擴(kuò)增倍數(shù)。以非相關(guān)MHC肽的陰性對(duì)照未顯示擴(kuò)增；
[0031]圖13A-13B顯示了刺激aAPC活化的T細(xì)胞后的細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子染色。(A)⑶107a和(B) IFN-Y。⑶8+分離的脾細(xì)胞用0.1mg未拉伸的、球形aAPC (實(shí)心圓)，0.1mg的拉伸的、非球形aAPC(實(shí)心正方形)，或0.01mg的拉伸的、非球形aAPC(空心正方形)來激活。7天后，T細(xì)胞用來自用相關(guān)GP100肽的指示的劑量脈沖的C57BLACK6小鼠的脾細(xì)胞再刺激。未脈沖的脾細(xì)胞(無肽)或無脾細(xì)胞(未刺激)被用作對(duì)照。細(xì)胞因子產(chǎn)生被報(bào)道為制造所示的細(xì)胞因子的T細(xì)胞的百分比；
[0032]圖14顯示了從PBS中37°C下溫育指定的天數(shù)的未拉伸(NS)和2倍拉伸(Str ;縱橫比=2.8)的微粒的BSA釋放。顯示的數(shù)據(jù)表示從微粒的積累釋放，如由BCA測(cè)定法測(cè)量的；
[0033]圖15A-15C顯示了: (a)來自NanoSight的PLGA納米顆粒大小分布；(b、c)未拉伸的(b)或拉伸的(c)的PLGA納米顆粒的掃描電鏡照片；
[0034]圖16是長(zhǎng)橢球(a>b = c),已標(biāo)記軸并對(duì)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)；
[0035]圖17顯示了“超密”配體包被的顆粒的形成的實(shí)施方案；以及
[0036]圖18A-18D顯示了用于在產(chǎn)生本發(fā)明公開的aAPC中使用的代表性裝置的實(shí)施方案。
[0037]詳細(xì)說明
[0038]現(xiàn)在將參考附圖在下文中更加完全地描述本發(fā)明公開的主題，附圖中，顯示了本發(fā)明中的一些，并非所有實(shí)施方案。相同數(shù)字始終是指相同要素。本發(fā)明公開的主題可體現(xiàn)為許多不同的形式并且不應(yīng)被解釋為限于本文所闡述的實(shí)施方案；而是，提供這些實(shí)施方案使得本公開內(nèi)容將滿足適用的法律要求。事實(shí)上，本發(fā)明公開的主題涉及具有在前述描述和相關(guān)附圖中呈現(xiàn)的教導(dǎo)的益處，將使本領(lǐng)域技術(shù)人員想到，本文闡述的本發(fā)明公開的主題的許多修改和其他實(shí)施方案。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明公開的主題不限于所公開的具體實(shí)施方案，并且修改和其他實(shí)施方案旨在被包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[0039]1.人工抗原遞呈細(xì)胞
[0040]生物細(xì)胞的控制是許多疾病的研究和治療的關(guān)鍵。本發(fā)明公開的主題通過開發(fā)模擬靶細(xì)胞的功能的創(chuàng)新種類的合成的微米級(jí)顆粒和納米級(jí)顆粒實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞控制。這些人工/合成細(xì)胞以新的方式來設(shè)計(jì)，使得以下參數(shù)能夠被獨(dú)立調(diào)整:人工細(xì)胞的尺寸、人工細(xì)胞的形狀、固定至細(xì)胞表面的蛋白的組成和位置、從人工細(xì)胞釋放的可溶性因子的組成、該藥物釋放的時(shí)間過程、和人工細(xì)胞本身的生物降解的時(shí)間尺度(圖1)。這些合成的微粒和納米顆粒是由可生物降解的聚合物構(gòu)成，且可被用于在細(xì)胞工程的許多領(lǐng)域以顯著推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)。
[0041]人工細(xì)胞的具體應(yīng)用包括其作為人工抗原遞呈細(xì)胞的使用。人工抗原遞呈細(xì)胞有可能使傳染病和癌癥的新療法成為可能。模擬靶細(xì)胞的功能的合成的微粒和納米顆粒的新的生物材料種類的產(chǎn)生可同時(shí)具有科學(xué)和轉(zhuǎn)化的影響。
[0042]開發(fā)基于顆粒的無細(xì)胞的、人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)的先前工作已僅專注在球形平臺(tái)。然而，活化的抗原遞呈細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用的幾何形狀，與兩個(gè)相互作用球形的幾何形狀完全不同。為了探索該過程中形狀的作用，本發(fā)明公開的主題采用改變微?；蚣{米顆粒的形狀的方法，所述微?；蚣{米顆粒例如，在一些實(shí)施方案中為PLGA微粒，以產(chǎn)生具有變化的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和縱橫比(AR)的橢球微粒。本發(fā)明公開的具有高AR的“拉伸的”仿生非球形aAPC顯示顯著提高了活性，高于以球形aAPC、且顆粒體積和抗原含量保持恒定觀察到的。
[0043]不希望受限于任何一種特定的理論，共焦成像表明，這種效果可由于沿拉伸的aAPC的長(zhǎng)軸的改進(jìn)的相互作用，且T細(xì)胞將優(yōu)先地遷移至長(zhǎng)軸并由與顆粒的長(zhǎng)軸相互作用來激活。在體內(nèi)還觀察到非球形、高縱橫比aAPC的提高的活性，在代表性實(shí)施例中，與非相關(guān)的aAPC (P = 0.004)以及相關(guān)的球形aAPC(p = 0.05)相比，具有高縱橫比的aAPC改善黑素瘤存活。本發(fā)明公開的主題指示，顆粒的幾何形狀是aAPC的產(chǎn)生中重要的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)且為參與T細(xì)胞和生物學(xué)APC之間的相互作用的幾何形狀的重要作用提供見解。
[0044]因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的主題提供了人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，包括:(a)具有模擬細(xì)胞或微生物的形狀的非對(duì)稱形狀的三維微?；蚣{米顆粒；以及(b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞或微生物選自由以下組成的組:細(xì)胞、細(xì)菌、和病毒。
[0045]如本文所用，術(shù)語“微生物”是指單細(xì)胞生物，諸如原核生物，包括細(xì)菌和古細(xì)菌、單細(xì)胞原生動(dòng)物、單細(xì)胞真菌、單細(xì)胞藻類和病毒。
[0046]細(xì)胞或微生物的形狀的實(shí)例包括，但不限于，螺旋形(spiral)、立方體形、棒狀、逗號(hào)形、星形、正方形、柱形、多面體形、螺旋形(helix)、二十面體形、筒形、四面體形和角錐形。
[0047]在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的主題提供了人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，包括:
(a)具有非對(duì)稱形狀的三維微粒或納米顆粒，其中非對(duì)稱形狀具有至少一個(gè)表面，所述表面具有沿著至少一個(gè)軸的選自以下范圍之一的曲率半徑:(a) Inm-1Onm ； (b) Ilnm-1OOnm ；
(b)101nm_400nm ； (c) 40Inm-1 μ m ； (d) 10 μ m_20 μ m ； (e) 20 μ m_100 μ m(f) 101 μ m-lmm.；以及(b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。
[0048]在又其他實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的主題提供了人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，該人工抗原遞呈細(xì)胞包括:(a)具有通過以下限定的非對(duì)稱形狀的三維微粒或納米顆粒:沿X-軸的維度(a)、沿y-軸的維度(b)、和沿Z-軸的維度(C)，其中(a)、(b)、或(c)中的至少一個(gè)不等于至少一個(gè)其他維度(a)、(b)、或(c);以及(b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。
[0049]當(dāng)顆粒變得平坦時(shí)，曲率半徑變大。相反，當(dāng)顆粒上的表面變得更加彎曲時(shí)，曲率半徑變小。在一些實(shí)施方案中，顆粒具有至少一個(gè)表面，所述表面具有不包括從約I微米至約10微米的范圍內(nèi)的曲率半徑。
[0050]在一些實(shí)施方案中，非球形形狀包括長(zhǎng)橢球，其通過方程式a>b = c來限定。在其他實(shí)施方案中，非球形形狀包括三軸橢球，其可通過方程式a>b>c來描述。在又其他實(shí)施方案中，非球形形狀包括扁圓橢球，其可通過方程式a = b>c來描述。在其他實(shí)施方案中，非球形形狀具有沿X軸的維度(a)等于沿y軸的維度(b)，這兩者比沿Z-軸的維度(C)小的多，使得a = b?c和三維微?；蚣{米顆粒包括桿。
[0051]如本文所用，術(shù)語“納米顆?！笔侵妇哂屑sInm至約100nm的范圍內(nèi)的至少一個(gè)維度，包括Inm和100nm之間的任何整數(shù)值(包括約lnm、2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、500nm和lOOOnm，和之間的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)的整數(shù))的顆粒。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒具有約10nm的至少一個(gè)維度，例如直徑。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒具有約200nm的直徑。在其他實(shí)施方案中，納米顆粒具有約500nm的直徑。在又其他實(shí)施方案中，納米顆粒具有約1000nm(l μ m)的直徑。在此類實(shí)施方案中，顆粒還可被稱為“微粒”。因此，術(shù)語“微粒”包括具有約I微米(μ m)，即I X 10_6米，至約1000 μ m的范圍內(nèi)的至少一個(gè)維度的顆粒。如本文所用，術(shù)語“顆?！币庵赴{米顆粒和微粒。
[0052]如本文中所用，“人工抗原遞呈細(xì)胞”(aAPC)是在體外制造，并非被身體自然制造的基于人造仿生顆粒的平臺(tái)。
[0053]如本文中所用 ，“抗原遞呈細(xì)胞”是包含能夠結(jié)合T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體(TCR)的分子并具有引導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的其他因素的細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“能夠”是指具有能力(capacity)或能力(ability)，例如，“能夠”結(jié)合受體的分子是具有具有與受體相互作用和/或結(jié)合的能力(capacity)或能力(ability)的三維結(jié)構(gòu)的分子。
[0054]如本文所用，術(shù)語“分子”通常是指通過共價(jià)鍵保持在一起的兩個(gè)或更多個(gè)原子。因此，分子可以是相對(duì)小的，諸如肽的大小，或者其可以是相對(duì)大的，諸如包括若干多肽的蛋白的大小。如本文所用，分子不受尺寸的限制。
[0055]如本文中所用，“抗原”是可被MHC結(jié)合并遞呈至T細(xì)胞受體的分子或分子的部分?？乖膶?shí)例包括，但不限于，微生物結(jié)構(gòu)，諸如細(xì)菌和真菌的細(xì)胞壁，原生動(dòng)物細(xì)胞膜，細(xì)菌和真菌的莢膜，病毒衣殼，病毒糖蛋白，微生物毒素，變應(yīng)原，諸如塵螨，花粉，毛發(fā)，皮屑，蜂毒，藥物和引起過敏反應(yīng)的其他劑，外來組織或細(xì)胞，以及身體未能識(shí)別為正常的身體自身的細(xì)胞，諸如癌細(xì)胞，病毒感染的細(xì)胞，和參與自身免疫性疾病的細(xì)胞。
[0056]在一些實(shí)施方案中，分子是由主要組織相容性復(fù)合體(MHC)呈現(xiàn)的抗原。在一些實(shí)施方案中，主要組織相容性復(fù)合體是人類白細(xì)胞抗原(HLA)。一般而言，MHC II類分子介導(dǎo)對(duì)抗原的特異性免疫，且I類分子介導(dǎo)破壞顯示抗原的宿主細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，抗原遞呈細(xì)胞還包括與T細(xì)胞上的另一個(gè)受體結(jié)合或相互作用的分子。
[0057]在特定實(shí)施方案中，三維微?；蚣{米顆粒包括長(zhǎng)橢球，其中沿X-軸的維度(a)比沿y_軸的維度(b)大，且其中沿y_軸的維度(b)等于沿Z-軸的維度(C)，使得長(zhǎng)橢球可通過方程式a>b = c來描述。在其他實(shí)施方案中，橢球是三軸橢球，其中沿X-軸的維度(a)比沿y_軸的維度(b)大，且其中沿y_軸的維度(b)比沿Z-軸的維度(c)大，使得三軸橢球可通過方程式a>b>c來描述。在又其他實(shí)施方案中，橢球是扁橢球，其中沿X-軸的維度(a)等于沿y_軸的維度(b)，且其中沿y-軸的維度(b)比沿z_軸的維度(c)大，使得扁橢球可通過方程式a = b>c來描述。然而,本發(fā)明公開的非對(duì)稱顆粒,不包括其中a = b = c的實(shí)施方案。
[0058]在還其他實(shí)施方案中，微粒或納米顆粒具有從約1.1至約5的變化范圍的縱橫比。在其他實(shí)施方案中，縱橫比具有從約5至約10的范圍。在一些實(shí)施方案中，縱橫比具有從約1.5至約3.5的范圍，包括1.5、2、2.5、3、和3.5。
[0059]通常，三維微?；蚣{米顆粒包括具有以下一個(gè)或更多個(gè)特征的材料:(i) 一個(gè)或更多個(gè)可降解的鍵；(ii)變化范圍從約16-KTNAi2且在一些實(shí)施方案中107_109N/m2的可拉伸楊氏模量；以及(iii)使得包含三維微?；蚣{米顆粒的材料在室溫和/或體溫下是固體的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。顆粒還可由共聚物組成，所述共聚物的一種或更多種組分如以上限定的。
[0060]如本文所用，“玻璃化轉(zhuǎn)變溫度”是指無定形聚合物經(jīng)歷從橡膠狀粘稠無定形液體至脆性玻璃狀無定形固體的轉(zhuǎn)變的溫度。如本文所用，“楊氏彈性模量”量化聚合物的彈性。對(duì)于小應(yīng)變，其被定義為應(yīng)力至應(yīng)變的變化的速率之比。
[0061]如本文所用，“可生物降解”的化合物是當(dāng)引入細(xì)胞時(shí)，其由細(xì)胞機(jī)器或通過水解分解為細(xì)胞可重復(fù)使用或丟棄的組分而對(duì)細(xì)胞沒有顯著毒性效應(yīng)的那些(即，當(dāng)組分在體外加入至細(xì)胞時(shí)少于約20%的細(xì)胞被殺死)。組分在體內(nèi)優(yōu)選地不誘導(dǎo)炎癥或其他不良作用。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，依賴于分解可生物降解的化合物的化學(xué)反應(yīng)是未被催化的。
[0062]通常，本發(fā)明公開的材料，例如，微粒和/或納米顆粒，為可生物降解的，包含可降解的鍵。代表性的可降解的鍵包括，但不限于:
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，所述人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)包括: (a)具有模擬細(xì)胞或微生物的形狀的非對(duì)稱形狀的三維微粒或納米顆粒；以及 (b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。
2.如權(quán)利要求1所述的aAPC，其中所述細(xì)胞或微生物選自由以下組成的組:細(xì)菌、古細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、藻類和病毒。
3.如權(quán)利要求2所述的aAPC，其中所述細(xì)胞或微生物具有選自由以下組成的組的形狀:螺旋形(spiral)、立方體形、棒狀、逗號(hào)形、星形、正方形、柱形、多面體形、螺旋形(helix)、二十面體形、筒形、四面體形和角錐形。
4.一種人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，所述人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)包括: (a)具有非對(duì)稱形狀的三維微?；蚣{米顆粒，其中所述非對(duì)稱形狀具有至少一個(gè)表面，所述表面具有沿著至少一個(gè)軸的選自以下范圍之一的曲率半徑:(a)約Inm至約1nm ; (b)約 Ilnm 至約 10nm ； (c)約 1lnm 至約 400nm ； (d)約 401nm 至約 I μ m ; (e)約 10 μ m 至約20 μ m ； (f)約 20 μ m 至約 100 μ m ;和(g)約 101 μ m 至約 Imm ;以及 (b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。
5.一種人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，所述人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)包括: (a)具有通過以下限定的非對(duì)稱形狀的三維微粒或納米顆粒:沿x-軸的維度(a)、沿y-軸的維度(b)、和沿Z-軸的維度(c),其中(a)、(b)、或(c)中的至少一個(gè)不等于至少一個(gè)其他維度(a)、(b)、或(c);以及 (b)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。
6.如權(quán)利要求5所述的aAPC，其中所述三維微?；蚣{米顆粒包括選自由以下組成的組的橢球: 長(zhǎng)橢球，其中所述沿X-軸的維度(a)比所述沿y_軸的維度(b)大，且其中所述沿y_軸的維度(b)等于所述沿Z-軸的維度(c)，使得所述長(zhǎng)橢球可通過方程式a>b = c來描述； 三軸橢球，其中所述沿X-軸的維度(a)比所述沿y_軸的維度(b)大，且其中所述沿y_軸的維度(b)比所述沿Z-軸的維度(c)大，使得所述三軸橢球可通過方程式a>b>c來描述；以及 扁橢球，其中所述沿X-軸的維度(a)等于所述沿y_軸的維度(b)，且其中所述沿y-軸的維度(b)比所述沿Z-軸的維度(c)大，使得所述扁橢球可通過方程式a = b>c來描述。
7.如權(quán)利要求5所述的aAPC,其中所述沿X-軸的維度(a)等于所述沿y_軸的維度(b)，這兩者比所述沿Z-軸的維度(C)小得多，使得所述三維微?；蚣{米顆粒包括桿。
8.如權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的aAPC，其中所述三維微?；蚣{米顆粒包括具有以下一個(gè)或更多個(gè)特征的材料: (i) 一個(gè)或更多個(gè)可降解的鍵； (?)可拉伸模量；以及 (iii)使得包含所述三維微粒或納米顆粒的材料在室溫和/或體溫下是固體的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。
9.如權(quán)利要求8所述的aAPC，其中所述可降解的鍵選自由以下組成的組:酯鍵、二硫鍵、酰胺鍵、酸酐鍵、和易受酶降解的鍵。
10.如權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)所述的aAPC，其中所述微?；蚣{米顆粒包括選自由以下組成的組的可生物降解聚合物或聚合物的共混物:聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(β -氨基酯)(PBAE)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚3-羥基丁酸酯(Ρ3ΗΒ)、和聚(羥基丁酸酯-共-羥基戊酸酯)。
11.如權(quán)利要求10所述的aAPC，其中所述三維微?；蚣{米顆粒還包括混有不可降解聚合物的可生物降解聚合物或聚合物的共混物。
12.如權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)所述的aAPC，其中所述微?；蚣{米顆粒具有從約1.1至約5范圍的縱橫比。
13.如權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的aAPC，所述aAPC還包括能夠與所述T細(xì)胞上的除了 TCR外的受體相互作用的分子。
14.如權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的aAPC，其中所述能夠與TCR相互作用的分子是肽。
15.如權(quán)利要求14 所述的aAPC，其中所述肽在與所述TCR相互作用之前裝載至MHC-1g分子或HLA:1g分子上。
16.如權(quán)利要求13所述的aAPC，其中所述T細(xì)胞上的除了TCR外的受體選自由以下組成的組:CD28、CD2、CD5、CD44、0X40、4-1BBL、ICAM-1、和 LFA-10
17.如權(quán)利要求16所述的aAPC，其中所述T細(xì)胞上的除了TCR外的受體是⑶28。
18.如權(quán)利要求17所述的aAPC，其中所述⑶28受體與抗-⑶28抗體或B7蛋白相互作用。
19.如權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的aAPC，所述aAPC還包括藥物或治療劑。
20.如權(quán)利要求19所述的aAPC，其中所述藥物或治療劑是蛋白。
21.如權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的aAPC，所述aAPC還包括在所述aAPC的一個(gè)或更多個(gè)表面上和/或在所述aAPC內(nèi)的至少一種肽或蛋白。
22.—種試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的aAPC。
23.—種調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法，所述方法包括: (a)提供人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)，所述人工抗原遞呈細(xì)胞包括: (i)具有通過以下限定的非對(duì)稱形狀的三維微粒或納米顆粒:沿X-軸的維度(a)、沿y-軸的維度(b)、和沿Z-軸的維度(c),其中(a)、(b)、或(c)中的至少一個(gè)不等于至少一個(gè)其他維度(a)、(b)、或(c);以及 (?)能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子，和能夠與所述T細(xì)胞上的除了 TCR外的受體相互作用以共刺激所述T細(xì)胞的一種或更多種分子; (b)使所述T細(xì)胞與所述aAPC接觸；以及 (c)允許所述T細(xì)胞被調(diào)節(jié)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中能夠與所述TCR相互作用的所述分子是肽。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述肽在與所述TCR相互作用之前裝載至MHC-1g分子或HLA:1g分子上。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述T細(xì)胞上的除了TCR外的受體選自由以下組成的組:CD28、CD2、CD5、CD44、0X40、4-1BBL、ICAM-1、和 LFA-10
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述T細(xì)胞上的除了TCR外的受體是⑶28。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述CD28受體與抗-CD28抗體或B7蛋白相互作用。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述方法為體外、體內(nèi)、或離體。
30.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述T細(xì)胞是幼稚T細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述T細(xì)胞的調(diào)節(jié)導(dǎo)致所述T細(xì)胞的增殖。
32.如權(quán)利要求23所述的方法，其中接觸發(fā)生在受試者中。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述受試者是人。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述受試者是非人類動(dòng)物。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中接觸包括以足以治療疾病、紊亂、或功能障礙的量向所述受試者施用一種或更多種劑量的aAPC。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述施用是通過口服攝取、通過注射、通過輸注、通過局部施用、通過吸入、通過舌下吸收、通過直腸或陰道遞送、皮下、以及其組合。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病、紊亂、或功能障礙是癌癥或傳染病。
38.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述離體方法包括從所述受試者取出至少一個(gè)T細(xì)胞，使所述至少一個(gè)T細(xì)胞與至少一個(gè)aAPC接觸,并將所述T細(xì)胞返回至所述受試者。
39.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述體外方法發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)中。
40.一種用于制造人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)的方法，所述人工抗原遞呈細(xì)胞(aAPC)包括具有通過以下限定的非對(duì)稱形狀的三維微?；蚣{米顆粒:沿X-軸的維度仏)、沿7-軸的維度(b)、和沿Z-軸的維度(C)，其中(a)、(b)、或(c)中的至少一個(gè)不等于至少一個(gè)其他維度(a)、(b)、或(C);以及能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子，所述方法包括: (a)提供或制備多個(gè)微粒或納米顆粒； (b)制備包含所述多個(gè)微?；蚣{米顆粒的膜； (C)拉伸包含所述多個(gè)微?；蚣{米顆粒的膜以形成具有非對(duì)稱形狀的多個(gè)三維微粒或納米顆粒； (d)收獲所述具有非對(duì)稱形狀的多個(gè)三維微粒或納米顆粒；以及 (e)將所述具有非對(duì)稱形狀的多個(gè)三維微?；蚣{米顆粒偶聯(lián)至能夠與T細(xì)胞的一種或更多種T細(xì)胞受體(TCR)相互作用的一種或更多種分子。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中將所述膜在拉伸前加熱。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中允許所述具有非對(duì)稱形狀的多個(gè)三維微?；蚣{米顆粒部分地或完全地松弛返回至球形或接近球形。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，所述方法還包括加熱所述具有非對(duì)稱形狀的多個(gè)三維微粒或納米顆粒以誘導(dǎo)所述微?；蚣{米顆粒松弛至與所述非對(duì)稱顆粒的原始形狀相似的形狀。
44.一種用于拉伸膜的裝置，所述裝置包括: 至少第一塊和第二塊，所述至少第一塊和第二塊適合固定膜的至少兩個(gè)邊緣，所述至少第一塊和第二塊包括與所述膜接觸的一個(gè)或更多個(gè)表面；所述至少第一塊和第二塊彼此平行放置，并與至少兩個(gè)平行的桿垂直和操作性通訊，其中至少所述第二塊適于相對(duì)于所述第一塊沿所述至少兩個(gè)平行的桿來被選擇性地放置； 所述裝置還包括以下的一個(gè)或更多個(gè):(i)附著至所述第二塊的繩索和(ii)附著至所述繩索的螺絲，其每一個(gè)適于相對(duì)于所述第一塊沿所述至少兩個(gè)平行的桿選擇性地放置所述第二塊。
45.如權(quán)利要求44所述的裝置，所述裝置還包括與所述至少兩個(gè)平行的桿操作性通訊的一個(gè)或更多個(gè)襯層。
46.如權(quán)利要求44所述的裝置，其中所述第一塊和所述第二塊包括至少一個(gè)圖案化的面，以方便固定所述膜的至少兩個(gè)邊緣。
47.如權(quán)利要求44所述的裝置，其中所述至少第一塊和第二塊還包括與同所述膜接觸的所述一個(gè)或更多個(gè)表面操作性通訊的一個(gè)或更多個(gè)橡膠墊。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK104136603SQ201280069502
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月9日
【發(fā)明者】喬丹·J·格林, 喬爾·C·森夏恩, 卡爾洛·佩里卡, 喬納森·施內(nèi)克 申請(qǐng)人:約翰霍普金斯大學(xué)