專利名稱：重組人源細胞珠蛋白在制備治療脂肪肝藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種蛋白的新用途，特別涉及ー種細胞珠蛋白的新用途。
背景技術：
飲酒是人類文明盛傳已久的習慣之一，適量的飲酒對健康并無明顯損害，甚至對冠心病等還有一定的預防作用。但是酒精濫用和酒精依賴影響了全球數(shù)百萬人ロ，對社會和人類健康產生了許多不良影響。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告全球范圍內有20億的酒精消耗，有約7 630萬人被診斷為酒精濫用，毎年死于酒精濫用的人數(shù)已達到3.2%，有4.0%的人被疾病困擾。目前，在我國由于酒精所致肝損傷的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，酒精已成為繼病毒性肝炎后導致肝損害的第二大病因嚴重危害了人類健康。因此，正確認識酒精性肝病，及時診斷和治療，具有重要意義。酒精性脂肪肝是 由于長期大量飲酒導致的肝臟疾病，其發(fā)病機理存在多種假說，有人認為其是こ醇及其衍生物的代謝過程中直接或間接誘導的炎癥反應，氧化應激、腸源性內毒素、炎性介質和營養(yǎng)失衡(尤其是蛋白質ー熱量營養(yǎng)不良)等多種因素相互作用的結果，也有人認為酒精因素作為初次打擊，通過氧化應激促使反應性氧化物増加，而誘發(fā)肝臟脂肪聚集。在氧化應激相關的脂質過氧化及炎性細胞因子的作用下，使脂肪變的肝細胞發(fā)生第二次打擊，造成炎癥、壞死和纖維化，但是并未有定論。此外，由于酒精性脂肪肝是ー種慢性病，而現(xiàn)有的酒精性脂肪肝普遍采用高度數(shù)酒精灌胃，對動物體的刺激大，同吋，灌胃對動物的刺激大，導致動物精神緊張，動物的神經(jīng)系統(tǒng)及內分泌系統(tǒng)受到一定影響，得到的動物模型與真實發(fā)展而成的酒精性脂肪肝存在較大的區(qū)別，這也給酒精性脂肪肝的藥物篩選帶來了一定程度的影響。。酒精性脂肪肝的臨床癥狀為非特異性，可無癥狀，或有右上腹脹痛、食欲不振、乏力、體質量減輕等。酒精性脂肪肝是ー種慢性病，一般認為其危害不大，但是其可進ー步發(fā)展為其他嚴重的肝病，影響人們的生命健康。酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展存在種族、遺傳、性別、年齡等差異，治療效果也因人而異，未有成熟的治療方案。目前治療酒精性脂肪肝主要是通過戒酒及對癥的藥物治療，如營養(yǎng)支持、降血脂、不飽和脂肪酸及磷脂類藥物治療等，但治療效果不佳，有ー些藥物的副作用明顯；也有用抗氧化劑和抗內毒素治療的，但也不能獲得理想的效果，可能不能針對性清除激活的Kupffer細胞釋放的炎性因子及活性氧成分；中藥成分復雜，其有效成分難于確定，制備エ藝不夠穩(wěn)定，成品質量難以控制。至今仍沒有有效且副作用小的治療方法，因此，開發(fā)真正有效防治酒精性脂肪肝的藥物，己經(jīng)是當前迫切需要解決的問題。細胞珠蛋白(cytoglobin)是人體固有的保護性蛋白，對機體無毒副作用。細胞珠蛋白最初由Kawada等在大鼠HSC中發(fā)現(xiàn)，其在硫代こ酰胺脅迫誘導的纖維化肝臟星狀細胞(HSC)中表達明顯増加，因而起初被命名為HSC激活相關蛋白(Stellate cellactivation-associated protein, STAP)。蛋白測序表明它屬于新的一類含血紅素的六配位蛋白(Hexacoordinate globin super-family),是哺乳動物中四種球蛋白(Globin)之一。進ー步的研究發(fā)現(xiàn)STAP不僅存在于HSC中，還普遍存在于人類多種器官組織以及腎臟和胰臟的類成纖維細胞中，因而將其統(tǒng)ー稱為細胞珠蛋白(Cytoglobin，Cygb).細胞珠蛋白由190個氨基酸殘基組成，分子量是21.4KD，定位于染色體17q25。目前的研究表明Cygb具有過氧化酶的作用，活性氧清除劑的作用及一氧化氮加雙氧酶功能，基因上具有保守的組織缺氧反應元件(HRE)，其3’ UTR同時還含有組織缺氧誘導的mRNA穩(wěn)定信號(HIPBS)，可保證Cygb基因在組織缺氧時的表達和穩(wěn)定性。在各種應激情況下如缺血、氧化應激及纖維化吋，Cygb表達增加。與球蛋白家族的其他成員一祥，Cygb具有保護細胞免受氧化應激的損傷，體內及體外實驗表明外源性過表達rhCygb可保護肝星狀細胞免受氧化應激損傷并且抑制其向纖維樣細胞分化。由于人類Cygb與大鼠Cygb在基因序列上具有97%的同源性，故本實驗采用來源于人的Cygb的rhCygb蛋白進行大鼠模型的治療實驗。迄今未有文獻報導人源珠蛋白具有改善或治療脂肪肝，特別是酒精性脂肪肝的功能。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供重組人源細胞珠蛋白在制備治療脂肪肝，特別是酒精性脂肪肝藥物中的應用。本申請發(fā)明人通過建立酒精肝大鼠模型，按rhCYGB 3 mg/Kg的劑量皮下注射，進行治療，實驗結果表明，重組人源細胞珠蛋白藥物無毒性，與模型對照組相比，rhCYGB治療組有顯著的改善，其脂肪滴較模型組明顯減少，肝索排列整齊。還原型谷胱甘肽治療組仍有明顯脂肪變性，肝細胞輕度腫脹。rhCYGB治療酒精性脂肪肝比還原型谷胱甘肽藥效更好。采用重組人源細胞珠蛋白治療脂肪肝，特別是酒精性脂肪肝具有低毒、安全、有效的優(yōu)點。


圖1是rhCYGB誘導表達后的SDS-PAGE電泳 圖2是純化后的rhCYGB的SDS-PAGE電泳 圖3是造模30周后正常對照組與造模組大鼠肝臟組織HE染色結果 圖4是治療后各組大鼠肝臟組織HE染色結果。
具體實施例方式下面結合實驗，進ー步說明本發(fā)明。以上實驗中，CYGB為細胞珠蛋白的縮寫，rhCYGB為重組人源細胞珠蛋白的縮寫。rhCYGB 的制備:
rhCYGB的誘導表達:將PET28a-rhCYGB-BL21 (DE3)菌株用Kan+的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，次日按1:100比例轉入新鮮LB(Kan+)培養(yǎng)液中，當OD6tltl達0.6時，加入IPTG至終濃度為Immol/L，37°C誘導培養(yǎng)4 h收菌。經(jīng)12% SDS-PAGE檢測，電泳圖如圖1所示，圖中，A:低分子量蛋白Marker; B: PET28a-rhCygb_BL21 (DE3)菌株表達產物；C:陰性空載體菌株PET28a-BL21(DE3)表達產物重組菌表達產物中在分子量約為21 kDa位置出現(xiàn)一條粗帶(圖1)。rhCYGB的純化:將誘導表達的重組蛋白，經(jīng)裂解洗滌后，用分子篩G25復性和初歩純化，再經(jīng)親和層析柱進ー步純化后，進行SDS-PAGE，電泳結果如圖2所示，圖中，A:低分子量蛋白Marker ；B:分子篩G25復性后產物；C:親和層析純化后的產物。用BandScan 5.0軟件進行灰度分析，親和層析純化后的rhCYGB純度為93.3%。rhCYGB的生物活性檢測:按照T-AOC試劑盒的說明書對rhCYGB抗氧化活性進行檢測和計算，純化后的rhCYGB抗氧化活性為(95.58±2.67) U/mg (表I)，與兩個對照組比較P=0.000，說明純化后的rhCYGB具有抗氧化的生物活性。
權利要求
1.組人源細胞珠蛋白在制備治療脂肪肝藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于:所述脂肪肝為酒精性脂肪肝。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組人源細胞珠蛋白在制備治療脂肪肝藥物中的應用。通過建立酒精肝大鼠模型，按rhCYGB3mg/Kg的劑量皮下注射，進行治療，實驗結果表明，重組人源細胞珠蛋白藥物無毒性，與模型對照組相比，rhCYGB治療組有顯著的改善，其脂肪滴較模型組明顯減少，肝索排列整齊。還原型谷胱甘肽治療組仍有明顯脂肪變性，肝細胞輕度腫脹。rhCYGB治療酒精性脂肪肝比還原型谷胱甘肽藥效更好。采用重組人源細胞珠蛋白治療脂肪肝，特別是酒精性脂肪肝具有低毒、安全、有效的優(yōu)點。
文檔編號A61P1/16GK103083647SQ20131002540
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權日2013年1月23日
發(fā)明者董文其, 魏威, 李珍, 文健 申請人:董文其