包含抑制scf或者其受體的物質(zhì)的用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，所述組合物包含抑制SCF(干細(xì)胞因子)或其受體的物質(zhì)。另外，本發(fā)明涉及一種血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選方法，所述方法包括：(a)用治療劑候選物質(zhì)處理血管滲透性相關(guān)疾病疑似病人的被分離的試樣的步驟；以及(b)將SCF或者其受體的表達(dá)水平與對(duì)照組進(jìn)行比較的步驟。本發(fā)明查明了對(duì)調(diào)節(jié)血管滲透性的作為新的靶點(diǎn)的SCF，在利用其的情況下，針對(duì)血管滲透性增加的眼球疾病，降低血管滲透性，從而能夠有效治療或者預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病，并且利用上述組合物有效調(diào)節(jié)血管滲透性。另外，通過測(cè)量SCF及C-Kit表達(dá)調(diào)節(jié)，可以作為用于血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選的有效方法而提供。
【專利說明】包含抑制SCF或者其受體的物質(zhì)的用于治療或預(yù)防血管滲 透性相關(guān)疾病的組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，所述組合物包含 抑制SCF(干細(xì)胞因子（stem cell factor))或其受體的物質(zhì)。另外，本發(fā)明涉及一種血管 滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選方法，包括：(a)用治療劑候選物質(zhì)處理血管滲透性相關(guān)疾 病疑似病人的被分離的試樣的步驟；以及（b)將SCF或者其受體的表達(dá)水平與對(duì)照組進(jìn)行 比較的步驟。

【背景技術(shù)】
[0002] 血管系對(duì)維持正常的生理功能起重要的作用。例如，血管系內(nèi)皮細(xì)胞在正常的情 況下，形成起著調(diào)節(jié)流體、電解質(zhì)及蛋白質(zhì)移動(dòng)到組織和器官內(nèi)的作用的細(xì)胞性屏障。構(gòu)成 這樣的血管系的血管是構(gòu)成人體的所有細(xì)胞的生存及維持正常功能中所必須的器官，實(shí)際 上，特別是由血管不足引起的各種各樣的缺血性疾病及由血管內(nèi)平衡喪失引起的疾病由于 其發(fā)生頻率高而被認(rèn)為重要的治療靶點(diǎn)疾病。
[0003] 關(guān)于血管滲透性，雖然導(dǎo)致喪失內(nèi)皮屏障的功能的因素稍微復(fù)雜而沒有完全被 理解，但廣泛地進(jìn)行了關(guān)于增強(qiáng)并維持血管系的滲透性的研究（Kagsbrun&Moses, Chemist ry&Biology (1999)，6:R217-R224 ;Ferrara，Endocrine Reviews (2004)，25(4):581-611)。 然而，關(guān)于擾亂血管滲透性的正確的機(jī)制，并沒有被明確地闡明，但推定為，從癌到自身 免疫疾病一樣的炎癥疾病為止，與各種各樣的疾病和病理學(xué)疾病的病因非常密切相關(guān)。 另外，已報(bào)道有，與血管系關(guān)聯(lián)的炎癥刺激與血管滲透性的擾亂關(guān)聯(lián)的細(xì)胞外血管形成 (Kirkpatrick et al·，Int. J.Microcirc. (1997),17 :231_240)。例如，可以舉出表面粘附 分子及其配體的表達(dá)增加、炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子生成、炎癥趨化因子釋放、氧化性應(yīng) 激及先天免疫的活化等。這些炎癥反應(yīng)典型地與血管滲透性上的改變，白血球血管外流出 (粘附、遷移及化學(xué)趨向性）及組織的再生有關(guān)。
[0004] 已報(bào)道有血管的生成及血管滲透性的調(diào)節(jié)與低氧血癥（hypoxia)有密切的關(guān)聯(lián) 性。特別是在胚胎發(fā)生階段或細(xì)胞增殖活躍的癌組織、或者血管損傷的組織中出現(xiàn)的低 氧血癥狀態(tài)，成為現(xiàn)有血管和內(nèi)皮細(xì)胞之間的結(jié)合斷開而滲透性增加的不穩(wěn)定狀態(tài)，在這 樣的情況下，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及移動(dòng)，從而形成新的血管。已知，調(diào)節(jié)這樣的血 管不穩(wěn)定化及血管新生過程的機(jī)制涉及與在低氧狀態(tài)下通過HIF-I (hypoxia inducible factor-1)等轉(zhuǎn)錄因子而被差異表達(dá)的各種各樣的基因，這些基因的大部分是生長(zhǎng)因子/ 細(xì)胞因子，它們通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間結(jié)合而提高血管的滲透性、或者通過促進(jìn) 血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)/移動(dòng)能力而形成新生血管。
[0005] 另一方面，非正常的血管新生及血管滲透性調(diào)節(jié)過程不僅與胚胎發(fā)生過程中的器 官形成有直接關(guān)系，而且與出生后成人中的許多疾病的發(fā)生有直接關(guān)系。已知，過多的血 管新生與癌的增殖及糖尿病性視網(wǎng)膜癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)。相反地，在血管新生 不足的情況下，將發(fā)生慢性傷口、缺血性心血管疾病等。另外已知，血管的滲透性調(diào)節(jié)也與 各種各樣的疾病有密切關(guān)聯(lián)，特別是在缺血性腦疾病或心肌梗塞的情況下，如果血管的滲 透性高，則誘發(fā)浮腫而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞或者心肌細(xì)胞的死亡。然而，為了開發(fā)這樣的疾病的根 源性的治療方法，實(shí)際上迫切的是查明血管新生及血管滲透性調(diào)節(jié)的分子學(xué)機(jī)制。目前正 在試圖著用于查明這樣的血管新生及血管滲透性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的各種各樣的研究。作 為其例子，已知血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)為 調(diào)節(jié)血管的滲透性的代表性基因，在低氧（Hypoxia)狀態(tài)下過表達(dá)，從而與血管內(nèi)皮細(xì)胞 的VEGF受體結(jié)合，因此增加血管滲透性。已知VEGF受體與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的結(jié)合的 VE-鈣粘蛋白形成復(fù)合體，從而由VEGF誘導(dǎo)VE-鈣粘蛋白的內(nèi)吞來增加血管滲透性。另外 已知，由VEGF/eNOS生成的NO誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白的S-亞硝基化作用（S-nitrosylation) 來促進(jìn)與VE-1丐粘蛋白（VE-cadherin)的分離，從而增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性（M. Rizwan et al.，J. Cell Bol. (2011) 193 ;841-850)。已報(bào)道有，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性的凝 血酶（thrombin)誘導(dǎo)eNOS的NO生成及RhoA的活化，由此促進(jìn)細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨 架（actin cytoskeleton)和粘附連接分子（adherent junction molecule)的不穩(wěn)定化， 從而促進(jìn)血管滲透性（Thibeault et al. ,Molecular cell(2010)39;468_476)。據(jù)此， 正試圖著通過抑制VEGF或者VEGF受體來治療因血管滲透性增加而發(fā)生的糖尿病性視網(wǎng) 膜病（diabetic retinopathy),且也適用于由于生成滲透性高的未成熟血管而發(fā)生的脈 絡(luò)膜血管新生（choroidal neovascularization)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜?。≧OP:retinopathy of prematurity) > ^ ^ SE ^ ft (age-related macular degeneration) ^ (Aiello1New England Journal of Medicine(1994)331(22) :1480-1487 ；Adamis,American journal of Ophthalmology(1994) 118:445-450 ；Steinbrook, New England Journal of Medicine(2006)355(14):1409-1412 ；Ferrara, American Journal of Physiol Cell Phys iol (2001) 280 (6) : C1358-C1366)。另外，已報(bào)道有，抑制VEGF或者VEGF受體的治療法能夠 使在腫瘤內(nèi)或者周圍生成的滲透性高的血管正常，使抗癌藥物很好地傳達(dá)至腫瘤的中心部 位，從而增大抗癌治療效能（Jain, Science (2005) 307 (5706) : 58-62)。
[0006] 然而，目前為止與大部分的血管新生及血管滲透性調(diào)節(jié)相關(guān)的研究限于VEGF或 者VEGF受體，大部分集中在針對(duì)上述基因的抑制劑的開發(fā)，因此作為現(xiàn)況，與血管新生及 血管滲透性調(diào)節(jié)相關(guān)的研究不足。
[0007] 在這樣的背景下，本發(fā)明人等為了尋找在眼球疾病中血管滲透性相關(guān)疾病的治療 物質(zhì)而精心努力的結(jié)果，確認(rèn)了 SCF(干細(xì)胞因子）一方面增加血管滲透性，另一方面在抑 制SCF或者作為SCF受體的C-Kit的表達(dá)或者磷酸化的情況下，降低血管滲透性的增加，從 而完成了本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 技術(shù)問題
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，所述 組合物包含抑制SCF(干細(xì)胞因子）或其受體的物質(zhì)。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種血管滲透性調(diào)節(jié)方法，所述方法包括利用上述 組合物在體外（in vitro)調(diào)節(jié)SCF或者其受體的表達(dá)的步驟。
[0011] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選方法，所述 方法包括：(a)用治療劑候選物質(zhì)處理血管滲透性相關(guān)疾病疑似病人的被分離的試樣的步 驟；以及（b)將SCF或者其受體的表達(dá)水平與對(duì)照組進(jìn)行比較的步驟。
[0012] 解決問題的方案
[0013] 本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，所述組合物包含 抑制SCF(干細(xì)胞因子）或其受體的物質(zhì)。具體地，其特征在于，上述SCF的受體為C-Kit， 上述抑制SCF或者其受體的物質(zhì)為對(duì)SCF或者其受體特異性的siRNA、反義寡核苷酸（sense oligonucleotide)、適體或者抗體。更具體地，其特征在于，上述抑制SCF的受體的物質(zhì)為 C-Kit siRNA或者SCF受體抑制抗體。
[0014] 另一方面，上述血管滲透性相關(guān)疾病的特征在于，選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病 (diabetic retinopathy)、脈絡(luò)膜血管新生（choroidal neovascularization)、青光眼視 網(wǎng)膜色素變性（glaucoma retinitis pigmentosa)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病（R0P:retinopathy of prematurity)、老年性黃斑變性（age-related macular degeneration)、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng) 不良（corneal dystrophy)、視網(wǎng)膜劈裂癥（retinoschises)、斯塔加特?。⊿targardt，s disease)、常染色體顯性玻璃膜撫（autosomal dominant druzen)，貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不 良（Best，s macular dystrophy)、囊樣黃斑水腫（cystoid macular edema)、缺血性視網(wǎng) 膜病變（ischemic retinopathy)、誘導(dǎo)炎癥視網(wǎng)膜退行性疾?。╥nflammation-induced retinal degenerative disease)，X染色體-相關(guān)青少年視網(wǎng)膜劈裂癥（X-linked juvenile retinoschisis)、莫拉蒂致拉分提那斯（Malattia Leventinese ;ML)、多英蜂窩 狀視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良（Doyne honeycomb retinal dystrophy)及血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥疾病 組成的組中，上述血管滲透性相關(guān)疾病的治療通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性來實(shí)現(xiàn)。
[0015] 另外，本發(fā)明提供一種血管滲透性調(diào)節(jié)方法，所述方法包括利用上述組合物在體 外（in vitro)調(diào)節(jié)SCF或者其受體的表達(dá)的步驟。
[0016] 另外，本發(fā)明提供一種血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選方法，所述方法包括（a) 用治療劑候選物質(zhì)處理血管滲透性相關(guān)疾病疑似病人的被分離的試樣的步驟；以及（b)將 SCF或者其受體的表達(dá)水平與對(duì)照組進(jìn)行比較的步驟。具體地，其特征在于，與上述SCF的 受體為C-Kit，更具體地，上述（b)步驟進(jìn)一步包括將C-Kit的磷酸化水平與對(duì)照組比較的 步驟。
[0017] 發(fā)明效果
[0018] 本發(fā)明查明了作為調(diào)節(jié)血管滲透性的新的靶點(diǎn)的SCF，在利用本發(fā)明的抑制SCF 或者其受體的組合物的情況下，針對(duì)血管滲透性增加的眼球疾病，降低血管滲透性，從而 可以有效治療或者預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病，并且利用上述組合物可以有效調(diào)節(jié)血管滲透 性。另外，通過測(cè)量SCF及C-Kit的表達(dá)調(diào)節(jié)，可以作為用于血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的 篩選（screening)的有效方法而提供。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1表示對(duì)由SCF引起的血管滲透性增加（A)、C-Kit依賴度（B)及信號(hào)傳導(dǎo)通路 (C)進(jìn)行分析的結(jié)果。
[0020] 圖2表示對(duì)于基于SCF通過作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)的AKT-eNOS來實(shí)現(xiàn)的NO的 生成及位于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的作為細(xì)胞間粘附蛋白質(zhì)的VE-鈣粘蛋白的內(nèi)吞作用的誘 導(dǎo)進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果。圖2的A表示由SCF引起的NO的生成增加，B表示對(duì)于由SCF引起的 內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增加被L-NAME所抑制的情況進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果。圖2的C表示因 SCF及 VEGF而降低的VE-鈣粘蛋白（VE-cadherin)在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)通過L-NAME處理 及eNOS表達(dá)抑制而得以恢復(fù)的結(jié)果，D表示因 SCF及VEGF而增加的VE-鈣粘蛋白的內(nèi)吞 作用通過L-NAME處理及eNOS表達(dá)抑制而得以降低的結(jié)果。
[0021] 圖3表示通過小鼠皮下組織實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)由SCF引起的血管滲透性增加的結(jié)果。圖 3的A及B表示由SCF引起的血管滲透性增加，C及D表示由SCF受體抑制抗體引起血管滲 透性降低的結(jié)果。
[0022] 圖4表示通過小鼠的眼睛視網(wǎng)膜血管實(shí)驗(yàn)確認(rèn)由SCF引起的血管滲透性增加的結(jié) 果。圖4的A及B表示由SCF引起的血管滲透性增加，C及D表示由SCF受體抑制抗體引 起的血管滲透性降低的結(jié)果。
[0023] 圖5表示糖尿病性視網(wǎng)膜病動(dòng)物的視網(wǎng)膜中的SCF(A)及VEGF(B)的表達(dá)增加。
[0024] 圖6表示在糖尿病性視網(wǎng)膜病動(dòng)物的視網(wǎng)膜中血管滲透性的增加被SCF抑制抗體 所抑制的結(jié)果。
[0025] 最佳實(shí)施方式
[0026] 作為用于實(shí)現(xiàn)上述目的的一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防血管滲 透性相關(guān)疾病的組合物，所述組合物包含抑制SCF (干細(xì)胞因子）或其受體的物質(zhì)。
[0027] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"SCF(干細(xì)胞因子）"被稱作Kit-配體（Kit-Iigand)或者青灰 因子（Steel factor)，是與C-Kit受體（CD117)結(jié)合的細(xì)胞因子（cytokine)，并以貫通膜 蛋白質(zhì)及水溶性形式存在。已知SCF促進(jìn)形成血液細(xì)胞的造血作用、精子形成作用、黑色素 形成作用等，但SCF是否增加血管滲透性尚未有報(bào)道。本發(fā)明人等最早查明了 SCF使血管 滲透性增加，確認(rèn)了如果抑制SCF或者其受體，則對(duì)于治療血管滲透性相關(guān)疾病具有效果。
[0028] 具體查明了：如果以SCF或者其受體為靶點(diǎn)并將其抑制，則有血管滲透性相關(guān)疾 病的治療效果。SCF或者其受體的抑制不僅可以通過SCF或者其受體的表達(dá)抑制來實(shí)現(xiàn)，而 且可以通過磷酸化的抑制來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的SCF的序列信息可以從公知的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得， 作為其例子可以為NCBI GenBank Accession No. NG_012098,但并不限于此，只要以SCF來 表示增加血管滲透性的活性，則可以具有80%、90(%，優(yōu)選95 (%，更優(yōu)選97(%以上的序列同 源性。上述SCF的受體只要能夠增強(qiáng)血管滲透性的作用就可以無限制地使用，但并不限于 此，可以優(yōu)選C-Kit。
[0029] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"C-Kit (0)117) "也被稱作原致癌基因 C-Kit (proto oncogene C-Kit)或者酪氨酸蛋白激酶 Kit (tyrosine-protein kinase Kit)，是編碼（encoding) 人類KIT基因的蛋白質(zhì)。上述C-Kit為在造血干細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞因子的受體，是 與SCF的受體結(jié)合的蛋白質(zhì)，已知上述受體的變異體與幾種癌有關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的C-Kit 的序列信息可以從公知的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，作為其例子可以是NCBI GenBank Accession No. BC071593. 1，但并不限于此，只要以C-Kit來表示增加血管滲透性的活性，則可以具有 80%、90%，優(yōu)選95%，更優(yōu)選97%以上的序列同源性。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的具體的一個(gè)實(shí)施例，在用SCF處理培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行 培養(yǎng)的情況下，確認(rèn)到內(nèi)皮細(xì)胞的血管滲透性增加（圖1A)，在抑制SCF的受體的情況下，確 認(rèn)到血管滲透性降低（圖3及4)。另外，在使用抑制作為SCF的受體的C-Kit的siRNA來 抑制C-Kit的表達(dá)的情況下，確認(rèn)到血管滲透性降低（圖1的B)，在作為血管滲透性相關(guān)疾 病之一的糖尿病性視網(wǎng)膜病動(dòng)物模型中，確認(rèn)到SCF的表達(dá)增加（圖5)。
[0031] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"抑制SCF或者其受體的物質(zhì)"為抑制使血管滲透性增加的SCF 或者其受體（例如C-Kit)的物質(zhì)，意指通過調(diào)節(jié)血管滲透性來發(fā)揮抑制血液向細(xì)胞外基質(zhì) 流出的功能的物質(zhì)，其可以以由血管滲透性的增加誘發(fā)的血管滲透性相關(guān)疾病的治療或者 預(yù)防的目的使用。這樣的抑制不僅可以通過抑制SCF或者其受體的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)，而且 通過抑制由SCF引起的C-Kit的磷酸化來實(shí)現(xiàn)。
[0032] 上述抑制SCF或者其受體的物質(zhì)可以無限制的使用能夠以SCF或者其受體為靶點(diǎn) 來抑制SCF或者其受體的表達(dá)或者C-Kit的磷酸化的化合物、核酸、肽、病毒或者包含上述 核酸的載體等。優(yōu)選地，本發(fā)明中，可以是對(duì)SCF或者其受體特異性的SiRNA、反義寡核苷 酸、適體或者抗體。另外，上述SCF或者其受體表達(dá)的抑制不僅可以是能夠抑制SCF或者其 受體自身的表達(dá)的物質(zhì)，而且可以是抑制由SCF或者其受體產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)。
[0033] 具體地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在用SCF進(jìn)行處理的情況下，確認(rèn)到與血管滲 透性相關(guān)的作為SCF受體的C-Kit的磷酸化增加，Akt蛋白質(zhì)的磷酸化增加，另外可確認(rèn)到 與血管滲透性相關(guān)的eNOS蛋白質(zhì)的磷酸化增加，從而增加血管滲透性（圖1的C)。這樣的 結(jié)果啟示若抑制SCF來抑制C-Kit的磷酸化或者與由SCF及C-Kit產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的 蛋白質(zhì)的磷酸化，則可以降低血管滲透性。
[0034] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"siRNA"為可以介導(dǎo)RNA干擾或者基因沉默（silencing)的核酸 分子，可以抑制靶基因的表達(dá)，因此作為有效的基因敲低（knockdown)方法或者基因治療 方法來使用。上述siRNA是雙鏈RNA被Dicer酶所切割而生成的21-25核苷酸大小的小的 RNA碎片，可以特異性地與具有互補(bǔ)的序列的mRNA結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)表達(dá)。通過siRNA是否 誘發(fā)具有互補(bǔ)的堿基序列的mRNA分解或者是否誘導(dǎo)翻譯抑制是根據(jù)對(duì)應(yīng)的21-25個(gè)的核 苷酸RNA與mRNA間的互補(bǔ)性程度來決定。本發(fā)明中使用的抑制SCF的轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)為siRNA， 通過利用上述片斷的互補(bǔ)性部分來抑制涉及血管滲透性的SCF的效果的方法來起到抑制 血管滲透性增加的作用。另外，還通過抑制SCF的受體的C-Kit的表達(dá)的方法來起到抑制血 管滲透性增加的作用。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在抑制SCF的受體方面使用C-KitsiRNA，當(dāng) 使用抑制上述C-Kit的siRNA來抑制C-Kit的表達(dá)的情況下，確認(rèn)到血管滲透性降低（圖 1的B)。就這樣的針對(duì)SCF或者C-Kit的siRNA而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從公知的數(shù)據(jù) 庫(kù)的上述基因序列通過公知的方法來制造，上述C-Kit siRNA不限于此，可以優(yōu)選為具有序 列號(hào)2、3、4或者5的堿基序列的siRNA。
[0035] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"反義寡核苷酸"為含有與特定mRNA的序列互補(bǔ)的核酸序列的 DNA或RNA或者其衍生物，其與mRNA內(nèi)的互補(bǔ)序列結(jié)合從而起到阻止mRNA翻譯成蛋白質(zhì) 的作用。反義寡核苷酸序列意指與上述SCF或者其受體mRNA互補(bǔ)且可以與上述mRNA結(jié)合 的DNA或者RNA序列。它可以阻止上述SCF或者其受體mRNA的翻譯、向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn) (translocation)、成熟（maturation)或者其它所有對(duì)整個(gè)生物學(xué)功能必須的活性。反義 寡核苷酸的長(zhǎng)度可以為6至100堿基，優(yōu)選8至60堿基，更優(yōu)選10至40堿基。上述反義 寡核苷酸可以通過通常的方法在試管內(nèi)合成而給藥至生物體內(nèi)或者使反義寡核苷酸在生 物體內(nèi)合成。作為在試管內(nèi)合成反義寡核苷酸的一個(gè)例子，利用RNA聚合酶I。作為使反義 RNA在生物體內(nèi)合成的一個(gè)例子，使用多克隆位點(diǎn)（MCS)的起源（origin)在相反方向的載 體使反義RNA轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選使上述反義RNA在序列內(nèi)存在翻譯終止密碼子，從而不讓使其翻 譯為肽序列。通過參考SCF或者C-Kit基因的堿基序列，按照本領(lǐng)域公知的方法可以容易 進(jìn)行本發(fā)明中可被利用的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)。
[0036] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"適體（aptamer) "為單鏈寡核苷酸，是指大小為20?60核苷酸 程度且對(duì)規(guī)定的靶分子具有結(jié)合活性的核酸分子。根據(jù)序列具有各種各樣的三維結(jié)構(gòu)，如 抗原-抗體反應(yīng)那樣可以與特定物質(zhì)具有高的親和力。適體通過與規(guī)定的靶分子結(jié)合，能 夠阻止規(guī)定的靶分子的活性。本發(fā)明的適體可以為RNA、DNA、修飾的（modified)核酸或者 其混合物，并且可以為直鏈狀或者環(huán)狀形態(tài)。優(yōu)選地，上述適體可以與SCF結(jié)合而起到阻止 SCF活性的作用。此外，通過與作為SCF受體的C-Kit結(jié)合，阻止SCF受體的活性，使SCF不 與SCF受體結(jié)合的作用，能夠起到間接地阻止SCF活性的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從公 知的數(shù)據(jù)庫(kù)的上述基因序列，通過公知的方法來制造這樣的基于SCF或者C-Kit的siRNA。
[0037] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"抗體"意指在生物體的免疫系統(tǒng)中循環(huán)血液或淋巴時(shí)作為外 來物質(zhì)的抗原侵入的情況下，對(duì)其作出反應(yīng)的物質(zhì)，由于其是在淋巴組織中形成的球蛋 白系蛋白質(zhì)因此也被稱作免疫球蛋白。抗體是在B細(xì)胞生成后流向體液中的蛋白質(zhì)，其 與抗原特異性地結(jié)合，在一個(gè)抗體分子中有兩個(gè)重鏈（heavy chain)和兩個(gè)輕鏈（light chain)，各個(gè)重鏈和輕鏈在其N-末端有可變區(qū)。各自的可變區(qū)由3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū) (Complementarity determining region :CDR)和 4 個(gè)構(gòu)架區(qū)（framework regions ：FRs) 構(gòu)成，互補(bǔ)性決定區(qū)決定抗體的抗原結(jié)合特異性，以由可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)來維持的比較短的 肽序列形式存在。優(yōu)選地，上述抗體可以是通過與SCF結(jié)合而能夠抑制SCF的活性的抗體 或者抑制SCF受體（C-Kit)的抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在使用SCF受體抑制抗體的 情況下，確認(rèn)到血管滲透性降低（圖3及4)。
[0038] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"L-NAME(L_N-硝基精氨酸甲酯（L-N-nitro arginine methyl ester))"為一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,N0S)的抑制劑，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中 抑制一氧化氮的合成，從而起到調(diào)節(jié)血管滲透性的作用。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，以通過 抑制由SCF生成的NO來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性的用途使用了 L-NAME。
[0039] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"血管（或者血管系）"是指哺乳類遍及全身的運(yùn)輸血液及淋巴 液的血管系，是指包括動(dòng)脈、細(xì)動(dòng)脈、毛細(xì)血管、細(xì)靜脈、靜脈、及脈管壁血管的哺乳類血管 系的所有管。另外，本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"血管滲透性（vascular permeability)"通常是指通過 上述血管的性質(zhì)，包括調(diào)節(jié)血液向血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)流出的功能。上述血管滲透 性只要是在個(gè)體內(nèi)的血管，則不限制地包含所有通過血管的性質(zhì)，例如可以包含血管內(nèi)皮 細(xì)胞的滲透性。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，在用SCF處理培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的 情況下，確認(rèn)到血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管滲透性增加（圖1的A)，在小鼠皮下組織（圖3的A及 B)及小鼠視網(wǎng)膜血管（圖4的A及B)中也可以確認(rèn)到血管滲透性的增加。
[0041] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"血管滲透性相關(guān)疾病"為由于血管滲透性的正常調(diào)節(jié)崩潰而引 起的疾病，通常是指由于血管發(fā)生變化而滲透性增加，從而引起出血的疾病。作為上述血 管滲透性相關(guān)疾病的例子，可以是糖尿病性視網(wǎng)膜病（diabetic retinopathy)、脈絡(luò)膜血 管新生（choroidal neovascularization)、青光眼視網(wǎng)膜色素變性（glaucoma retinitis pigmentosa)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病（R0P:retinopathy of prematurity)、老年性黃斑變性 (age-related macular degeneration)、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良（corneal dystrophy)、視 網(wǎng)膜劈裂癥（retinoschises)、斯塔加特?。⊿targardt's disease)、常染色體顯性玻璃膜 撫（autosomal dominant druzen)、貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良（Best，s macular dystrophy)、囊 樣黃斑水腫（cystoid macular edema)、缺血性視網(wǎng)膜病變（ischemic retinopathy)、誘導(dǎo) 炎癥視網(wǎng)膜退行性疾?。╥nflammation-induced retinal degenerative disease)、X染色 體-相關(guān)青少年視網(wǎng)膜劈裂癥（X-linked juvenile retinoschisis)、莫拉蒂致拉分提那 斯（Malattia Leventinese ;ML)、多英峰窩狀視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良（Doyne honeycomb retinal dystrophy)及血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥疾病，優(yōu)選地，可以是作為眼科疾病的糖尿病性視網(wǎng) 膜病或者老年性黃斑變性，但并不限于此。
[0042] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在作為代表性的血管滲透性相關(guān)疾病的糖尿病性視網(wǎng) 膜病動(dòng)物模型中，確認(rèn)到隨著時(shí)間的經(jīng)過SCF的表達(dá)水平增加（圖5的A)，由此確認(rèn)到SCF 可以成為治療或者預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的靶點(diǎn)，并且在用SCF抑制抗體處理的情況 下，確認(rèn)到血管滲透性降低（圖6)，由此確認(rèn)到抑制SCF的物質(zhì)具有血管滲透性相關(guān)疾病的 治療效果。
[0043] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"治療"是指為了改變要治療的每個(gè)人或者細(xì)胞的自然過程而臨 床介入的情形，其可以在臨床病理狀態(tài)進(jìn)展過程中執(zhí)行或者為了預(yù)防其而執(zhí)行。治療效果 的目的包括預(yù)防疾病的發(fā)生或者復(fù)發(fā)、緩解癥狀、降低由疾病引起的所有直接或者間接的 病理學(xué)結(jié)果、預(yù)防擴(kuò)散、降低疾病發(fā)展速度、減輕疾病狀態(tài)或者暫時(shí)緩解、見好或者改善預(yù) 后。優(yōu)選地，在本發(fā)明中包括通過給藥包含抑制SCF或者作為其受體的C-Kit的物質(zhì)的組 合物使血管滲透性相關(guān)疾病的經(jīng)過好轉(zhuǎn)的所有行為。
[0044] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"是指通過給藥包含根據(jù)本發(fā)明的抑制SCF或者作為其受 體的C-Kit的物質(zhì)的組合物來抑制或延遲上述血管滲透性相關(guān)疾病的發(fā)病的所有行為。
[0045] 本發(fā)明的組合物可以是通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性而能夠治療血管滲透性 相關(guān)疾病的藥物組合物。
[0046] 本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含在制造藥物組合物中通常使用的適當(dāng)?shù)妮d 體、賦形劑或者稀釋劑。包含可藥用的載體的組合物可以是口服或者非口服的多種劑型。 在制劑化的情況下，可以使用通常使用的填充劑、增量劑、結(jié)合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、表面活 性劑等稀釋劑或者賦形劑來調(diào)制。用于口服給藥的固體制劑可以包括片劑、丸劑、散劑、顆 粒劑、膠囊劑等，這樣的固型制劑可以在一種以上的化合物中混合至少一種以上賦形劑，例 如淀粉、碳酸I丐、鹿糖（sucrose)或者乳糖（lactose)、明膠等來進(jìn)行調(diào)制。另外，除了簡(jiǎn)單 的賦形劑之外也可以使用如硬脂酸鎂、滑石等潤(rùn)滑劑。作為用于口服給藥的液相制劑，有懸 浮劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑等，除了作為通常使用的簡(jiǎn)單稀釋劑的水、液體石蠟之外，還可 以包含多種賦形劑，例如潤(rùn)濕劑、甜味劑、芳香劑、保鮮劑等。用于非口服給藥的制劑可以包 含滅菌的水溶液、水不溶性溶劑、懸浮劑、乳劑、凍干制劑、栓劑。作為水不溶性溶劑、懸浮 齊U，可以使用丙二醇（propylene glycol)、聚乙二醇、如橄欖油之類的植物性油、如油酸乙 酯之類的可注射的酯等。作為栓劑的基質(zhì)，可以使用Witepsol、聚乙二醇（Macrogol)、吐溫 61 (Tween 61)、可可脂、甘油三月桂酸酯（Laurin butter)、甘油明膠等。
[0047] 另外，本發(fā)明的藥物組合物可以具有選自由片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、懸 浮劑、液劑、乳劑、糖漿劑、滅菌的水溶液、水不溶性溶劑、懸浮劑、乳劑、凍干制劑及栓劑組 成的組中的任意一種劑型。
[0048] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"血管內(nèi)皮細(xì)胞"為圍繞作為血管內(nèi)側(cè)部分的內(nèi)膜的細(xì)胞，在形 成新的血管中執(zhí)行核心作用。特別地，血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)我們身體中最小且最多的毛細(xì)血 管的形成。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，以不同濃度添加 SCF進(jìn)行培養(yǎng)的情況 下，確認(rèn)到血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增加。具體地，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中以10、20及50ng/mL 濃度添加 SCF來進(jìn)行培養(yǎng)的結(jié)果，可以確認(rèn)到內(nèi)皮細(xì)胞的血管滲透性呈濃度依賴性地增加 (圖1A)。即，這啟示SCF增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，在抑制SCF的情況下能夠減低血管 滲透性。
[0050] 作為另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明涉及一種血管滲透性相關(guān)疾病的治療方法，所述方 法包括：將包含抑制SCF或者作為其受體的C-Kit的物質(zhì)的組合物給藥至個(gè)體的步驟。 [0051 ] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"意指持有或者發(fā)生本發(fā)明的血管滲透性相關(guān)疾病的包括 人類的所有動(dòng)物。通過將本發(fā)明的組合物給藥至個(gè)體，能夠緩解或者治療血管滲透性相關(guān) 疾病。
[0052] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"緩解"是指通過給藥根據(jù)本發(fā)明的組合物使血管滲透性相關(guān)疾 病變好轉(zhuǎn)或者變有利的所有行為。
[0053] 上述本發(fā)明的組合物以藥學(xué)有效量給藥。
[0054] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"給藥"是指以任意適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ驅(qū)ο髮?dǎo)入本發(fā)明的藥物組合 物，就給藥途徑而言，只要是能夠到達(dá)目標(biāo)組織，則可以通過口服或者非口服的各種途徑給 藥。
[0055] 根據(jù)目的或者需要可以將上述藥學(xué)上的組合物按照本發(fā)明【技術(shù)領(lǐng)域】中使用的通 常的方法、給藥途徑、給藥量來適當(dāng)?shù)亟o藥至個(gè)體。作為給藥途徑的例子可以以口服、非口 月艮、向皮下、腹腔內(nèi)、肺內(nèi)、及鼻腔內(nèi)給藥。非口服注入包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹腔內(nèi) 或者皮下給藥。另外，按照本發(fā)明【技術(shù)領(lǐng)域】中公知的方法可以選擇適當(dāng)?shù)慕o藥量及給藥次 數(shù)。根據(jù)如同要治療的癥狀的種類、給藥途徑、性別、健康狀態(tài)、食物、個(gè)體的年齡及體重，及 疾病的嚴(yán)重程度般的各種各樣的因素來適當(dāng)?shù)貨Q定實(shí)際給藥的本發(fā)明的藥學(xué)上的組合物 的量及給藥次數(shù)。
[0056] 本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)有效量"意指以能夠適用于醫(yī)學(xué)用途的合理的受益/危險(xiǎn) 比例來充分抑制或緩解血管滲透性增加的量，有效劑量水平可以根據(jù)包括個(gè)體種類及嚴(yán)重 程度、年齡、性別、藥物的活性、對(duì)藥物的敏感度、給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄比例、治療時(shí) 間、同時(shí)使用的藥物的要素以及其它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的要素來決定。本發(fā)明的組合 物可以以單獨(dú)治療劑給藥或者與其它治療劑并用給藥，可以與現(xiàn)有的治療劑依次或者同時(shí) 給藥。另外可以單次或者多次給藥?？紤]上述的所有要素以基于沒有副作用的最小的量來 獲得最大效果的量給藥是非常重要的，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地決定。
[0057] 作為另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明涉及一種血管滲透性調(diào)節(jié)方法，所述方法包括利用 上述組合物調(diào)節(jié)SCF或者其受體的表達(dá)的步驟。
[0058] 具體地，上述方法涉及一種通過抑制SCF或者其受體來抑制血管滲透性的方法。 上述方法可以是降低SCF的表達(dá)或者作為SCF的受體的C-Kit (⑶117)的表達(dá)或者磷酸化， 抑制作為血管內(nèi)皮型NO合成酶的eNOS (內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase))的磷酸化的方法。
[0059] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"eNOS"為刺激生成血管內(nèi)皮型NO(-氧化氮）的酶，在用本發(fā) 明中公開的SCF處理的情況下，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中作為細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)物質(zhì)的Akt被磷酸化而 eNOS被磷酸化，從而活化的Akt-eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞中促進(jìn)NO的生成，結(jié)果是增加血管滲 透性。
[0060] 若對(duì)此用本發(fā)明的組合物處理，則可以抑制eNOS的磷酸化來抑制NO合成從而降 低血管滲透性來治療血管滲透性相關(guān)疾病。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，對(duì)于將對(duì)照組SiRNA和C-Kit SiRNA導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)的 血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別用SCF以20ng/ml濃度進(jìn)行處理后，確認(rèn)了由SCF引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞 滲透性增加的C-Kit依賴度，結(jié)果確認(rèn)到SCF使血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增加，在降低C-Kit 的表達(dá)量時(shí)顯著降低（圖1B)，在用SCF處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后，確認(rèn)了作為內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)傳 導(dǎo)物質(zhì)的Akt-eNOS的磷酸化程度，結(jié)果確認(rèn)到在用SCF處理的情況下，Akt-eNOS進(jìn)行磷酸 化而被活化，并根據(jù)活化的酶在血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO的合成量增加（圖1C)。另外，在血管內(nèi) 皮細(xì)胞的NO的合成量增加的情況下，確認(rèn)到血管滲透性增加（圖2A)，這樣的滲透性增加在 用作為抑制NO在內(nèi)皮細(xì)胞中合成的抑制劑的L-NAME進(jìn)行處理的情況下降低（圖2B)。
[0062] 上述組合物是包含抑制SCF或者其受體的物質(zhì)的組合物，如同上述說明，可以無 限制地使用具有降低血管滲透性效果的物質(zhì)、即將SCF及其受體作為靶點(diǎn)來抑制SCF或者 其受體（例如C-Kit)的表達(dá)或者磷酸化的物質(zhì)。
[0063] 作為另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明涉及一種血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選方法， 所述方法包括（a)用治療劑候選物質(zhì)處理血管滲透性相關(guān)疾病疑似病人的被分離的試樣 的步驟；以及（b)將SCF或者SCF受體的C-Kit的表達(dá)水平與對(duì)照組比較的步驟。優(yōu)選地， 上述（b)步驟可以進(jìn)一步包括將作為SCF受體的C-Kit的磷酸化水平與對(duì)照組比較的步 驟。
[0064] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"試樣"包含來源于血管滲透性相關(guān)疾病疑似病人的諸如全血、 血清、血液、血漿、唾液、尿、痰、淋巴液、腦脊髓液及細(xì)胞間液之類的試樣等，只要包含可以 檢測(cè)出血管滲透性的增加與否的細(xì)胞的試樣，則無限制地包含于此。
[0065] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"對(duì)照組"包含來源于血管的滲透性正常的個(gè)體的諸如全血、血 清、血液、血漿、唾液、尿、痰、淋巴液、腦脊髓液及細(xì)胞間液之類的試樣等，其特征在于，與用 作實(shí)驗(yàn)組的血管滲透性相關(guān)疾病疑似病人相比，SCF或者SCF受體的C-Kit的表達(dá)水平或 者磷酸化水平更低。
[0066] 另外在本發(fā)明中，所謂術(shù)語(yǔ)"候選物質(zhì)"意指對(duì)SCFX-Kit表達(dá)或者磷酸化變化活 性進(jìn)行測(cè)試的藥劑，是測(cè)量通過直接或者間接改變SCF或者C-Kit的表達(dá)水平而能夠治療 血管滲透性相關(guān)疾病的能力的對(duì)象，例如包括蛋白質(zhì)、寡肽、有機(jī)小分子、多糖類、多核苷酸 及一般化合物等任意分子。這樣的候選物質(zhì)不僅包括天然物質(zhì)還包括合成物質(zhì)。
[0067] 在本發(fā)明中，所謂術(shù)語(yǔ)"血管滲透性相關(guān)疾病治療劑"意指具有通過調(diào)節(jié)血管滲透 性的機(jī)制來降低血管滲透性功能的物質(zhì)。
[0068] 本發(fā)明中血管滲透性的增加與否的確認(rèn)及血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選的 方法，可以以包括下述步驟的方法來篩選血管透過性相關(guān)疾病的治療劑，所述步驟是：對(duì)于 如上述的在對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，用抑制血管滲透性的物質(zhì)進(jìn)行處理后，比較增加血管滲透性 的SCF或者作為SCF受體的C-Kit的表達(dá)水平，從而將SCF或者作為SCF受體的C-Kit的表 達(dá)水平降低至正常個(gè)體的對(duì)照組的水平的物質(zhì)判斷為血管滲透性相關(guān)治療劑。另外，其可 以以包括下述步驟的方法來篩選血管滲透性相關(guān)疾病的治療劑，所述步驟是：將作為SCF 受體的C-Kit磷酸化降低至作為正常個(gè)體的對(duì)照組的水平的物質(zhì)判斷為血管滲透性相關(guān) 治療劑。這樣的表達(dá)及磷酸化的變化水平可以根據(jù)通過C-Kit及Akt-eNOS連接的信號(hào)傳 導(dǎo)系的磷酸化或者表達(dá)發(fā)生變化與否來判斷。

【具體實(shí)施方式】
[0069] 以下，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的說明。但是，下述實(shí)施例只是例示本發(fā)明， 本發(fā)明的內(nèi)容并不限定于下述實(shí)施例。
[0070] 〈實(shí)施例〉
[0071] 實(shí)施例1 :某于干細(xì)朐閔子（SCF)的血管內(nèi)皮細(xì)朐滲誘件分析
[0072] 將血管內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cell)放入至12孔Transwell過濾器（Corning Costar)的上室（upper chamber)中并培養(yǎng)48小時(shí)。然后用含有1 % FBS的內(nèi)皮細(xì)胞 基本培養(yǎng)液（Endothelial basal medium)替換，培養(yǎng) 3 小時(shí)。用 SCF(10、20、50ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)以不同濃度處理1小時(shí)后，進(jìn)行FITC-標(biāo)記的葡聚 糖（Fluorescein isothiocyanate_dextran)(lmg/ml)處理。30 分鐘后米取下室（lower chamber)的培養(yǎng)液，用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
[0073] 其結(jié)果是，確認(rèn)到SCF呈濃度依賴性地增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性（圖1A)。
[0074] 實(shí)施例2 :由SCF引起的血管內(nèi)皮細(xì)朐滲誘件增加的C-Kit依賴度分析
[0075] 將血管內(nèi)皮細(xì)胞放入至60mm板，利用脂質(zhì)體（Iipofectamin)將作為對(duì) 照 siRNA 的 5'-AAUGGAAGACCACUCCCACUC-3' （序列號(hào) 1)和作為 C-Kit siRNA 的 5'-UCAUUCUUGAUGUCUCUGG-3' （序列號(hào) 2) ;5'-UUUGAGUUCAGACAUGAGG-3' （序列號(hào) 3); 5' -UCUUAUAAAGUGCAGCUUC-3'（序列號(hào) 4) ;5' -UACAAUGCCAUUCUGAAGC-3'（序列號(hào) 5)導(dǎo)入至 細(xì)胞內(nèi)。24小時(shí)后，將內(nèi)皮細(xì)胞放入至12孔Transwell過濾器（Corning Costar)上室中 并培養(yǎng)24小時(shí)。然后用含有1 % FBS的內(nèi)皮細(xì)胞基本培養(yǎng)液（Endothelial basal medium) 替換，培養(yǎng)3小時(shí)。用SCF(20ng/ml)處理1小時(shí)后，進(jìn)行FITC-標(biāo)記的葡聚糖（lmg/ml)處 理。30分鐘后采取下室的培養(yǎng)液用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
[0076] 其結(jié)果是，確認(rèn)到因 SCF而內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增加，這樣的效果在使作為SCF的受 體的C-Kit的表達(dá)降低時(shí)顯著降低（圖1B)。
[0077] 實(shí)施例3 :某于SCF的血管內(nèi)皮細(xì)朐的細(xì)朐內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路分析
[0078] 將血管內(nèi)皮細(xì)胞放入至60mm板，培養(yǎng)24小時(shí)。然后用含有1% FBS的內(nèi)皮細(xì)胞基 本培養(yǎng)液（Endothelial basal medium)替換，培養(yǎng)6小時(shí)。用SCF(20ng/ml)進(jìn)行處理后 按照時(shí)間采集（harvest)細(xì)胞,進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。
[0079] 其結(jié)果是，確認(rèn)到SCF使作為內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)的C-Kit、Akt-eN0S磷酸化 (圖 1C)。
[0080] 實(shí)施例4 :由SCF引起的血管內(nèi)皮細(xì)朐的NO(-氣化氮）牛成測(cè)量
[0081] 將血管內(nèi)皮細(xì)胞放入至12孔-板，培養(yǎng)24小時(shí)。然后用含有1%FBS的內(nèi)皮細(xì)胞 基本培養(yǎng)液（Endothelial basal medium)替換后，用SCF(20ng/ml)進(jìn)行處理。按照時(shí)間 收集培養(yǎng)液，進(jìn)行離心分離后，利用上層液測(cè)量全部NO(-氧化氮）量（總一氧化氮/亞硝 酸鹽/硝酸鹽檢測(cè)試劑盒）。
[0082] 其結(jié)果是，確認(rèn)到由SCF引起內(nèi)皮細(xì)胞的NO (-氧化氮）量增加（圖2A)。
[0083] 實(shí)施例5 :由SCF引起的血管內(nèi)皮細(xì)朐的滲誘件增加的eNOS依賴度分析
[0084] 將血管內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cell)放入至12孔Transwell過濾器（Corning Costar)的上室并培養(yǎng)48小時(shí)。然后用含有1% FBS的內(nèi)皮細(xì)胞基本培養(yǎng)液（Endothelial basal medium)替換，培養(yǎng)3小時(shí)。用作為eNOS抑制劑（inhibitor)的L-NAME(ImM)進(jìn)行 前處理 30 分鐘后，用 SCF(20ng/ml) (R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)進(jìn)行處理 1 小時(shí)， 用 FITC-標(biāo)記的葡聚糖（Fluorescein isothiocyanate_dextran)(lmg/ml)處理。30 分鐘 后采取下室的培養(yǎng)液用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
[0085] 其結(jié)果是，確認(rèn)到由SCF引起內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增加，這樣的效果通過利用作為 eNOS抑制劑（inhibitor)的L-NAME而得到顯著抑制（圖2B)。
[0086] 實(shí)施例6 :由SCF引起的血管內(nèi)皮細(xì)朐的VE-鈣粘蛋白內(nèi)吞作用分析
[0087] 將血管內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cell)放入至8孔腔室玻片（Chamber Slide, Lab-Tek)中并培養(yǎng)48小時(shí)。然后用含有1% FBS的內(nèi)皮細(xì)胞基本培養(yǎng)液（Endothelial basal medium)替換，培養(yǎng) 16 小時(shí)。用 VE-I丐粘蛋白抗體（R&D Systems，Minneapolis, MN, USA)在 4 °C 處理 1 小時(shí)后，添加 SCF(20ng/ml)和 VEGF(50ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis，麗，USA)在37°C誘導(dǎo)VE-鈣粘蛋白的細(xì)胞內(nèi)吸收30分鐘。為了觀察細(xì)胞表 面的VE-鈣粘蛋白，用4 % PFA固定后進(jìn)行免疫染色，為了確認(rèn)通過由SCF及VEGF引起的內(nèi) 吞而位于細(xì)胞內(nèi)的VE-鈣粘蛋白，用酸性緩沖液（pH2. 7)去除細(xì)胞表面的VE-鈣粘蛋白后， 用4% PFA固定而進(jìn)行免疫染色，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0088] 其結(jié)果是，確認(rèn)到由SCF引起對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附重要的VE-鈣粘蛋白在細(xì) 胞表面的表達(dá)降低，誘導(dǎo)了內(nèi)吞（圖2C、D)。
[0089] 實(shí)施例7 :由SCF引起的血管內(nèi)皮細(xì)朐的VE-鈣粘蛋白內(nèi)吞作用的eNOS依賴度分 近
[0090] 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，利用Amaxa 4D Nucleofector向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入作為eNOS siRNA 的 5' -ACCGGAACAGCACAAGA⑶UAU-3'（序列號(hào) 6) ;5' -AGCUGCAAGGAUUCAGCAUUAU-3'（序列號(hào) 7) ;5'-ACGGAACAGCACAAGA⑶UAUA-3'（序列號(hào) 8) ;5'-CCAGGAGUAUCUUACCUGUAAA-3'（序列號(hào) 9)。24小時(shí)后，將細(xì)胞放入至8孔腔室玻片（Lab-Tek)并培養(yǎng)24小時(shí)。然后用含有1 % FBS的內(nèi)皮細(xì)胞基本培養(yǎng)液（Endothelial basal medium)替換，培養(yǎng)16小時(shí)。在4°C使 VE-鈣粘蛋白抗體反應(yīng)1小時(shí)后，用L-NAME(ImM)前處理30分鐘，然后添加 SCF (20ng/ml) 和VEGF(50ng/ml)，在37°C誘導(dǎo)VE-鈣粘蛋白的細(xì)胞內(nèi)吸收30分鐘。為了觀察細(xì)胞表面的 VE-鈣粘蛋白，用4 % PFA固定后進(jìn)行免疫染色，為了確認(rèn)通過由SCF及VEGF引起的內(nèi)吞而 位于細(xì)胞內(nèi)的VE-鈣粘蛋白，用酸性緩沖液（pH2. 7)去除細(xì)胞表面的VE-鈣粘蛋白后，用 4% PFA固定而進(jìn)行免疫染色，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0091] 其結(jié)果是，確認(rèn)到由SCF引起的VE-鈣粘蛋白的內(nèi)吞通過eNOS的表達(dá)抑制及eNOS 抑制劑而被抑制，維持VE-鈣粘蛋白的細(xì)胞表面的表達(dá)（圖2的C及D)。
[0092] 實(shí)施例8 :小鼠樽型中由SCF引起的血管滲誘件增加分析
[0093] 向C57/BL6小鼠的尾巴靜脈注入伊文思藍(lán)（Evans blue)染料100。10分鐘后在 鼠的背皮下（intradermally)注入 SCF 及 SCF 受體抑制抗體（anti-ckit IgG :Monoclonal anti-SCF receptor neutralization antibody(抗-Ckit IgG:單克隆抗-SCF受體中和抗 體）：R&D Systems，Minneapolis，MN, USA)。20分鐘后從小鼠收集皮膚后，對(duì)伊文思藍(lán)染料 向組織滲透出來的部位進(jìn)行拍照，放入至甲酰胺（formamide)中，并在常溫下放置4天。然 后用分光光度計(jì)在620nm處測(cè)量吸光度。
[0094] 其結(jié)果是，確認(rèn)到由SCF引起鼠的皮膚血管滲透性增加（圖3的A及B)，這樣的效 果通過SCF受體抑制抗體而顯著降低（圖3的C及D)。
[0095] 實(shí)施例9 :利用小鼠的視網(wǎng)臘血管的、由SCF引起的血管滲誘件增加的血管誥影術(shù) (Angiography)
[0096] 向C57/BL6小鼠的視網(wǎng)膜注入SCF及SCF受體抑制抗體。24小時(shí)后麻醉小鼠后向 心臟內(nèi)注射 FITC-標(biāo)記的葡聚糖（Fluorescein isothiocyanate-dextran) (intracardiac FITC-Dextran injection)，使熒光物質(zhì)沿著血液流動(dòng)。30分鐘后取出小鼠的視網(wǎng)膜進(jìn)行分 離后，進(jìn)行平坦固定（flat mounting),通過突光顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0097] 其結(jié)果是，確認(rèn)到在注射SCF的小鼠中視網(wǎng)膜血管的滲透性增加，從而熒光物質(zhì) 滲漏到血管周圍組織（圖4的A及B)，并且確認(rèn)到這樣的效果通過用SCF受體抑制抗體處 理而顯著降低（圖4的C及D)。
[0098] 實(shí)施例10 :利用糖尿病件視網(wǎng)臘病動(dòng)物樽型的SCF表汰增加確認(rèn)
[0099] SD 大鼠 （Sprague Dawley rat)的腹腔，注入 150mg/kg STZ (鏈脲霉素 (streptozotocin), Sigma)3天后測(cè)量血糖，并將250mg/dL以上的動(dòng)物劃分為糖尿，并 誘導(dǎo)糖尿病性視網(wǎng)膜病。誘導(dǎo)糖尿1周、4周后取出SD大鼠的視網(wǎng)膜，利用Trizol試劑 (Invitrogen公司）分離RNA,通過Real Time PCR確認(rèn)了 SCF和VEGF的表達(dá)。
[0100] 其結(jié)果是，確認(rèn)到在誘導(dǎo)糖尿病性視網(wǎng)膜病的大鼠中SCF和VEGF的表達(dá)量隨著時(shí) 間的經(jīng)過而增加（圖5的A及B)，由此確認(rèn)到SCF起著導(dǎo)致血管滲透性相關(guān)疾病的糖尿病 性視網(wǎng)膜病的重要因素的作用。
[0101] 實(shí)施例11 :糖尿病件視網(wǎng)臘病動(dòng)物樽型中的、血管滲誘件增加及某于SCF抑制抗 體的降低效果確認(rèn)
[0102] 向在上述實(shí)施例10中誘導(dǎo)糖尿病性視網(wǎng)膜病的大鼠的視網(wǎng)膜注入SCF抑制抗 體（anti-SCF IgG ：Monoclonal anti-SCF neutralization antibody (抗-SCF IgG :單克 隆抗-SCF中和抗體）：R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)。2周后，向麻醉的大鼠的心 臟內(nèi)注射 FITC-標(biāo)記的葡聚糖（Fluorescein isothiocyanate-dextran) (intracardiac FITC-Dextran injection)使熒光物質(zhì)沿著血液流動(dòng)。30分鐘后，取出大鼠的視網(wǎng)膜進(jìn)行 分離后，進(jìn)行平坦固定（flat mounting),通過突光顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0103] 其結(jié)果是，確認(rèn)到在通過注射STZ而誘導(dǎo)糖尿病性視網(wǎng)膜病的大鼠中，視網(wǎng)膜血 管的滲透性增加，從而熒光物質(zhì)滲漏到血管周圍組織，并且確認(rèn)到這樣的效果通過用SCF 抑制抗體處理而顯著降低（圖6)，由此確認(rèn)到SCF抑制抗體對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病的治療有 效。
[0104] 如上述的結(jié)果是啟示本發(fā)明的SCF可以用作增加血管滲透性的調(diào)節(jié)劑的結(jié)果，是 啟示在使用抑制SCF或者作為其受體的C-Kit的物質(zhì)的情況下，能夠治療或者預(yù)防血管滲 透性相關(guān)疾病的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，所述組合物包含抑制SCF或其 受體的物質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，其特征在 于，所述SCF的受體為C-Kit。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，其特征在 于， 所述抑制SCF或者其受體的物質(zhì)選自由對(duì)SCF或者其受體特異性的siRNA、反義寡核苷 酸、適體及抗體組成的組中的任意一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，其特征在 于，所述抑制SCF的受體的物質(zhì)為C-Kit siRNA或者SCF受體抑制抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，其特征在 于，所述C-Kit siRNA為選自由序列號(hào)2至5組成的組中的任意一種的堿基序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，其特征在 于，所述血管滲透性相關(guān)疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜血管新生、青光眼視網(wǎng)膜色 素變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、老年性黃斑變性、青光眼、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜劈裂癥、斯塔加 特病、常染色體顯性玻璃膜疣、貝斯特黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、囊樣黃斑水腫、缺血性視網(wǎng)膜病變、誘 導(dǎo)炎癥視網(wǎng)膜退行性疾病、X染色體-相關(guān)青少年視網(wǎng)膜劈裂癥、莫拉蒂致拉分提那斯、多 英峰窩狀視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良及血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥疾病組成的組中的任意一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療或預(yù)防血管滲透性相關(guān)疾病的組合物，其特征在 于，所述血管滲透性相關(guān)疾病的治療通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性來實(shí)現(xiàn)。
8. -種血管滲透性調(diào)節(jié)方法，所述方法包括利用權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)所述的組 合物在體外調(diào)節(jié)SCF或者其受體的表達(dá)的步驟。
9. 一種血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選方法，所述方法包括： (a)用治療劑候選物質(zhì)處理血管滲透性相關(guān)疾病疑似病人的被分離的試樣的步驟；以 及（b)將SCF或者其受體的表達(dá)水平與對(duì)照組進(jìn)行比較的步驟。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選方法，其特征在于，所述 SCF的受體為C-Kit。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的血管滲透性相關(guān)疾病治療劑的篩選方法，其特征在于，所 述（b)步驟進(jìn)一步包括將C-Kit的磷酸化水平與對(duì)照組比較的步驟。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104334195SQ201280073658
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月4日
【發(fā)明者】徐源希, 金知娟 申請(qǐng)人:亞洲大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)