專利名稱：一種生物堿及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物堿及制備和應(yīng)用，具體涉及一種從藥用植物黃花蒿(Artemisia annuaLinn.)莖部提取的內(nèi)生真菌煙曲霉 SPS-02 (Aspergillus fumigatus)液體發(fā)酵物中分離的一種新生物堿及其制備方法與逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的應(yīng)用，該化合物可以與抗腫瘤藥物作用提高逆轉(zhuǎn)效果，從而為臨床上治療多藥耐藥性腫瘤提供新的方法和手段。背景技術(shù)：
微生物與人類息息相關(guān)，其活性次生代謝產(chǎn)物如抗生素已被廣泛研究和應(yīng)用。植物內(nèi)生菌是一種分布廣、種類多、具有重要生理和生態(tài)作用的特境微生物，其活性次生代謝產(chǎn)物已成為天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域和應(yīng)用微生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。惡性腫瘤是威脅人類健康、導(dǎo)致死亡的重要原因之一，化學(xué)治療是其治療的主要手段，然而腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)是影響化療效果的重要原因之一。MDR是指腫瘤細(xì)胞接觸一種抗腫瘤藥物后產(chǎn)生耐藥性，同時對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理不同的多種抗腫瘤藥物表現(xiàn)出交叉抵抗現(xiàn)象。MDR是腫瘤細(xì)胞耐藥的常見方式，也是腫瘤難治療、易復(fù)發(fā)的主要原因。理想的MDR逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)具有一定的抗腫瘤活性，且對正常組織細(xì)胞毒性小，在體內(nèi)及腫瘤細(xì)胞內(nèi)能達(dá)到有效濃度。然而，一些經(jīng)典的MDR逆轉(zhuǎn)劑具有嚴(yán)重的毒副作用，如維拉帕米產(chǎn)生心血管疾病、valsodar與細(xì)胞色素P45tl同工酶3A4產(chǎn)生競爭性抑制等，所以這些藥物無法應(yīng)用于臨床。因此，尋找安全、高效、低毒的腫瘤細(xì)胞MDR逆轉(zhuǎn)劑成為當(dāng)今藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。植物內(nèi)生菌具有豐富的生物多樣性和化學(xué)多樣性，能夠產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、活性顯著的物質(zhì)。到目前為止，尚未見從黃花蒿內(nèi)生菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)分離到新逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性生物堿的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的新生物堿，以及該生物堿的提取分離方法，在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:本發(fā)明涉及一種式(I )所示生物堿，命名為16-β-hydroxy-5-N-acetylardeemin(16- β -羥基-5-Ν-乙?；?阿迪米):
權(quán)利要求
1.一種式(I)所示生物堿，
2.一種用于權(quán)利要求1所述生物堿提取的煙曲霉SPS-02，其特征在于所述煙曲霉(Aspergillusfumigatus)SPS-02保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2013年I月13日，保藏編號為CCTCCN0:M2013014。
3.—種如權(quán)利要求1所述生物堿的制備方法，其特征在于所述方法為:將保藏編號為CCTCC N0:M2013014即煙曲霉SPS-02發(fā)酵培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液過濾或離心，取濾液或上清液用乙酸乙酯在室溫下進(jìn)行萃取，取有機(jī)層低溫真空濃縮，獲得浸膏F，將浸膏F進(jìn)行分離純化，獲得所述生物堿；所述浸膏F分離純化方法為:(I)將浸膏F進(jìn)行硅膠柱層析，用1(Γ15倍柱體積的氯仿進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，低溫真空濃縮，獲得浸膏Fl ;(2)將浸膏Fl進(jìn)行硅膠柱層析，用3飛倍柱體積的氯仿進(jìn)行洗脫，合并所有洗脫液，低溫真空濃縮，獲得浸膏F2 ；(3)利用葡聚糖凝膠S印hadex LH-20對浸膏F2進(jìn)行柱層析，洗脫劑為體積比1:1的氯仿和甲醇混合液，TLC跟蹤檢測含有藍(lán)色熒光點(diǎn)的部分，收集該部分洗脫液，合并洗脫液后低溫真空除去洗脫劑，得到浸膏F3 ； (4)浸膏F3采用反相高效液相色譜分離，流動相為體積比1:1.5的雙蒸水和甲醇混合液，收集保留時間Ilmin時的洗脫液，低溫真空除去流動相得到式(I)所示的生物堿。
4.如權(quán)利要求3所述生物堿的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)液的制備方法為:(I)斜面培養(yǎng):將煙曲霉SPS-02接種至斜面培養(yǎng)基，28 30°C培養(yǎng)7 10天，獲得菌體斜面；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:馬鈴薯20g/L、瓊脂20g/L，溶劑為水，自然pH值；(2)種子培養(yǎng):從菌體斜面挑取一接種環(huán)菌體接種至H)培養(yǎng)基，在10(Tl50rpm、28 30°C條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，獲得種子液；所述H)培養(yǎng)基終濃度組成為:土豆200g/L、葡萄糖20g/L，溶劑為水，自然PH值；(3)發(fā)酵培養(yǎng) :將步驟(2)獲得的種子液以體積比1:10的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在140rpm、28°C條件下?lián)u床培養(yǎng)15天，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:蔗糖 30g/L, NaN033g/L，K2HP04lg/L，酵母膏 lg/L，KC10.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g/L，溶劑為水，自然 pH 值。
5.一種權(quán)利要求1所述生物堿在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:所述生物堿在制備白血病阿霉素耐藥細(xì)胞、人肺腺癌順鉬耐藥細(xì)胞或人卵巢癌順鉬耐藥細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物堿在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑中的濃度為5 10 μ Mo
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物堿在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑中的濃度為5 μ Μ。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種式(Ⅰ)所示生物堿及制備方法和在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，本發(fā)明提供一種生物堿，可作為具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的新藥物或先導(dǎo)化合物，對白血病阿霉素耐藥細(xì)胞(K562/ADR)、人肺腺癌/順鉑耐藥細(xì)胞(A549/DDP)和人卵巢癌/順鉑耐藥細(xì)胞(SK-OV-S/DDP)有很強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用；本發(fā)明的生物堿可以利用微生物進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，操作工藝簡便，周期短，成本低，來源有保證；本發(fā)明利用生物法合成，對環(huán)境無污染；
文檔編號A61P35/00GK103113376SQ20131004453
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者章華偉, 應(yīng)晨, 湯逸飛 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)