專(zhuān)利名稱(chēng)：色氨酸納米微球在制備治療腫瘤疾病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及色氨酸納米微球在制備治療腫瘤疾病藥物中的用途，還涉及一種用于制備所述的色氨酸納米微球的方法。本發(fā)明屬于腫瘤藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和生命，目前市場(chǎng)上雖有很多抗癌藥物，但副作用大、價(jià)格昂貴，給患者及其家屬帶來(lái)沉重的精神負(fù)擔(dān)和難以解脫的悲痛。同時(shí)也給患者家屬及社會(huì)造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，全世界每年因腫瘤死亡的人數(shù)達(dá)500萬(wàn)以上，許多國(guó)家其死亡率占各種死亡原因的首位。目前已有的藥物治療、化療、放療等手段，雖有一定效果，但副作用也很大，因此尋找更有效、無(wú)副作用且相對(duì)經(jīng)濟(jì)的治療藥物，一直是醫(yī)學(xué)家們的不懈追求。腫瘤生長(zhǎng)時(shí)可明顯改變宿主的糖和氨基酸代謝。氨基酸具有許多重要的生理功能，但又是腫瘤組織賴以生存的條件之一，這給氨基酸治療腫瘤帶來(lái)了很大矛盾。目前世界上用于作為藥物的氨基酸及氨基酸衍生物的品種達(dá)100多種。氨基酸衍生物已廣泛用作抗腫瘤藥物，其作用方式有:(1)以氨基酸作為載體的抗腫瘤藥物，如苯丙氨酸芥子氣，L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸與苯二胺氮芥共結(jié)合物；(2)利用氨基酸衍生物作為腫瘤細(xì)胞所需氨基酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物達(dá)到抗腫瘤的目的，如S-氨甲酰-L-半胱氨酸；(3)氨基酸衍生物作為酶抑制劑的抗腫瘤藥物，如N-磷酸乙酰-L-天門(mén)冬氨酸是一個(gè)天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酚基酶的過(guò)渡狀況抑制劑，利用這個(gè)抑制劑可中斷嘧啶核苷酸的合成途徑達(dá)到抗腫瘤目的；(4)氨基酸衍生物作為中間產(chǎn)物的腫瘤抑制劑；(5)使癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的氨基酸衍生物。色氨酸是人和動(dòng)物必需的限制性氨基酸之一，它與生理發(fā)育有關(guān)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料添加。但色氨酸在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及是否可以作為藥物對(duì)腫瘤疾病進(jìn)行治療尚不清楚。僅有的一些研究多來(lái)自流行病學(xué)調(diào)查，有學(xué)者研究表明在口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌患者體內(nèi)血漿中色氨酸及其代謝產(chǎn)物顯著增高，提示色氨酸可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，目前以色氨酸及其衍生物作為抗腫瘤的藥物還未被開(kāi)發(fā)利用。一切生物的生長(zhǎng)，都需要氨基酸作為合成蛋白質(zhì)的原料。然而，當(dāng)某種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞漿時(shí)，不僅不促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)反而抑制其增殖，將可能成為一種理想的抗腫瘤藥物。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外飼料工業(yè)發(fā)展迅速，在醫(yī)藥工業(yè)上用途的不斷擴(kuò)大，色氨酸成為一種國(guó)際市場(chǎng)上發(fā)展前景良好，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求較大的產(chǎn)品，且原料來(lái)源豐富，生產(chǎn)技術(shù)成熟，相對(duì)于多數(shù)現(xiàn)有的抗腫瘤藥物，其成本較低， 將其作為抗腫瘤藥物投入市場(chǎng)必將具有廣闊開(kāi)發(fā)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種色氨酸納米微球在制備治療腫瘤疾病藥物中的新用途。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種色氨酸納米微球的制備方法及由該方法制備得到色氨酸納米微球。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是，利用乳化法納米微球技術(shù)將色氨酸包埋使其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)釋放大量外源色氨酸到腫瘤細(xì)胞漿，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。研究表明，色氨酸納米微球?qū)θ肆馨桶┘?xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系、直腸癌細(xì)胞系、子宮頸癌細(xì)胞系、腦瘤腫瘤細(xì)胞系和人白血病細(xì)胞系具有較強(qiáng)的殺傷作用，通過(guò)局部給藥方式，該藥物可對(duì)直腸癌細(xì)胞株裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。因此，本發(fā)明提出了色氨酸納米微球在治療腫瘤疾病中的用途。本發(fā)明中，優(yōu)選的，一種制備所述色氨酸納米微球的方法，其特征在于包含以下步驟:(I)將色氨酸溶液在超聲條件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，得到乳白色的均一乳液；(2)將牛血清白蛋白的水溶液在超聲條件下加入到步驟(I)得到的乳液中，超聲，形成均一的乳液；(3)在步驟(2)得到的乳液中放入轉(zhuǎn)子，攪拌，將乳液離心，離心速度2500-3500rpm,時(shí)間8_12min，取上清，將上清再次離心，離心速度2500-3500rpm,時(shí)間8-12min，取2次離心的沉淀物；(4)將沉淀物加入蒸餾水中分散后，再進(jìn)行離心，然后再分散，重復(fù)3次，最后的沉淀物分散在蒸餾水中，冷凍干燥，即得。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(I)中所述的色氨酸溶液的濃度為0.lg/ml-0.5g/ml,更優(yōu)選為0.2g/mL.
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(I)中所述的含有PLGA的二氯甲烷溶液的濃度為
0.05g/ml，含有PLGA的二氯甲烷溶液與色氨酸溶液的體積比為10:1。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的牛血清白蛋白水溶液的濃度為0.0Olg/ml-0.01g/ml，更優(yōu)選為0.005g/ml，牛血清白蛋白的水溶液與步驟(I)得到的乳液的體積比 5-6:1。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(3)中在乳液中放入轉(zhuǎn)子，在電磁攪拌條件下攪拌4小時(shí)，將乳液離心，離心速度3000rpm，時(shí)間lOmin，取上清(上面的溶液)，將上清再離心，離心速度 3000rpm,時(shí)間 IOmin。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供所述的方法制備得到的色氨酸納米微球。其中，所述的色氨酸納米微球的載藥量為[(27.18±0.51) X10_3]%以上。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種用于治療腫瘤疾病的藥物，其特征在于所述的藥物中的有效成分為色氨酸納米微球。正常情況下，在人類(lèi)細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞中色氨酸都不能直接從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞漿中。因此一種有效的將色氨酸傳遞至細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)也是本發(fā)明的又一大特色。本發(fā)明利用乳化法納米微球技術(shù)使色氨酸進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，采用局部給藥方式使本發(fā)明物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)釋放大量外源色氨酸到 腫瘤細(xì)胞漿，干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，色氨酸進(jìn)入細(xì)胞后對(duì)多種腫瘤具有抑制作用。
本發(fā)明中所述的色氨酸是指與商品名相同結(jié)構(gòu)的化合物，色氨酸可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)，也可以通過(guò)合成技術(shù)的方法來(lái)制備。本發(fā)明使用納米微球技術(shù)對(duì)色氨酸進(jìn)行包埋作為治療腫瘤疾病的藥物。給藥量為色氨酸25mg/kg,每周3次。


圖1為裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1色氨酸納米微球的制備1、材料:①聚乳酸-輕基乙酸 共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA),分子量100000，來(lái)源:山東醫(yī)療器械研究所②L-色氨酸分析純購(gòu)買(mǎi)自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司批號(hào):42217③二氯甲烷分析純購(gòu)買(mǎi)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司批號(hào):201103282、方法將0.2g色氨酸溶于Iml水中得到色氨酸溶液(濃度為0.2g/ml),將0.5gPLGA溶于IOml 二氯甲烷中(PLGA濃度為0.05g/ml )，得到含有PLGA的二氯甲烷溶液，將色氨酸溶液在超聲條件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，超聲分散3min，得到乳白色的均一乳液溶液，然后將溶有0.25g牛血清白蛋白的50ml水溶液在超聲條件下加入到乳液中，超聲3min,形成均一的乳液。在乳液中放入轉(zhuǎn)子,在電磁攪拌條件下攪拌4小時(shí)。攪拌結(jié)束后，將乳液離心，離心速度3000rpm，離心lOmin，取上面的溶液上清(上面的溶液)，將上清(上面的溶液)再離心，離心速度3000rpm，離心lOmin，取2次離心沉淀物，加入蒸餾水分散再離心，然后再分散，重復(fù)3次，最后的沉淀物分散在蒸餾水中，冷凍干燥。所得產(chǎn)品即是本發(fā)明。本發(fā)明的載藥量為[(27.18±0.51)X10_3]%。實(shí)施例2色氨酸納米微球的制備1、材料:同實(shí)施例12、方法將0.5g色氨酸溶于Iml水中得到色氨酸溶液(濃度為0.5g/ml),將0.5gPLGA溶于IOml 二氯甲烷中(PLGA濃度為0.05g/ml )，得到含有PLGA的二氯甲烷溶液，將色氨酸溶液在超聲條件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，超聲分散5min，得到乳白色的均一乳液，然后將溶有0.5g牛血清白蛋白的55ml水溶液在超聲條件下加入到乳液中，超聲5min，形成均一的乳液。在乳液中放入轉(zhuǎn)子，在電磁攪拌條件下攪拌5小時(shí)。攪拌結(jié)束后，將乳液離心，離心速度3500rpm，離心8min，取上清(上面的溶液)，將上清再離心，離心速度3500rpm，離心8min，取2次離心沉淀物，加入蒸餾水分散再離心，然后再分散，重復(fù)3次，最后的沉淀物分散在蒸餾水中，冷凍干燥。所得產(chǎn)品即是本發(fā)明。實(shí)施例3色氨酸納米微球的制備
1、材料:同實(shí)施例12、方法將0.1g色氨酸溶于Iml水中得到色氨酸溶液(濃度為0.lg/ml),將0.25g PLGA溶于IOml 二氯甲烷中(PLGA濃度為0.025g/ml )，得到含有PLGA的二氯甲烷溶液，將色氨酸溶液在超聲條件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，超聲分散2min，得到乳白色的均一乳液，然后將溶有0.05g牛血清白蛋白的50ml水溶液在超聲條件下加入到乳液中，超聲3min，形成均一的乳液。在乳液中放入轉(zhuǎn)子，在電磁攪拌條件下攪拌3小時(shí)。攪拌結(jié)束后，將乳液離心，離心速度3000rpm，離心lOmin，取上清(上面的溶液)，將上清再離心，離心速度3000rpm，離心lOmin，取2次離心沉淀物，加入蒸餾水分散再離心，然后再分散，重復(fù)3次，最后的沉淀物分散在蒸餾水中，冷凍干燥。所得產(chǎn)品即是本發(fā)明。試驗(yàn)例1本發(fā)明色氨酸納米微球?qū)Π┘?xì)胞的作用1、實(shí)驗(yàn)材料人淋巴癌細(xì)胞系(M-9)、乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)、肺癌細(xì)胞系(H125)、直腸癌細(xì)胞系(SW480)、子宮頸癌細(xì)胞系(A431)、腦瘤腫瘤細(xì)胞系(U373)和人白血病細(xì)胞系(HL-60)由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供；色氨酸納米微球:按照實(shí)施例1的方法制備得到2、試驗(yàn)方法以5-Fu為陽(yáng)性對(duì)照藥，將本發(fā)明藥物(色氨酸納米微球，按照實(shí)施例1的方法制備得到)加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中對(duì)人淋巴癌細(xì)胞系(M-9)、乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)、肺癌細(xì)胞系(H125)、直腸癌細(xì)胞系(SW480)、子宮頸癌細(xì)胞系(A431)、腦瘤腫瘤細(xì)胞系(U373)和人白血病細(xì)胞系(HL-60)，進(jìn)行MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，MTT可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan。在二甲基亞砜的情況下，可以被完全溶解。然后通過(guò)酶標(biāo)儀可以測(cè)定595nm波長(zhǎng)附近的吸光度。細(xì)胞活力越大，則吸光度越高；細(xì)胞活性越小，則吸光度越低。根據(jù)上述原理，求出該藥物的IC5tl結(jié)果如表I所示:表I本發(fā)明的色氨酸納米微球?qū)Ω鞣N腫瘤細(xì)胞IC5tl (mg/ml)
組別 M 9 MCF-7 H125 SW480 A431 U373 HL-6Q本發(fā)明 15.3 24.6 17.2 14.9 33.7 18.6 I 1.95-Fu 58.7 87.4 72.5 25.3 88.9 78.4 95.3尸值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05從表I中可以看出，本發(fā)明對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株均有殺傷作用，同時(shí)我們采用普通色氨酸和空白納米微球分別作為陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)色氨酸和普通納米微球?qū)δ[瘤細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用，用5-Fu作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，證明該藥物殺傷效果強(qiáng)于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物5-Fu。試驗(yàn)例2本發(fā)明色氨酸納米微球?qū)β闶笠浦擦錾L(zhǎng)的抑制作用1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C(nu/nu)裸小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SPF級(jí)，鼠齡3 4周，體重16 18g，雄性，飼養(yǎng)于超凈生物層流架內(nèi)，環(huán)境定期紫外線消毒，保持恒溫(25±2°C )、恒濕(45% 50%)，籠具、飲水均經(jīng)高壓蒸汽滅菌，實(shí)驗(yàn)操作均在無(wú)菌罩內(nèi)進(jìn)行。2、實(shí)驗(yàn)方法將直腸癌細(xì)胞(SW480)按常規(guī)方法復(fù)蘇擴(kuò)增，消化后無(wú)血清培養(yǎng)液離心洗滌2次，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)>99%。用帶6號(hào)針頭注射器抽取癌細(xì)胞懸液接種于裸鼠右前腋部皮下，每個(gè)部位接種0.2mL (含活細(xì)胞數(shù)I X IO6個(gè))，接種后每天觀察有無(wú)腫瘤形成及注射點(diǎn)有無(wú)破潰紅腫，按規(guī)定時(shí)間測(cè)量腫瘤體積，經(jīng)過(guò)3 7d潛伏期，可見(jiàn)接種部位皮下出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)，并逐漸長(zhǎng)大，呈圓形或橢圓形突出于體表，以腫瘤直徑0.5cm為成瘤。精心飼養(yǎng)，每天觀察1-2次，隔天稱(chēng)裸鼠體重，測(cè)量腫瘤大小(用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的2個(gè)互相垂直的直徑，包括皮膚厚度在內(nèi))，代入下式計(jì)算:V=1/2XAB2，V為腫瘤體積，A、B分別為腫瘤的長(zhǎng)短徑；測(cè)量瘤體的2個(gè)直徑時(shí)要使游標(biāo)卡尺每次都是相互垂直的。治療后各組裸鼠瘤重量和抑瘤率測(cè)定:最后一次用藥后24h以頸椎脫位方式處死裸鼠，剝出的腫瘤去除血污、脂肪等非瘤組織，測(cè)量瘤重，計(jì)算各組平均瘤重及抑瘤率(IR)。IR=(腫瘤對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重X 100%。將荷瘤小鼠隨機(jī)分成3組，每組8只:(I)發(fā)明組:每次腹腔注射按照本發(fā)明實(shí)施例I所述方法制備得到色氨酸納米微球25mg/kg *bw ； (2) 5_Fu組:每次腹腔注射5_Fu20mg/kg.bw ； (3)對(duì)照組:每次腹腔注射生理鹽水試劑10mL/kg.bw,均為3次/周,共4周。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組裸鼠的體重?zé)o明顯差別，與實(shí)驗(yàn)前比較雖有增長(zhǎng)但差異不顯著，如圖1所示，發(fā)明組腫瘤的瘤重及體積明顯低于其他組(P〈0.05)，抑瘤率為65.85%，5-Fu組的抑瘤率為57.21 %。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該藥物可對(duì)直腸癌SW480細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅是說(shuō)明性的，而非限制性的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.色氨酸納米微球在制備治療腫瘤疾病藥物中的用途。
2.一種制備色氨酸納米微球的方法，其特征在于包含以下步驟: (1)將色氨酸溶液在超聲條件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，得到乳白色的均一乳液； (2)將牛血清白蛋白的水溶液在超聲條件下加入到步驟(I)得到的乳液中，超聲，形成均一的乳液； (3)在步驟(2)得到的乳液中放入轉(zhuǎn)子，攪拌，將乳液離心，離心速度2500-3500rpm，時(shí)間8-12min,取上清,將上清再次離心,離心速度2500-3500rpm,時(shí)間8_12min,取2次離心的沉淀物； (4)將沉淀物加入蒸餾水中分散后，再進(jìn)行離心，然后再分散，重復(fù)3次，最后的沉淀物分散在蒸餾水中，冷凍干燥，即得。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(I)中，所述的色氨酸溶液中色氨酸的濃度為 0.lg/ml-0.5g/ml,優(yōu)選為 0.2g/ml。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于步驟(I)中，所述的含有PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的濃度為0.05g/ml，含有PLGA的二氯甲烷溶液與色氨酸溶液的體積比為10:1。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的牛血清白蛋白水溶液的濃度為0.001g/ml-0.01g/ml，優(yōu)選為0.005g/ml，牛血清白蛋白水溶液與步驟(I)得到的乳液的體積比5-6:1。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中，在乳液中放入轉(zhuǎn)子，在電磁攪拌條件下攪拌4小時(shí)，將乳液離心，離心速度3000rpm，時(shí)間IOmin,取上清，將上清再次離心，離心速度3000rpm,時(shí)間lOmin 。
7.按照權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的方法制備得到的色氨酸納米微球。
8.如權(quán)利要求7所述的色氨酸納米微球，其特征在于色氨酸納米微球的載藥量為[(27.18±0.51) Χ1(Γ3]% 以上。
9.一種用于治療腫瘤疾病的藥物，其特征在于所述的藥物中的有效成分為色氨酸納米微球。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種色氨酸納米微球在制備治療腫瘤疾病藥物中的用途。本發(fā)明利用乳化法納米微球技術(shù)將色氨酸包埋使其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)釋放大量外源色氨酸到腫瘤細(xì)胞漿，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。研究表明，色氨酸納米微球?qū)θ肆馨桶┘?xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系、直腸癌細(xì)胞系、子宮頸癌細(xì)胞系、腦瘤腫瘤細(xì)胞系和人白血病細(xì)胞系具有較強(qiáng)的殺傷作用，通過(guò)局部給藥方式，該藥物可對(duì)直腸癌細(xì)胞株裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。
文檔編號(hào)A61K31/405GK103110623SQ20131002975
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者張志仁, 馬和平, 楊寶峰, 劉小燕, 初文峰, 趙丹, 王秋石 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)