專利名稱：一種非洲豬瘟蛋白工程疫苗的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種非洲豬瘟蛋白工程疫苗的制備。具體地，利用基因重組技術(shù)，將非洲豬瘟重要結(jié)構(gòu)蛋白P72、P54以及紅細(xì)胞凝集素HA多個(gè)T細(xì)胞表位和純化標(biāo)簽串聯(lián)，并克隆入載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過發(fā)酵，純化、乳化工藝制備，得到具有細(xì)胞免疫和體液免疫效果的非洲豬瘟蛋白工程疫苗，用于非洲豬瘟疫情的防控。
背景技術(shù)：
非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒ASFV引起的豬的一種急性、熱性傳染性疫病。國(guó)際獸醫(yī)局將其列為A類動(dòng)物疫病，我國(guó)已將此病規(guī)定為一類動(dòng)物傳染病。ASFV是一個(gè)復(fù)雜的二十面體病毒，其特征與虹彩病毒科和痘病毒科的成員相似。ASFV為雙股線性DNA基因組，根據(jù)病毒株的不同其大小為170 190 kbCBlasco等，1989 ;Tabares等，1980)。ASFV是一種非常復(fù)雜的病毒，基因組共有150多個(gè)開放閱讀框，共編碼100多種多肽，在不同的實(shí)驗(yàn)室所得到的結(jié)果有一定差異。ASFV病毒可以編碼34種以上的結(jié)構(gòu)蛋白，雖然病毒的結(jié)構(gòu)蛋白很多，但是證實(shí)具有抗原性的蛋白僅有幾種，Tabares (1980)等發(fā)現(xiàn)6種，VP72，VP162，VP146，VP54，VP34，VP23.5，其中p72、p54、p30和pl2，具有良好的抗原性。P72是一個(gè)主要的衣殼蛋白，占整個(gè)病毒粒子總蛋白的32%，國(guó)外研究表明，不同區(qū)域的ASFV病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的P72抗體的相應(yīng)抗原表位都相當(dāng)保守，而且抗原性很穩(wěn)定，常被用來作為血清學(xué)檢測(cè)和免疫制劑。膜結(jié)構(gòu)蛋白P54由D183L基因編碼，含有一段跨膜區(qū)域，主要集中在衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處，其與輕鏈細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白DLC8存在特殊的交叉反應(yīng)，并在細(xì)胞內(nèi)攝作用及病毒加工過程中其重要作用。感染病毒后復(fù)制早期，病毒可激活細(xì)胞凋亡蛋白酶，誘發(fā)細(xì)胞脫噬作用。

ASFV有很好的抗原性，在感染期間能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性抗體。在感染后4d能檢測(cè)到IgM,感染后6 8 d能檢測(cè)至Ij IgG (Sanchez- Vizcaino等，1979)。并且初次感染后血清中的抗體能維持很長(zhǎng)一段時(shí)間。抗ASFV的抗體能延遲臨床癥狀的出現(xiàn)，減輕病毒血癥，并能保護(hù)感染豬不會(huì)死亡(Onisk等，1994 ;Schlafer等，1984)。早期的實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)感染和自然感染ASFV的豬血清中沒有中和抗體。然而，康復(fù)豬用口蹄疫疫苗免疫時(shí)能產(chǎn)生正常水平的中和抗體，該實(shí)驗(yàn)證明了 ASFV對(duì)體液免疫反應(yīng)不存在負(fù)面影響(De Boer,1967)。其他學(xué)者(Ruiz Gonzalvo等，1986)也證明不同的ASFV分離株大部分能被恢復(fù)期血清中和，但總有10%的ASFV不能被中和。另外，Gomez-Puertas等(1996)報(bào)道，恢復(fù)期豬血清中的ASFV抗體能有效地中和感染易感細(xì)胞之前或之后的ASFV。然而，現(xiàn)在還不能證明ASFV的特異性抗體完全符合經(jīng)典的病毒中和試驗(yàn)；另一方面，來自康復(fù)豬的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能殺死感染ASFV的巨噬細(xì)胞(Martins和Leitao，1994)，這表明細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能是保護(hù)性免疫反應(yīng)的重要組成部分。盡管研究人員已經(jīng)對(duì)ASFV的生物學(xué)知識(shí)已經(jīng)有了深入的了解，但目前還無法治療ASF，也沒有有效的疫苗來預(yù)防ASF。自從1963年第一個(gè)ASF弱毒疫苗在葡萄牙應(yīng)用以來(Manso Ribeiix)等，1963)，人們做了許多努力以期制備滿意的疫苗。滅活疫苗不能產(chǎn)生任何保護(hù)作用。弱毒活疫苗能使一些豬免受同源ASFV毒株的感染，但是這些豬部分會(huì)成為病毒攜帶者或出現(xiàn)慢性病變，當(dāng)大規(guī)模使用弱毒活疫苗時(shí)，這種可能性會(huì)增加(MansoRibeiro等，1963 ;Sanchez Botija, 1963)。其他研究表明，抗同源或一些異源ASFV毒株的豬血清能抑制(體外)與異源毒株相關(guān)但與異源毒株不同的毒株對(duì)細(xì)胞的感染(RuizGonzalvo等，1986)。近年來的發(fā)現(xiàn)表明，針對(duì)ASFV蛋白p30、p54和p72的中和抗體不足以產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)(Neilan等，2004)。以往的疫苗均是以滅活疫苗和弱毒疫苗為基礎(chǔ)進(jìn)行嘗試，但效果均不理想。未來進(jìn)一步開發(fā)以特異性靶向基因剔除(如編碼入侵宿主防御系統(tǒng)的基因)為目標(biāo)的安全性好和效力高的重組弱毒疫 苗可能會(huì)產(chǎn)生較好的效果。盡管分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于界定體內(nèi)ASFV相關(guān)毒力因子，但時(shí)至今日，由于其殘余的毒力，仍沒有證據(jù)表明合格的重組弱毒疫苗開發(fā)成功。研究人員(Jordi M.Argilaguet等,2012)基于成功誘導(dǎo)免疫反應(yīng)抗原特性，開發(fā)了 DNA疫苗，但是免疫后僅能誘導(dǎo)部分保護(hù)。ASF抗體調(diào)節(jié)要求多個(gè)針對(duì)許多不同病毒蛋白的反應(yīng)，有些可能涉及病毒中和反應(yīng)。也可能是一些尚未發(fā)現(xiàn)的中和表位在保護(hù)中發(fā)揮了重要作用。HA為紅細(xì)胞凝集素，能夠在體外缺少ASFV的情況下產(chǎn)生對(duì)紅血球的凝集反應(yīng)(Ruiz-Gonzalvo，F(xiàn)，1993)。使用非純化的HA免疫靶動(dòng)物，可以抵抗同源病毒的感染(Ruiz-Gonzalvo，F(xiàn)，1993)。ASFV基因組結(jié)構(gòu)分析表明基因之一與T細(xì)胞粘附受體相似的序列⑶2，這個(gè)蛋白直接參與紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，而ASFV感染免疫細(xì)胞亦會(huì)誘導(dǎo)此現(xiàn)象(Borca，M.V.等，1994)，研究人員認(rèn)為⑶2與HA為同一蛋白。研究表明HA蛋白是病毒粒子的次要組件，而且只能通過HA蛋白的高抗體滴度才能檢測(cè)到。電鏡掃描研究表明(Quintero，J.C等，1986)，病毒粒子粘附后并不穿透紅血球，而是通過一個(gè)通道連接在表面外層.HA可以調(diào)節(jié)這種粘附作用，用這種方式，病毒粒子侵染免疫系統(tǒng)，這可以解釋為什么ASFV感染后幸存豬都要經(jīng)歷一個(gè)漫長(zhǎng)的病毒血癥階段。眾多研究表明ASFV HA含有誘導(dǎo)感染抑制的表位，血凝抑制可能會(huì)不同(Blasco，R.等 1989 ;Carrascosa, A.L 等 1987 ;del Val, M 等 1986)。F.Ruiz-Gonzalvo (1996)等的研究結(jié)果也表明抗體調(diào)節(jié)機(jī)制可能有助于抵抗疾病，HA似乎是部分免疫保護(hù)抗體的目標(biāo)。但是HA并非真正的抗原(Ruiz-Gonzalvo, F, 1993),可能它對(duì)于接種較高劑量重組蛋白從而產(chǎn)生較好的保護(hù)效果或者提高抗原提呈給免疫系統(tǒng)是必須的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)已分離的非洲豬瘟病毒保守結(jié)構(gòu)蛋白P72，膜結(jié)構(gòu)蛋白P54與紅細(xì)胞凝集素HA的多個(gè)T細(xì)胞表位聯(lián)合后與純化標(biāo)簽串聯(lián)，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，經(jīng)過發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的蛋白工程疫苗。本發(fā)明提供的疫苗制備方法可保證疫苗能夠激發(fā)有效的細(xì)胞免疫及體液免疫，能夠用于預(yù)防非洲豬瘟流行。本發(fā)明的目的之一在于提供了一種新的能用于預(yù)防非洲豬瘟的疫苗多肽及其疫苗組合物。本發(fā)明的目的之二在于提供了所述蛋白工程疫苗的構(gòu)建及獲得方法。本發(fā)明的目的之三在于提供了能夠表達(dá)所述非洲豬瘟蛋白工程疫苗的基因工程菌株。
本發(fā)明的目的之四在于提供了所述非洲豬瘟蛋白工程疫苗的制備方法。本發(fā)明的目的之五在于提供了所述蛋白工程疫苗在免疫靶動(dòng)物體內(nèi)能夠誘發(fā)有效的細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)。在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于非洲豬瘟預(yù)防的疫苗多肽及其組合物。其含有非洲豬瘟保守結(jié)構(gòu)P72和膜蛋白P54，同時(shí)，由于紅細(xì)胞凝集素HA能夠誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此，我們利用分子生物學(xué)軟件分析HA蛋白的T細(xì)胞表位，將獲得表位與結(jié)構(gòu)蛋白串聯(lián)，獲得完整的具有細(xì)胞免疫和體液免疫效果的非洲豬瘟蛋白工程疫苗蛋白。所述蛋白工程疫苗包括主要結(jié)構(gòu)蛋白以及HA T細(xì)胞免疫表位串聯(lián)到一起所形成的蛋白或多肽或藥學(xué)上可接受的鹽以及多肽、蛋白所需要的載體。串聯(lián)可以通過遺傳工程方法進(jìn)行，蛋白工程疫苗中除了含有主要結(jié)構(gòu)蛋白和紅細(xì)胞凝集素T細(xì)胞免疫表位外，還包含非免疫活性物質(zhì)。所述非免疫活性物質(zhì)為各個(gè)多肽的連接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐劑活性，主要有純化標(biāo)簽、接頭肽、化學(xué)修飾部分、N端信號(hào)肽和C端多聚腺苷酸等。所述藥學(xué)上可接受的鹽是指無毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)，適用于人或動(dòng)物組織的鹽。非活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在第二方面，本發(fā)明提供了一種核苷酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面所述的非洲豬瘟疫苗多肽。本發(fā)明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通過人工合成方式合成蛋白工程疫苗基因片段，經(jīng)過基因工程操作，將基因片段克隆入載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選、發(fā)酵、純化后獲得豬瘟疫苗多肽。在本發(fā)明中可以對(duì)該核酸進(jìn)行常規(guī)的分子生物學(xué)操作，如:PCR、限制性內(nèi)切酶酶切，連接等。核酸設(shè)計(jì)5’端和3’端均加入酶切位點(diǎn)，所述的基因操作技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在第三方面，本發(fā)明提供了一種載體，其除了含有本發(fā)明第二方面所述的編碼非洲豬瘟蛋白工程疫苗氨基酸的核苷酸分子，還含有與該核苷酸序列可操作的連接，在原核細(xì)胞表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)所需的表達(dá)控制元件。最基本的表達(dá)控制元件包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)子，選擇性標(biāo)記等，這些調(diào)控元件為本領(lǐng)域所熟知。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體。在第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的載體。宿主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含有本發(fā)明所述編碼蛋白的基因序列，而后經(jīng)檢測(cè)具有良好的的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性后，可用于發(fā)酵表達(dá)生產(chǎn)所需的非洲豬瘟蛋白工程疫苗。在第五方面，本發(fā)明提供了一種非洲豬瘟蛋白工程疫苗的制備方法，其包括以下步驟:工程菌發(fā)酵表達(dá)蛋白工程疫苗多肽，經(jīng)過粗純化與精細(xì)純化工藝以及后續(xù)乳化工藝，獲得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌體破碎、包涵體洗滌、離心、變性、親和層析、疏水層析、復(fù)性、乳化等。本發(fā)明中涉及的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防非洲豬瘟的疫苗，其包括本發(fā)明第一方面所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明所述的藥學(xué)上可接受的載體為免疫增強(qiáng)劑或免疫佐劑，優(yōu)選免疫佐劑為50V2佐劑。在第七 方面，本發(fā)明提供了第六方面所述的蛋白工程疫苗的應(yīng)用。疫苗可以一定有效劑量肌肉注射，皮內(nèi)或皮下注射免疫動(dòng)物，能夠激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。另外，需要指出的是，在本申請(qǐng)的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其他具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)的方面對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人來說是顯而易見的。此外，本發(fā)明亦使用了公開文獻(xiàn)，他們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書說界定的本發(fā)明范圍。圖1為含有非洲豬瘟蛋白工程疫苗蛋白編碼基因的表達(dá)載體pRSETB-ASFV (P72/54) -HA 示意圖。圖2為限制性內(nèi)切酶瓊脂糖凝膠電泳圖,其中Ianel為DNA marker,由上至下依次為 2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp ；lane2 為 pRSETB-ASFV (P72/54)-HA 質(zhì)粒雙酶切圖；lane3為pRSETB-ASFV(P72/54)-HA完整質(zhì)粒；lane4為陰性對(duì)照。圖3為工程菌菌種誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE分析結(jié)果，其中Ianel為pRSETB - ASFV(P72/54)-HA/ BL21 (DE3，Plys)工程菌誘導(dǎo)表達(dá)(箭頭所指為目標(biāo)蛋白)；lane2為蛋白marker,由上至下依次為 97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD ；lane3 為未誘導(dǎo)表達(dá)陰性對(duì)照菌。圖4為純化蛋白WESTERNBL0T印記結(jié)果，其中I為預(yù)染蛋白分子量marker，由上至下依次為:95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、26KD ；2為純化的疫苗蛋白；3為陰性對(duì)照。圖5首免、二免、三免后14天抗體檢測(cè)結(jié)果 圖6 IFN Y-ELISP0T檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例中所述的具體試 驗(yàn)方法描述僅是示例性描述，用于詳細(xì)闡述本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制，依據(jù)本說明書的諸多變化為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。實(shí)施例一非洲豬瘟蛋白工程疫苗框架的設(shè)計(jì)思路
綜合非洲豬瘟病毒的生物學(xué)特性，本發(fā)明利用DNAStar及ANTHEPR0T軟件對(duì)其紅細(xì)胞凝集素HA進(jìn)行的親水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)可能的細(xì)胞免疫表位，并將主要保守結(jié)構(gòu)蛋白P72，膜蛋白P54與T細(xì)胞表位串聯(lián)，作為蛋白工程疫苗的骨架結(jié)構(gòu)該疫苗的總體結(jié)構(gòu)為:P72-P54-HA。實(shí)施例二大腸桿菌表達(dá)載體與表達(dá)菌株的構(gòu)建
實(shí)施例一中設(shè)計(jì)好的多肽編碼核苷酸由上海英俊生物技術(shù)公司合成，P72-P54-HA基因片段兩端分別設(shè)計(jì)了 EcoR I (5’端)和HindIII (3’端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。上海英俊生物技術(shù)公司把片段合成后克隆到PMD18T載體上，提取質(zhì)粒并測(cè)序正確后，將重組質(zhì)粒命名為PMD18T-ASFV(P72/54)-HA，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌寄回本公司。將含有pMD18T-ASFV(P72/54)-HA重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，次日按照Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒使用手冊(cè)。將質(zhì)粒使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理，大腸桿菌表達(dá)載體選用Pharmacia biotech公司的pRSETB質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII處理，酶切條件:10μ I反應(yīng)體系，體系內(nèi)加入2 μ I質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶為5個(gè)活性單位(New England biolabs)，加入IOX緩沖液I μ 1，去離子水補(bǔ)齊，37°C酶切1.5小時(shí)。酶切結(jié)束后加入Iy 1200mM EDTA終止反應(yīng)。在1%瓊脂糖凝膠電泳中，電泳30分鐘。紫外燈下將2.9kb pRSETB質(zhì)粒、1039bp的ASFV(P72/54)-HA片段，按照Qiagen公司凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。按照載體:片段1:2-3的比例將蛋白工程疫苗核苷酸片段和表達(dá)載體混合，反應(yīng)體系15 μ 1，由T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，16°C連接過夜，獲得重組質(zhì)粒命名為pRSETB-ASFV (Ρ72/54)-HA (見圖1)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3 ) pLysS。感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞的制備:取一大腸桿菌BL21 (DE3)單菌落于2mlLB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm速度振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，取Iml培養(yǎng)物接種于IOOmlLB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm速度培養(yǎng)3小時(shí)；將菌液冰浴2小時(shí)，然后2500g，低溫離心20分鐘，收集菌體；加入 IOOml 冰冷的 Trituration 緩沖液(100mmol/L CaCl2, 70mmol/L MgCl2,40mmo1 /L醋酸鈉，PH5.5)，混勻，置冰浴45分鐘，1800g低溫離心15分鐘，棄上清，加入IOml冰冷Trituration緩沖液懸浮細(xì)胞，按每份200 μ I分裝，_70°C保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化:將200 μ I感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，然后加入3 μ 1DMS0,混勻，加入2 μ I鏈接反應(yīng)液，再次混勻，置冰上30分鐘，42°C 45秒，然后迅速放回冰浴1.5分鐘，加入2mlLB培養(yǎng)液，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)，4000g低溫離心10秒鐘棄上清，用200 μ ILB培養(yǎng)基重懸菌體；將菌液鋪于含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂培養(yǎng)板上，涂勻，室溫放置30分鐘，倒置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)。篩選平板上的克隆，提取質(zhì)粒，EcoR I和HindIII雙酶切，可以切出相應(yīng)非洲豬瘟蛋白工程疫苗基因大小的片段初步確定為陽(yáng)性克隆見圖2。誘導(dǎo)表達(dá):即將陽(yáng)性克隆過夜培養(yǎng)，次日早上按1:100轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)3小時(shí)后，加入0.5mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，制備樣品；常規(guī)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況——在42.9KD分子量處，見到特異性條帶為正確克隆；取正確克隆，放大培養(yǎng)，SDS-PAGE證實(shí)表達(dá)正確后，將目標(biāo)蛋白純 化后使用常規(guī)western-blot進(jìn)一步證實(shí)其表達(dá)準(zhǔn)確性,見圖3,圖4 ;將獲得的菌種委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過上述構(gòu)建及鑒定程序后，可挑選測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆作為工程菌進(jìn)行原始種子庫(kù)的建立及菌種保藏，菌種命名為 pRSETB-ASFV (P72/54)-HA/ BL21 (DE3，Plys)。實(shí)施例三工程菌的發(fā)酵、純化與乳化
發(fā)酵取生產(chǎn)用基礎(chǔ)種子庫(kù)菌種，開啟后劃種培養(yǎng)基(LB+Amp)平板2 3塊，培養(yǎng)后挑取平板中典型集落8 10個(gè)，分別培養(yǎng)后保存，然后分別進(jìn)行非洲豬瘟蛋白工程疫苗融合蛋白表達(dá)量測(cè)定，重復(fù)三次，選其中非洲豬瘟蛋白工程疫苗融合蛋白表達(dá)量最高的一份供生產(chǎn)制備種子液用，其表達(dá)量應(yīng)符合原始菌種庫(kù)的表達(dá)量。挑取單菌接種于試管LB液體培養(yǎng)基中，在搖床中37°C培養(yǎng)震蕩12小時(shí)。將試管中的菌以1:100的接種量接入搖瓶，37°C遙床培養(yǎng)至0D600=3，即可以按10%比例接種發(fā)酵罐。發(fā)酵用培養(yǎng)基為改造的LB培養(yǎng)基，用蒸餾水配制，其中不含有任何抗生素，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行溶氧和PH值的校正，進(jìn)行實(shí)罐滅菌。降溫至37°C時(shí)，調(diào)整轉(zhuǎn)數(shù)至300rpm，標(biāo)定pH及溶氧(OD)零點(diǎn)。發(fā)酵溫度為37.0±0.1°C,根據(jù)工程菌生長(zhǎng)情況到后期可適當(dāng)調(diào)整溫度，并作必要的培養(yǎng)基成分添加，溶氧控制在20%左右，pH控制在7.0，接種后培養(yǎng)菌體0D600=1.0 1.2時(shí)流加補(bǔ)料500ml，補(bǔ)料后I小時(shí)加入IPTG (終濃度為ImM)誘導(dǎo)表達(dá)，連續(xù)誘導(dǎo)6個(gè)小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束，取樣做SDS-PAGE檢定表達(dá)情況。純化將收集到的菌體，每IOOg用包含體洗液1(1% Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混懸后進(jìn)行超聲，2000W超聲裂解I小時(shí)。包含體沉淀用8M尿素，0.3%β -ME，20mM Tris-cl (pH=8.00)混勻，室溫?cái)嚢?4 小時(shí)，8000rpm低溫離心 30min，棄去沉淀。上清液保留，并用BCA protein assay kit商品化試劑盒(PIERCE)檢測(cè)蛋白濃度。采用稀釋復(fù)性法將變性蛋白復(fù)性，蛋白終濃度為lOOyg/ml。復(fù)性液采用Tris(PH8.0)緩沖體系，加入0.3M精氨酸，4°C攪拌復(fù)性48小時(shí)。復(fù)性液用pH=8.0的20mM磷酸緩沖液，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，平衡上親和層析柱，用pH=8.0的20mM磷酸緩沖液，0.5M氯化鈉，
0.5M 咪唑洗脫；再用 1.5M(NH4) 2S04UOOmM EDTA, pH=8.5 的 IOmM Na2HPO4 平衡上疏水層析柱，再平衡，用pH=8.5的IOmM Na2HPO4洗脫，即得非洲豬瘟蛋白工程疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及WESTERNBL0T印記確定純化產(chǎn)物為目標(biāo)蛋白。乳化將純化的半成品用滅菌的PBS稀釋至200 μ g /ml。取法國(guó)賽比克公司50V2佐劑經(jīng)121°C，滅菌15分鐘，備用。按油相:水相=50:50的比例配制，先將油相加入乳化缸內(nèi)，開動(dòng)攪拌機(jī)以80-100r/min的速度緩慢攪拌，緩緩加入水相，加完后再攪拌2min，然后以5500 r/min高速循環(huán)乳化9min,制成油包水單相疫苗。實(shí)施例四重組非洲豬瘟蛋白工程疫苗安全性試驗(yàn) 材料
疫苗:重組非洲豬瘟蛋白工程疫苗，批號(hào)20120301，20120302, 20120303。試驗(yàn)動(dòng)物(I) 18_22g小白鼠17只，購(gòu)自青島市藥檢所，30日齡，三元雜交斷奶仔豬8頭，城陽(yáng)區(qū)紅島鎮(zhèn)大西洋村生豬養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

方法
疫苗對(duì)小白鼠的安全性
皮下注射小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共注射15只小白鼠。同時(shí)設(shè)定2只陰性對(duì)照，每只皮下注射生理鹽水50V2乳劑0.5ml。連續(xù)觀察10天，觀測(cè)小白鼠的健康狀況。疫苗對(duì)仔豬的安全性
仔豬共分為三個(gè)批次組和空白對(duì)照組，每組2頭。批次組耳后肌肉注射研發(fā)中心提供的非洲豬瘟蛋白工程疫苗2ml/頭，空白對(duì)照組耳后肌肉注射生理鹽水50V2乳劑2ml/頭。連續(xù)觀察10天，觀測(cè)仔豬的健康狀況。結(jié)果
疫苗對(duì)小白鼠的安全性試驗(yàn) 結(jié)果見表1，免疫組與對(duì)照組一致，無死亡發(fā)生，無任何臨床不良癥狀出現(xiàn)，可見重組非洲豬瘟蛋白工程疫苗對(duì)小白鼠是安全的。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防非洲豬瘟的蛋白工程疫苗蛋白。
2.—種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述蛋白工程疫苗蛋白氨基酸序列。
3.—種載體,其含有權(quán)利要求2所述的核酸分子。
4.一種宿主細(xì)胞,其含有權(quán)利要求3所述的載體。
5.權(quán)利要求1所述的非洲豬瘟蛋白工程疫苗蛋白，其最優(yōu)組合具體核酸序列組合為:SEQ ID N0.3-SEQ ID N0.5-SEQ ID N0.10
6.權(quán)利要求1所述的非洲豬瘟蛋白工程疫苗蛋白，其最優(yōu)組合具體氨基酸序列組合為:SEQ ID N0.4 -SEQ ID N0.6-SEQ ID N0.8。
7.權(quán)利要求5 所述的核酸序列為SEQID N0.1具體如下:
8.權(quán)利要求6所述的氨基酸序列為SEQID N0.2具體如下:YPRHYGECSSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEVTPQPGTSKPAGATTASAGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDAPAHPTEPYIENLRQRNTYTHKDLEGGPRVDCRCGDKFPSKFCYGGNAIKTPDDPGALKPREEYQPSGHINVSRAREWDTDYGSGYYDNNRSNKNNNGTNVNDTNGDINDTNGDIIRRKRKKHVEEIESPPPSESNEEDISHDDTTSIHEPSPREPLLPKPYSRYQYNTPIYYMRPSTQPLNPFPLPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCSPPKPCRPPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPPSKPCPSPQSYSPPKPLP。
9.一種用于預(yù)防非洲豬瘟的疫苗，其包括權(quán)利要求8所述的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種非洲豬瘟蛋白工程疫苗的制備。所述疫苗含有非洲豬瘟病毒ASFV主要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)蛋白P72，膜結(jié)構(gòu)蛋白P54，以及紅細(xì)胞凝集素的T細(xì)胞表位多肽以及純化標(biāo)簽。本疫苗生產(chǎn)制備工藝穩(wěn)定，適合大規(guī)模生產(chǎn)。經(jīng)過靶動(dòng)物仔豬和小白鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的非洲豬瘟蛋白工程疫苗具有使用的安全性，且疫苗能夠誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞免疫反應(yīng)及體液免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K39/12GK103172749SQ20131003876
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者李殿明, 蒲勤, 齊春梅, 李毅, 田春輝, 劉甜甜, 任百亮, 張導(dǎo)春 申請(qǐng)人:青島紅橋明勤生物科技有限公司