專利名稱：一種男性dna避孕疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種男性DNA避孕疫苗，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
當(dāng)前人口的快速增長是一個亟待解決的全球問題，尋找一種安全、有效、廉價、易接受的避孕方法對于全世界特別是發(fā)展中國家是十分迫切的。目前雖然已經(jīng)有多種藥物、工具及手術(shù)等用于控制生育，但男性避孕方法還局限于傳統(tǒng)的體外排精、絕育術(shù)和使用避孕套等。因而開發(fā)一種使用方便、安全、高效、廉價、可逆的男性避孕方法一直是當(dāng)前生殖與避孕研究領(lǐng)域的焦點問題之一。避孕疫苗由于具有靶特異性好、效果持續(xù)長久、作用可逆等特點，已成為男性避孕藥具中極具發(fā)展前途的研究方向。其基本原理就是應(yīng)用機(jī)體自身的防御機(jī)制來產(chǎn)生對抗計劃外妊娠的免疫反應(yīng)，具體地說，就是使用生殖過程中有關(guān)的抗原成分制成避孕疫苗，誘導(dǎo)受者產(chǎn)生相應(yīng)的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而阻抑受孕。從理論上講，在受精卵形成、發(fā)育過程中的多種調(diào)控因素都可以作為免疫避孕的靶抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體可以通過中和、阻斷這些因素的生理作用達(dá)到避孕的目的。近年來，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用篩選出了大量具有干擾精卵識別和抗生育作用精子特異性蛋白，但研究結(jié)果并不盡人意。目前尚沒有用于臨床的避孕疫苗，研究較多的精子疫苗有SP-10，SAMP32，F(xiàn)A-1, YLP-12,PH-20，Izumo,LDH-C4 ,Eppin蛋白，和SP56等，但沒有任何一種疫苗達(dá)到理想的避孕效果。目前所研究的避孕疫苗避孕效果不理想、制作工藝復(fù)雜、不利于保存、使用不方便。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種性能穩(wěn)定、抗生育效果良好的男性DNA避孕疫苗。其 制備工藝簡單、易于大量開發(fā)生產(chǎn)。為解決上述問題，本發(fā)明提供的男性DNA避孕疫苗由Crisp-1DNA疫苗和天然高分子物質(zhì)殼聚糖組成。確切地說，本發(fā)明的男性DNA避孕疫苗由真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1-Crisp-l和殼聚糖組成，為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1-Crisp-l經(jīng)殼聚糖包裹后形成的納米微粒。上述方案中，所述的納米微粒粒徑范圍為70_500nm。本發(fā)明的男性DNA避孕疫苗，其核心成分為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. Ι-Crisp-l，載藥率達(dá)90%以上，納米微粒形態(tài)規(guī)則，近球形。本發(fā)明的男性DNA避孕疫苗，其制備方法是應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1-Crisp-l,然后采用復(fù)凝法制備殼聚糖-pcDNA3.1-Crispl納米復(fù)合物。Crisp-ι是由附睪頭部的上皮細(xì)胞合成分泌的一種雄激素依賴型糖蛋白。由于它在生殖過程中的多個環(huán)節(jié)起著重要作用，如調(diào)控精子的獲能，參與精卵融合等，Crisp-1是一種極具前景的候選避孕疫苗。殼聚糖是一種帶正電荷的天然聚合物，無細(xì)胞毒性，來源廣泛，價格低廉，具有較高的生物相容性和生物降解性，并且易與DNA結(jié)合形成納米微粒，有文獻(xiàn)報導(dǎo)殼聚糖還具有免疫佐劑的功能，能優(yōu)化DNA疫苗接種的效果。本發(fā)明中殼聚糖與質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1形成納米微粒，作為一種基因疫苗的轉(zhuǎn)運載體，增強(qiáng)該DNA疫苗的免疫效果。一般情況下，殼聚糖分子在酸性條件下帶正電荷，而質(zhì)粒DNA分子帶負(fù)電荷，細(xì)胞膜上也帶一定的負(fù)電荷，因此DNA難以通過脂質(zhì)的細(xì)胞膜被細(xì)胞吸收，在體內(nèi)又易被核酸酶降解而迅速清除。采用復(fù)凝聚法制備殼聚糖-DNA疫苗納米復(fù)合物，主要是利用殼聚糖與DNA疫苗之間的靜電作用和硫酸鈉對殼聚糖的鹽析作用，使殼聚糖分子和質(zhì)粒DNA分子復(fù)合壓縮并包裹纏繞，形成帶正電荷的納米顆粒，增加DNA分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量，并增強(qiáng)DNA疫苗在體內(nèi)抗核酸酶的能力，使其免受生物環(huán)境的破壞，有效導(dǎo)入至靶細(xì)胞，從而增強(qiáng)DNA疫苗的主動免疫效果，更為持久地發(fā)揮效應(yīng)。本發(fā)明的男性DNA避孕疫苗，較傳統(tǒng)的基因疫苗制備工藝簡單，可顯著延長藥物在體內(nèi)外的釋放時間，保護(hù)DNA疫苗不受核酸酶的降解，并顯著增強(qiáng)DNA避孕疫苗的免疫效應(yīng)和抗生育效果。


圖1本發(fā)明制備的制備殼聚糖-pcDNA3.1-Crispl納米復(fù)合物掃描電鏡圖。
具體實施例方式以小鼠Crisp-1cDNA為靶基因，應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1-Crisp-l,然后采用復(fù)凝法制備殼聚糖-pcDNA3. 1-Crispl納米復(fù)合物,對其相關(guān)物理學(xué)、生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定，觀察其免疫避孕效果并對其進(jìn)行安全性評價。1.真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1的構(gòu)建
取小鼠新鮮附睪組織約30mg立即勻漿，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。設(shè)計I對引物， 上游引物 5’ - gcctAAGCTTACTCTGAAGCCAGCACCATG -3’ ( SEQ ID NO 1)
下游引物 5’ - tgagGGATCCCTACATGGTCCTGGCTAGGAG -3’ (SEQ ID NO 2)
以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用PCR產(chǎn)物清潔試劑盒回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行TA亞克隆，雙酶切Crisp-1 TA克隆及真核表達(dá)載體pcDNA3. 1，T4DNA連接酶連接上述酶切回收產(chǎn)物，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Crisp-1，行雙酶切鑒定和測序驗證。酶切鑒定結(jié)果和測序結(jié)果均表明真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1構(gòu)建成功。2.殼聚糖-pcDNA3.1-Crispl納米復(fù)合物的制備及理化性質(zhì)測定 采用復(fù)凝法制備殼聚糖納米粒，計算不同質(zhì)粒濃度下的包埋率。稱取純化的殼聚糖10. Omg，溶解于1%冰乙酸溶液中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至5. 5，稀釋溶液使殼聚耱濃度為O. 02%(ff/V)，O. 22 μ m針式濾器過濾除菌。取適量pcDNA3. 1-Crisp-l加入25mMNa2S04溶液中，調(diào)節(jié)其濃度分 別為50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL。將0. 02%殼聚糖溶液和3種不同濃度的pcDNA3. l-Crisp-l/Na2S04(25mM)溶液均預(yù)熱至55°C，分別取等體積的殼聚糖溶液與pcDNA3.1-Crisp-1溶液迅速混勻，渦旋30S，室溫靜置30min，即得pcDNA3. 1-Crisp-l-殼聚糖納米粒懸液。結(jié)果顯示，三種濃度下，殼聚糖納米粒對質(zhì)粒DNA的包裹率均達(dá)90%以上，透射電子顯微鏡觀察如圖1所示。結(jié)果顯示，載基因殼聚糖納米粒形態(tài)較為規(guī)則，近球形，大小較均一，散在分布，分散性好。激光粒度分析儀測定結(jié)果表明，納米粒粒徑直徑約189.3nm，多分散指數(shù)為O. 459，粒徑分布范圍較窄。Zeta電位約為+0.2 mV。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，殼聚糖與DNA疫苗結(jié)合后使質(zhì)粒DNA阻滯于加樣孔中，未觀察到質(zhì)粒跑出，說明殼聚糖能有效地包裹質(zhì)粒DNA。但是，向各組樣品加入DNase I后，電泳結(jié)果顯示裸質(zhì)粒DNA被DNase I消化；而殼聚糖納米微粒中的質(zhì)粒DNA并未受影響,說明殼聚糖能保護(hù)質(zhì)粒DNA不受核酸酶降解。細(xì)胞毒性檢測(MTT)試驗結(jié)果顯示殼聚糖組與正常對照組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0. 05)，但明顯高于脂質(zhì)體組，說明殼聚糖幾乎無細(xì)胞毒性。間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)載DNA殼聚糖納米微球直接轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中可看到明亮的綠色熒光，說明殼聚糖可有效的介導(dǎo)Crisp-1DNA疫苗在真核細(xì)胞中表達(dá)。3.免疫避孕效果的研究
3.1動物分組
將雌、雄性BALB/c小鼠分別隨機(jī)分為5組A組生理鹽水組；B組pcDNA3.1 ( + )空載體組；C組裸質(zhì)粒pcDNA3.1-CrisplDNA疫苗組；D組CS/Crispl納米粒組；E組重組mCRISPl蛋白組。3. 2免疫方式及血清樣本的收集
以75mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，待實驗小鼠全身麻醉后，暴露股四頭肌，先注射25%的高滲蔗糖溶液50 μ L，15 min后在相同部位注射DAN疫苗50 μ L，每只動物兩側(cè)肢體輪流注射，初次免疫及加強(qiáng)免疫共3次(O周、2周和4周)，每次接種DNA量為50 μ g。A組給予等量的生理鹽水，重組mCRISPl蛋白組初次免疫時采用完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫時使用不完全弗氏佐劑。分別于每次免 疫前一天及末次免疫后2、4、6、8周內(nèi)眥靜脈取血100 150 μ L，室溫靜置2 h后，3000 Xg離心20 min，取上清-70 °C貯存?zhèn)溆谩?. 3血清中Crispl抗體水平檢測
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中Crispl抗體水平，結(jié)果顯示無論是雌性還是雄性小鼠，生理鹽水和空載體pcDNA3. 1(+)均未誘導(dǎo)特異性Crispl抗體產(chǎn)生，而pcDNA3.1-Crispl免疫組小鼠均在初次免疫后2周即產(chǎn)生特異性抗體，抗體滴度顯著高于空載體組和生理鹽水組，并于末次免疫后2周達(dá)到最高峰，停止免疫后8周抗體滴度又逐漸緩慢下降。CS/Crispl納米粒和重組mCRISPl蛋白免疫小鼠血清抗體滴度顯著高于裸質(zhì)粒pcDNA3.1-Crispl免疫小鼠(p〈0. 05)。 但CS/Crispl納米粒免疫組小鼠和重組mCRISPl蛋白免疫組小鼠相比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義
3.4抗生育效果評價
第三次免疫后2周，將各組雌雄性小鼠分別與生育力正常的異性小鼠進(jìn)行合籠，雌雄比例為2 :1。次日早晨檢測陰道栓，將可見陰道栓的雌鼠單獨喂養(yǎng)，3周后觀察各組小鼠的妊娠率和每窩產(chǎn)仔數(shù)。結(jié)果如表1、表2所示，與生理鹽水對照組相比，空載體pcDNA3.1 (+)組雌雄性小鼠妊娠率及平均每窩產(chǎn)仔數(shù)無明顯差別，但其他三組雌雄性小鼠妊娠率及平均每窩產(chǎn)仔數(shù)均呈不同程度降低。盡管pcDNA3. Ι-mCRISPl免疫組雌雄性小鼠生育率和平均每窩產(chǎn)仔數(shù)均顯著低于生理鹽水組和PCDNA3.1 (+)免疫組，但顯著高于CS/Crispl納米粒和重組mCRISPl蛋白免疫組。雌雄性CS/Crispl納米粒和重組mCRISPl蛋白免疫組小鼠生育率和平均每窩產(chǎn)仔數(shù)均無顯著性差異。雌雄性小鼠之間生育抑制率差異也無顯著性意義。提示殼聚糖納米粒可顯著提高DNA疫苗的抗生育效果。
表I雌性小鼠免疫后生育力的影響
權(quán)利要求
1.一種男性DNA避孕疫苗，其特征在于，由真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.1-Crisp-1和殼聚糖組成，為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1經(jīng)殼聚糖包裹后形成的納米微粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的男性DNA避孕疫苗，其特征在于，所述的納米微粒粒徑范圍為7_500nmo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的男性DNA避孕疫苗，其特征在于，所述的納米微粒近球形。
4.權(quán)利要求1所述的男性DNA避孕疫苗的制備方法，其特征是應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1-Crisp-l,然后采用復(fù)凝法制備殼聚糖-pcDNA3.1-Crispl納米復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明的男性DNA避孕疫苗由真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1和殼聚糖組成，為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1經(jīng)殼聚糖包裹后形成的納米微粒。所述的納米微粒粒徑范圍為70-500nm。本發(fā)明的男性DNA避孕疫苗，載藥率達(dá)90%以上，納米微粒形態(tài)規(guī)則，近球形。本發(fā)明可顯著延長藥物在體內(nèi)外的釋放時間，保護(hù)DNA疫苗不受核酸酶的降解，并顯著增強(qiáng)DNA避孕疫苗的免疫效應(yīng)和抗生育效果。
文檔編號A61K48/00GK103055308SQ201310031448
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者楊菁, 羅金, 徐望明, 林俊杰, 尹太郎, 李輝 申請人:武漢大學(xué)