專利名稱：一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑、活疫苗凍干粉及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活的微生物保存領(lǐng)域，具體涉及一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑、活疫苗凍干粉及其制備方法。
背景技術(shù)：
病毒等生物活性物質(zhì)及其相關(guān)制品的熱敏感性一直是活疫苗長期保存的瓶頸。我國幅員遼闊，經(jīng)濟(jì)水平差異較大，運(yùn)輸、使用過程中疫苗短期暴露高溫環(huán)境(甚至45°C以上)的現(xiàn)象依然存在，所以對(duì)活疫苗的耐熱性能提出了更高的要求。耐熱凍干保護(hù)劑考慮了活疫苗在較高溫度和較長保存時(shí)間的情況下，凍干物質(zhì)可能產(chǎn)生的物理和化學(xué)變化對(duì)活疫苗存活的影響。但是，現(xiàn)有耐熱凍干保護(hù)劑僅能使活疫苗在2 8 °C條件下保存24個(gè)月，37 °C條件下保存30天。活疫苗的冷凍干燥工藝對(duì)其保存期也有很大的影響。常規(guī)冷凍干燥工藝中，活疫苗首先被超低溫凍結(jié)(_40°C以下)，形成的冰結(jié)晶對(duì)病毒的囊膜或者細(xì)胞壁造成不同程度的傷害，進(jìn)而影響干燥產(chǎn)品水合后的活性。因此，常規(guī)冷凍干燥工藝中，無論如何對(duì)耐熱保護(hù)劑配方進(jìn)行多大改進(jìn)，制品的耐熱性能還是有限的，室溫甚至更高溫度的穩(wěn)定性是不高的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，能夠使活疫苗在37°C保存3個(gè)月，20°C條件下保存18個(gè)月。

本發(fā)明的另一目的是提供含有上述耐熱凍干保護(hù)劑的活疫苗凍干粉。本發(fā)明的再一目的是提供活疫苗凍干粉的制備方法，該制備方法避免了凍干過程中冰晶的形成，對(duì)活病毒細(xì)胞損傷小，使得活疫苗凍干粉耐熱性能強(qiáng)。本發(fā)明的目的采用下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，按照重量百分含量由下列物質(zhì)組成
低聚糖46% 90%，
氨基酸1% 9%，
明膠1% 9%,
酪蛋白水解物1% 9%，
聚乙烯基吡咯烷酮1% 9%，
甘油1% 9%,
普魯尼克68 1% 9%。所述低聚糖為海藻糖。所述低聚糖為海藻糖和選自蔗糖、乳糖或菊糖中的一種或兩種以上物質(zhì)的混合物，所述低聚糖中海藻糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60% 90%。
所述氨基酸為精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和異亮氨酸中的一種或兩種以上的混合物。一種所述耐熱凍干保護(hù)劑的活疫苗凍干粉。一種所述活疫苗凍干粉的制備方法，包括如下步驟用溶劑溶解所述耐熱凍干保護(hù)劑，得到保護(hù)劑溶液；將保護(hù)劑溶液與活病毒液混合，得到活疫苗；將活疫苗用真空干燥機(jī)按照下述方法干燥將活疫苗在常壓溫度為-10°C 2°C條件下保持2 6小時(shí)，在真空度為100 800mbar溫度為(TC 20°C條件下保持10 26小時(shí)，在真空度為O. 01
5.Ombar溫度為10°C 28°C條件下保持2 8小時(shí)，得到活疫苗凍干粉。所述溶劑為無菌的生理鹽水或注射用水或PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液或Hank’ s液，所述耐熱凍干保護(hù)劑與溶劑的質(zhì)量比為3:6 8。所述保護(hù)劑溶液與活病毒液按照質(zhì)量比為1:0. 5 2混合。所述活病毒液為雞新城疫病毒液或豬繁殖與呼吸綜合征病毒液。本發(fā)明活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，由于其成分及含量的合理搭配，使得活疫苗耐熱、耐儲(chǔ)存。耐熱凍干保護(hù)劑中的低聚糖能夠置換毒囊膜或者細(xì)胞壁中的，讓病毒處于休眠狀態(tài)，降低病毒干燥和保存期的生命活動(dòng)，進(jìn)而大大加強(qiáng)其耐熱性能。本發(fā)明活疫苗凍干粉的制備方法，避免了冰晶的形成，減少病毒囊膜或者細(xì)胞壁的物理損傷，使得活疫苗的耐熱性大大增強(qiáng)。本發(fā)明制備的活疫苗凍干粉在37°C保存3個(gè)月，20°C條件下保存18個(gè)月。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1耐熱凍干保護(hù)劑的制備
如果沒有特殊說明，本實(shí)施例中的百分比為重量百分比。其中，酪蛋白水解物購自ShanHai Richu Bioscience Co. · Ltd,批號(hào) 090901 ;聚乙烯基吡咯烷酮(K-30)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20111009 ;普魯尼克68(Pluronic F 68)購自上海生工生物有限公司，批號(hào)HJ0522B2012。耐熱凍干保護(hù)劑I配方
海藻糖68%，
甘氨酸6%，
明膠3%，
酪蛋白水解物6%，
聚乙烯基吡咯烷酮 6%，
甘油5%，
普魯尼克686%。耐熱凍干保護(hù)劑2配方
海藻糖 38%，蔗糖 20%，
精氨酸1%、甘氨酸1%、蛋氨酸1%、谷氨酸1%，異亮氨酸3%，
明膠8%，
酪蛋白水解物4%，聚乙烯基吡咯烷酮 9%，
甘油7%，
普魯尼克687%。耐熱凍干保護(hù)劑3配方
海藻糖 80%，乳糖 10%，
精氨酸1%，
明膠1%，
酪蛋白水解物1%，
聚乙烯基吡咯烷酮 2%，
甘油2%，
普魯尼克683%。耐熱凍干保護(hù)劑4配方
海藻糖 38%,菊糖 10%,
谷氨酸9%，
明膠9%，
酪蛋白水解物7%，
聚乙烯基吡咯烷酮 9%，
甘油9%，
普魯尼克689%。耐熱凍干保護(hù)劑5配方
海藻糖48%，蔗糖15%，乳糖15%，
精氨酸1%、甘氨酸1%、蛋氨酸2%，
明膠3%，
酪蛋白水解物9%，
聚乙烯基吡咯烷酮 3%，
甘油1%，
普魯尼克682%。 按照各耐熱凍干保護(hù)劑的配方稱取各成分，獲得耐熱凍干保護(hù)劑1-5。
實(shí)施例2 雞新城疫活疫苗凍干粉的制備及其耐熱性能 (I)耐熱凍干保護(hù)劑的制備 按實(shí)施例1方法制得耐熱凍干保護(hù)劑1-5。(2)雞新城疫病毒液(活病毒液)的準(zhǔn)備
雞新城疫病毒液(活病毒液)由南京天邦生物科技有限公司提供。具體制備方法按照《獸用生物質(zhì)量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2006-2008)相關(guān)要求，制備雞新城疫病毒液(La Sota株)，每羽份病毒液病毒含量為107_%ID5(i (雞胚檢驗(yàn)法)。(3)雞新城疫活疫苗凍干粉的制備
①將耐熱凍干保護(hù)劑I與無菌注射用水按照質(zhì)量比為3:7混合，待耐熱凍干保護(hù)劑I完全溶解后，用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌，制得保護(hù)劑溶液1，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 按照制備保護(hù)劑溶液I的方法，將耐熱凍干保護(hù)劑2-5，分別配制成相應(yīng)的保護(hù)劑溶液。不同之處在于，保護(hù)劑溶液2中的溶劑為無菌PBS緩沖液(pH7. 2)，耐熱凍干保護(hù)劑2與無菌PBS緩沖液(pH7. 2)按照質(zhì)量比為3:6混合；保護(hù)劑溶液3中的溶劑為無菌Hank’s液(pH7. 2)，耐熱凍干保護(hù)劑3與無菌Hank’ s液(pH7. 2)按照質(zhì)量比為3:8混合；保護(hù)劑溶液4中的溶劑為無菌Tris-HCl緩沖液(pH7. 2)，耐熱凍干保護(hù)劑4與無菌Tris-HCl緩沖液(pH7. 2)按照質(zhì)量比為3:6混合；保護(hù)劑溶液5中的溶劑為無菌生理鹽水，耐熱凍干保護(hù)劑5與無菌生理鹽水按照質(zhì)量比為3:7混合。PBS 緩沖液(ρΗ7· 2):將 8. 5g NaCl,3. 5g Na2HPO4 · 12H20 和 O. 25g NaH2PO4 · 2H20溶液蒸餾水，定容至1000ml。Hank，s 液(ρΗ7· 2)配方將 8. Olg NaCl.O. 4g KC1、0. 14g CaCl2,0. 35g NaHCO3'0. 06g KH2PO 4和0. 34g葡萄糖溶于蒸餾水，定容至1000ml。Tris-HCl緩沖液(pH7. 2)配方將50ml濃度為O. lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與44. 7 ml濃度為O. lmol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml。@將保護(hù)劑溶液1-5分別與雞新城疫病毒液(活病毒液)混合，得到活疫苗1-5.活疫苗I中保護(hù)劑溶液I與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:1?；钜呙?中保護(hù)劑溶液2與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:0. 5?；钜呙?中保護(hù)劑溶液3與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:2。活疫苗4中保護(hù)劑溶液4與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:1. 5?；钜呙?中保護(hù)劑溶液5與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:0. 5。 ③將活疫苗I用真空干燥機(jī)按照下述方法干燥將活疫苗I在常壓、溫度為-10°C條件下保持2小時(shí)，在真空度為IOOmbar溫度為O °C條件下保持10小時(shí)，在真空度為O. Olmbar溫度為10°C條件下保持2小時(shí)，得到雞新城疫活疫苗凍干粉I。將活疫苗2用真空干燥機(jī)按照下述方法干燥將活疫苗2在常壓、溫度為2°C條件下保持6小時(shí)，在真空度為800mbar溫度為20°C條件下保持26小時(shí)，在真空度為5. Ombar溫度為28°C條件下保持2 8小時(shí)，得到雞新城疫活疫苗凍干粉2。將活疫苗3用真空干燥機(jī)按照下述方法干燥將活疫苗3在常壓、溫度為_4°C條件下保持4小時(shí)，在真空度為450mbar溫度為10°C條件下保持18小時(shí)，在真空度為2. 5mbar溫度為20°C條件下保持5小時(shí)，得到雞新城疫活疫苗凍干粉3。按照活疫苗3的干燥方法，將活疫苗4干燥得到雞新城疫活疫苗凍干粉4。按照活疫苗2的干燥方法，將活疫苗5干燥得到雞新城疫活疫苗凍干粉5。對(duì)照疫苗A按照名稱為“雞新城疫活疫苗耐熱凍干保護(hù)劑、其制備方法及應(yīng)用”、專利號(hào)為ZL200510115162. O的發(fā)明專利，實(shí)施例3中“A組試驗(yàn)疫苗”的制備方法。保護(hù)劑配方為明膠1. 2g，乳糖Sg，精氨酸lg，山梨醇4g，蒸餾水定容100ml，蒸汽滅菌后與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:1混合，_30°C入箱，預(yù)凍在_45°C以下5小時(shí)后升溫，曲線全程共計(jì)48小時(shí)，升華過程中真空度控制在IOmHg以下，冷凝器保持在_70°C，得到雞新城疫活疫苗對(duì)照疫苗A。(4)雞新城疫活疫苗凍干粉耐熱性能的比較
按照《中國獸藥典》(2010版)中雞胚檢測(cè)法檢測(cè)雞新城疫活疫苗凍干粉1-6和對(duì)照疫苗A在不同條件下保存后的毒價(jià)。
表I雞新城疫活疫苗凍干粉與對(duì)照疫苗A耐熱性能的比較
權(quán)利要求
1.一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，按照質(zhì)量百分含量由下列物質(zhì)組成 低聚糖46% 90%， 氨基酸1% 9%， 明膠1% 9%, 酪蛋白水解物1% 9%， 聚乙烯基吡咯烷酮1% 9%， 甘油1% 9%, 普魯尼克68 1% 9%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于所述低聚糖為海藻糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于所述低聚糖為海藻糖和選自蔗糖、乳糖或菊糖中的一種或兩種以上物質(zhì)的混合物，所述低聚糖中海藻糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60% 90%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于所述氨基酸為精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和異亮氨酸中的一種或兩種以上的混合物。
5.一種含有權(quán)利要求4所述耐熱凍干保護(hù)劑的活疫苗凍干粉。
6.一種權(quán)利要求5所述活疫苗凍干粉的制備方法，其特征在于包括如下步驟用溶劑溶解所述耐熱凍干保護(hù)劑，得到保護(hù)劑溶液；將保護(hù)劑溶液與活病毒液混合，得到活疫苗；將活疫苗用真空干燥機(jī)按照下述方法干燥將活疫苗在常壓、溫度為-10°C 2°C條件下保持2 6小時(shí)，在真空度為100 800mbar溫度為0°C 20°C條件下保持10 26小時(shí)，在真空度為O. 01 5. Ombar溫度為10°C 28°C條件下保持2 8小時(shí)，得到活疫苗凍干粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述活疫苗凍干粉的制備方法，其特征在于所述溶劑為無菌的生理鹽水、注射用水、PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或Hank’ s液，所述耐熱凍干保護(hù)劑與溶劑的質(zhì)量比為3:6 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述活疫苗凍干粉的制備方法，其特征在于所述保護(hù)劑溶液與活病毒液按照質(zhì)量比為1:0. 5 2混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述活疫苗凍干粉的制備方法，其特征在于所述活病毒液為雞新城疫病毒液或豬繁殖與呼吸綜合征病毒液。
全文摘要
本發(fā)明提供耐熱凍干保護(hù)劑、活疫苗凍干粉及其制備方法，涉及微生物保存領(lǐng)域。耐熱凍干保護(hù)劑低聚糖46%～90%，氨基酸1%～9%，明膠1%～9%，酪蛋白水解物1%～9%，聚乙烯基吡咯烷酮1%～9%，甘油1%～9%，普魯尼克681%～9%。其制備方法為制備保護(hù)劑溶液、活疫苗，干燥在常壓-10℃～2℃保持2～6小時(shí)，在100～800mbar0℃～20℃保持10～26小時(shí)，在0.01～5.0mbar10℃～28℃保持2～8小時(shí)。本發(fā)明耐熱凍干保護(hù)劑，成分及含量搭配合理，使得活疫苗耐熱。本發(fā)明活疫苗凍干粉的制備方法，避免了冰晶的形成，得到的活疫苗凍干粉在37℃保存3個(gè)月，20℃保存18個(gè)月。
文檔編號(hào)A61K47/42GK103041383SQ20131000444
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月7日
發(fā)明者呂芳, 盧宇, 鄧碧華, 張金秋, 侯繼波 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院