針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)及相應(yīng)Fab和全長抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)及相應(yīng)的Fab和全長抗體。更具體而言，本發(fā)明利用人源單克隆抗體噬菌體展示文庫篩選到針對人VEGFR2的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)并利用所述可變區(qū)制備出了相應(yīng)的Fab片段和全長抗體。本發(fā)明的抗體可以有效影響VEGF/VEGFR2的相互作用。
【專利說明】針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)及相應(yīng)Fab和全長抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)及相應(yīng)的Fab和全長抗體。更具體而言，本發(fā)明涉及用噬菌體展示技術(shù)篩選出的針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)以及含有所述可變區(qū)的抗體Fab片段和全長抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]血管新生不僅在正常發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，而且還在一些疾病發(fā)生過程中起著重要的作用，比如腫瘤。腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤體積變大必須伴隨著血管新生為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，同時(shí)排除代謝廢物。
[0003]血管增生是一個復(fù)雜的生理過程，現(xiàn)有的證據(jù)表明失控的血管新生是腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的主要原因。血管增生也和其他疾病密切相關(guān)，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及銀屑病等疾病。所以抑制血管新生成為治療這些疾病的可行方法。
[0004]在血管新生過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF(vascular endothelial growthfactor)起著及其重要的作用，VEGF能強(qiáng)烈地刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。VEGF也被稱作VEGF-A, VEGF家族還包括PIGF、VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D等成員。VEGF調(diào)控正常及病理血管的生長，而VEGF -C和VEGF-D主要調(diào)控淋巴血管新生。其中VEGF基因表達(dá)通過選擇性拼接其外顯子產(chǎn)生4個異構(gòu)體，分別是VEGF121 (含有121個氨基酸)、VEGF165 (含有165個氨基酸)、VEGF189 (含有189個氨基酸)和VEGF2tl6(含有206個氨基酸)。其中VEGF165是主要的VEGF表達(dá)異構(gòu)體，和各種生理及病理密切相關(guān)，它是一種分泌性蛋白質(zhì)，但同時(shí)也能通過肝素結(jié)合到細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)。分泌的VEGF以二聚體的形式存在，其中兩個單體之間被兩個二硫鍵連接在一起。VEGF是一種多功能的細(xì)胞激素，在低氧及致癌突變過程中能被誘導(dǎo)表達(dá)。VEGF是很強(qiáng)的血管滲透誘導(dǎo)劑、內(nèi)皮細(xì)胞趨化劑、內(nèi)皮細(xì)胞生存及增殖生長因子。
[0005]VEGF結(jié)合的受體包括VEGFRl(也被稱作Flt-1)及VEGFR2 (也被稱作Flk-1)?，F(xiàn)有的證據(jù)表明VEGFR2介導(dǎo)VEGF的多種效應(yīng)，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管增生及滲透，盡管VEGF結(jié)合到VEGFRl的親和力更高。而VEGFRl似乎并沒有直接參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管增生，但是VEGFRl參與了 VEGF誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移。
[0006]VEGFRl和VEGFR2屬于III型受體酪氨酸激酶家族，其特征是胞外區(qū)由7個IgG樣的結(jié)構(gòu)域組成，中間含有一個細(xì)胞跨膜區(qū)，胞內(nèi)含有一個酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。VEGFR3結(jié)合VEGF 一 C和VEGF — D，在淋巴管的發(fā)育過程中起作用。VEGF 二聚體結(jié)合到VEGFR2以后誘發(fā)受體二聚體化，胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸化，從而激活下游信號通路，包括激活磷脂酶C，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等。
[0007]所以VEGF及VEGFR2是很好的治療靶點(diǎn)，抑制該信號通路理論上能夠抑制血管新生，從而達(dá)到治療血管新生相關(guān)的疾病。目前已有多個抑制VEGF信號通路的方法，包括VEGF人源化單克隆抗體、VEGFR小分子抑制劑等。鑒于VEGFR2在VEGF信號通路中的重要作用，抑制VEGFR2應(yīng)該是一種抑制血管新生的策略。[0008]針對VEGFR2的抑制性抗體可以用于治療血管新生相關(guān)疾病，包括腫瘤如固體瘤和非固體瘤、新生血管性青光眼、冠狀動脈疾病、炎癥性疾病比如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、眼科疾病比如糖尿病視網(wǎng)膜疾病和老年性視網(wǎng)膜黃斑退化等疾病。
[0009]抗體是一類重要的蛋白質(zhì)分子用于治療人類疾病。單克隆抗體由于其針對靶點(diǎn)的高度特異性已在臨床上被廣泛作為藥物使用?？贵w是一類糖蛋白，它們具有相同的結(jié)構(gòu)特征。天然抗體通常是一類分子量為150kD的四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成。其中每一條輕鏈通過二硫鍵和重鏈相連，兩條重鏈之間也通過二硫鍵相連。每一條重鏈和輕鏈分別由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)分為α、δ、ε、Y和μ，輕鏈恒定區(qū)分為kappa(K)和IambdaO )?？勺儏^(qū)決定了抗體的特異性及其和抗原的親和力。可變區(qū)包括3個高變區(qū)(⑶R區(qū))和4個框架區(qū)(FR區(qū))，兩個框架區(qū)之間由一個高變區(qū)連接。重鏈的恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3)，輕鏈的恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域CL。
[0010]由于動物來源的抗體用于人體會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所以必須對動物來源的抗體進(jìn)行人源化。另外，隨著技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)可以通過噬菌體展示技術(shù)及其他技術(shù)，如核糖體展示技術(shù)，抗體人源化小鼠技術(shù)等方法，得到全人源的單克隆抗體。目前臨床上使用的治療性單克隆抗體包括嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體及全人源單克隆抗體。其中全人源單克隆抗體由于其高度的親和力及低度的致人體免疫性等特征最受青睞。
[0011]抗體的噬菌體展示技術(shù)就是將抗體V區(qū)片段融合噬菌體表面蛋白(g3)后展示到噬菌體表面，然后針對不同抗原對噬菌體庫進(jìn)行篩選，最終得到特異的抗體。噬菌體表面的抗體片段的展示和篩選實(shí)際上是模擬機(jī)體免疫篩選，抗體能夠從人工建立的噬菌體文庫中篩選得到。同一個文庫可以針對不同的抗原篩選到多個不同的單克隆抗體。噬菌體抗體文庫所包括的抗體分子的多樣性及該文庫的庫容量的大小決定篩選的抗體的親和力。目前有多種方法構(gòu)建得到抗體文庫，包括從B細(xì)胞cDNA通過PCR直接擴(kuò)增重鏈和輕鏈的V區(qū)片段，在體外隨機(jī)組合后 克隆到不同載體上得到scFv或者Fab文庫。這些B細(xì)胞既可以來源于抗原免疫后的個體，也可以來源于非免疫的個體。這種直接來源于個體的抗體文庫可以針對不同的抗原篩選到高親和力的抗體，包括自身的抗原及毒性抗原。同時(shí)，還可以將抗體V區(qū)片段中不同的區(qū)域分別擴(kuò)增或人工合成的片段在體外進(jìn)行重組得到抗體scFv或者Fab文庫。
[0012]抗體噬菌體展示的功能除了能篩選針對不同的抗原得到特異的抗體外，還能對得到的抗體進(jìn)一步突變其高變區(qū)以提高其親和力、增強(qiáng)其治療效力。
[0013]因此，本發(fā)明試圖利用噬菌體展示技術(shù)來篩選針對VEGFR2的全人源單克隆抗體的重鏈和輕鏈序列，并繼而利用基因工程的方法得到完整的抗體，從而為針對血管新生的疾病治療提供相應(yīng)的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于利用噬菌體展示技術(shù)獲得針對VEGFR2的全人源單克隆抗體的重鏈和輕鏈序列，并繼而利用基因工程的方法得到完整的抗體或其功能片段。
[0015]因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列分別與SEQID N0.19,SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.21所示的序列具有至少80%的同一性，其輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列分別與選自下述組的序列具有至少80%的同一性:
[0016]組I:SEQ ID N0.22，SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24 ；
[0017]組2:SEQ ID N0.25，SEQ ID N0.26 和 SEQ ID N0.27 ；
[0018]組3:SEQ ID N0.28，SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.30 ；
[0019]組4:SEQ ID N0.31，SEQ ID N0.32 和 SEQ ID N0.33 ；
[0020]組5:SEQ ID N0.34，SEQ ID N0.35 和 SEQ ID N0.36 ；
[0021]組6:SEQ ID N0.37，SEQ ID N0.38 和 SEQ ID N0.39 ；
[0022]組7:SEQ ID N0.40，SEQ ID N0.41 和 SEQ ID N0.42 ;或
[0023]組8:SEQ ID N0.43，SEQ ID N0.44 和 SEQ ID N0.45。
[0024]優(yōu)選地，所述同一性為至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
[0025]優(yōu)選地，所述全人源單克隆抗體的重鏈恒定區(qū)選自α、δ、ε、Y或μ或與α、δ、ε、Y或μ具有至少80%同一1丨生的序列,輕鏈恒定區(qū)選自K或λ或與K或λ具有至少80%同一性的序列，優(yōu)選地，所述同一性為至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
[0026]優(yōu)選地，其重鏈序列與如SEQ ID N0.2所示的序列的同一性為至少80%，優(yōu)選地，至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，最優(yōu)選地，100%ο
[0027]優(yōu)選地，其輕鏈序列與如選自下述序列之一的序列的同一性為至少80% =SEQIDN0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12、SEQ IDN0.14、SEQ IDN0.16或SEQ ID N0.18，優(yōu)選地，至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
[0028]優(yōu)選地,所述抗體的類型為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。
[0029]優(yōu)選地，所述抗體的類型為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2。
[0030]優(yōu)選地,所述功能片 段或衍生物為(Fab’)2、Fab、單鏈抗體、單鏈sv、多價(jià)單鏈抗體、雙特異性抗體或三特異性抗體。
[0031]本發(fā)明的第二方面涉及一種編碼根據(jù)如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物的核苷酸序列。
[0032]優(yōu)選地，其重鏈的編碼序列與如SEQ ID N0.1所示的序列的同一性為至少80%，優(yōu)選地，至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，最優(yōu)選地，100% ;輕鏈的序列與選自下述序列的序列的同一性為至少80%:SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.13、SEQ IDN0.15或SEQ ID N0.17，優(yōu)選地，至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
[0033]本發(fā)明的第三方面涉及根據(jù)如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據(jù)如上第二方面所述的核苷酸序列在制備阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的藥物中的用途。
[0034]本發(fā)明的第四方面涉及根據(jù)如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據(jù)如上第二方面所述的核苷酸序列在制備治療腫瘤和非腫瘤疾病的藥物中的用途。
[0035]優(yōu)選地，所述腫瘤為原發(fā)性的、轉(zhuǎn)移性的以及難治愈性的各種固體腫瘤和非固體腫瘤，優(yōu)選地，固體腫瘤選自乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、頭頸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、胃癌、腎癌或皮膚癌，非固體瘤選自各種白血病、淋巴瘤或骨髓瘤；優(yōu)選地，所述非腫瘤疾病選自新生血管性青光眼、冠狀動脈疾病、炎癥性疾病優(yōu)選風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、眼科疾病優(yōu)選糖尿病視網(wǎng)膜疾病或老年性視網(wǎng)膜黃斑退化。
[0036]本發(fā)明的第五方面涉及一種主要活性成分為根據(jù)如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據(jù)如上第二方面所述的核苷酸序列的組合物。
[0037]優(yōu)選地，所述組合物還含有化療藥物、腫瘤抑制劑優(yōu)選小分子化合物抑制劑或單克隆抗體，優(yōu)選抗EGFR、IGFlR或TOGFR的單克隆抗體。
[0038]優(yōu)選地，根據(jù)如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物偶聯(lián)有細(xì)胞毒素。
[0039]換言之，本發(fā)明的VEGFR2單克隆抗體的重鏈及輕鏈(包括框架區(qū)及⑶R區(qū))均是通過噬菌體展示技術(shù)得到的全人源序列(通過篩選含有全人源序列的噬菌體文庫)。該抗體能結(jié)合到VEGFR2的胞外區(qū)，阻斷VEGF結(jié)合到VEGFR2，抑制VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性，從而抑制腫瘤的生長。
[0040]本發(fā)明篩選鑒定的重鏈及輕鏈序列可以利用基因工程的方法得到完整的抗體IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。這些抗體的重鏈恒定區(qū)分別對應(yīng)α、δ、ε、Y和μ，這些抗體的輕鏈恒定區(qū)可以是kapp a( κ )和lambda(A)。這些抗體可以包括其各亞型，比如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2等等。還可以通過基因工程的方法得到其他形式的單克隆抗體，包括(Fab’)2、Fab、單鏈抗體、單鏈sv(SCFV)、多價(jià)單鏈抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體等其他任何形式的抗體。
[0041]本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，決定抗體特異性等性質(zhì)的關(guān)鍵因素在于其重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列(尤其是重鏈和輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的序列)，恒定區(qū)以及互補(bǔ)決定區(qū)間的框架區(qū)序列可以做適當(dāng)?shù)母淖兌恢劣趯?shí)質(zhì)性影響抗體的特異性等性質(zhì)。所述適當(dāng)?shù)母淖內(nèi)绫Ｊ匕被岬奶鎿Q等。
[0042]該發(fā)明的抗體可以治療以下腫瘤，包括但不限于以下腫瘤，包括原發(fā)性的、轉(zhuǎn)移性的以及難治愈性的各種固體腫瘤和非固體腫瘤。固體腫瘤包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、頭頸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、胃癌、腎癌、皮膚癌。非固體瘤包括各種白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等疾病。
[0043]該發(fā)明的抗體還可以治療以下非腫瘤疾病，包括但不限于以下非腫瘤疾病，包括新生血管性青光眼、冠狀動脈疾病、炎癥性疾病比如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、眼科疾病比如糖尿病視網(wǎng)膜疾病和老年性視網(wǎng)膜黃斑退化等疾病。
[0044]該發(fā)明的抗體可以單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合其他藥物一起使用，包括各種化療藥物、腫瘤抑制劑比如小分子化合物抑制劑和單克隆抗體(如針對EGFR、IGF1R、PDGFR的單抗)。
[0045]該發(fā)明的抗體還可以偶聯(lián)其他化合物，比如細(xì)胞毒素，以用于治療腫瘤。
[0046]本發(fā)明的抗體為針對血管新生的疾病治療提供了新的藥物?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0047]圖1:噬菌體Elisa值。
[0048]圖2:鑒定具有阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的陽性克隆。
[0049]圖3:陽性克隆Fab蛋白質(zhì)阻斷VEGF/VEGFR2相互作用。
[0050]圖4:陽性克隆Fab蛋白質(zhì)阻斷VEGF刺激人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
[0051]圖5:陽性克隆IgGl全長抗體阻斷VEGF/VEGFR2相互作用。
[0052]圖6:陽性克隆IgGl全長抗體阻斷VEGF刺激人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面將通過下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0054]下述實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司 獲取。
[0055]實(shí)施例
[0056]實(shí)施例1、人源單克隆抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建
[0057]本發(fā)明首先根據(jù)Marks J等人的文獻(xiàn)報(bào)道(J Mol Biol, 1991，222，p581_597)構(gòu)建了一個scFv噬菌體展示文庫，該庫容量很大，共有超過1.0X 101°獨(dú)立克隆數(shù)，宿主為XLl-Blue 細(xì)菌。
[0058]實(shí)施例2、篩選scFv噬菌體文庫得到抗人VEGFR2的陽性單克隆
[0059]篩選步驟如下:
[0060]1、從scFv文庫中取10毫升XLl-Blue細(xì)菌，接種到IL的2YTAG培養(yǎng)基中，30°C常規(guī)培養(yǎng)到對數(shù)生長期，加M13-K07輔助性噬菌體，擴(kuò)增過夜(30°C，2YTAK培養(yǎng)基)。擴(kuò)增的噬菌體用20%的PEG8000沉淀，然后重懸在100ml PBS (20mM磷酸鹽pH7.4)中并對噬菌體
滴度定量。
[0061]2、將抗原VEGFR2 — Fe采用常規(guī)技術(shù)手段固定到Maxisorp Star管，加牛奶封閉I小時(shí)(37°C)，然后加入噬菌體，用PBST (20mM磷酸鹽0.05%Tween-20pH7.4)洗15次，用PBS洗15次。結(jié)合的噬菌體用0.1M、pH2.2的HCL洗脫下來。
[0062]3、將洗脫下來的噬菌體感染XLl-Blue細(xì)菌，然后感染的細(xì)菌涂布在幾個2YTAG平板上，37 °C溫育過夜。
[0063]4、隨機(jī)挑選200個克隆用于曬菌體Elisa。
[0064]5、單個XLl-Blue克隆接種到96孔平板，加入M13K07輔助性噬菌體，過夜。擴(kuò)增的噬菌體用牛奶阻斷，加入到已包被人VEGFR2 - Fe的96孔平板，溫育I小時(shí)后，平板用PBST (同上)洗4次，再加入兔抗M13噬菌體一 HRP偶聯(lián)物。平板用PBST (同上)洗4次，加入TMB過氧底物，于450nm讀數(shù)，結(jié)果見圖1。噬菌體Elisa結(jié)果顯示:噬菌體上清液在1:50稀釋后單克隆2G1C12、4C5F8、4G11H4的Elisa讀數(shù)大于2.0，表明這些克隆對VEGFR2蛋白質(zhì)具有很高的親和力。利用相似的方法，本發(fā)明獲得的單克隆D10B3、2E1B11、2G4D1、2H8D9和4G3H9對VEGFR2蛋白質(zhì)也具有很高的親和力。上述獲得的八株抗體的共同特征是它們的重鏈序列相同，區(qū)別僅在于輕鏈序列不同，但都具有很高的針對VEGFR2蛋白質(zhì)的親和力。[0065]實(shí)施例3、篩選具有阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的陽性單克隆抗體
[0066]隨機(jī)挑選單克隆2G1C12、4C5F8、4G11H4進(jìn)行VEGF/VEGFR2相互作用的阻斷篩選試驗(yàn)，篩選步驟簡述如下:
[0067]1、將能結(jié)合到VEGFR2的陽性克隆XLl-Blue細(xì)菌接種到2YTAG培養(yǎng)基，加M13-K07輔助性噬菌體，擴(kuò)增過夜(30°C，2YTAK培養(yǎng)基)。將得到的噬菌體同VEGFR2混合溫育I小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到包被VEGF的96孔平板。溫育I小時(shí)后，平板用PBST (同上)洗4次，再加入山羊抗人IgG-Fc - HRP偶聯(lián)物。平板PBST (同上)洗4次，加入TMB過氧底物，于450nm讀數(shù)。
[0068]2、鑒定具有阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的陽性克隆，噬菌體Elisa結(jié)果顯示:單克隆2G1C12、4C5F8、4G11H4均具有阻斷效果，結(jié)果見圖2。同樣地，噬菌體Elisa結(jié)果顯示單克隆D10B3、2E1B11、2G4D1、2H8D9和4G3H9也都有阻斷效果。
[0069]3、將具有阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的陽性克隆進(jìn)行DNA測序，得到陽性克隆重鏈及輕鏈可變區(qū)序列，其中所述抗體的重鏈序列均如SEQ ID N0.2所示，其核苷酸編碼序列如SEQ ID N0.1所示，其CDR1、CDR2和CDR3的序列分別如SEQID N0.19-21所示。上述八株抗體的輕鏈序列及其互補(bǔ)決定區(qū)的序列如表1所示。
[0070]表1
[0071]
【權(quán)利要求】
1.一種針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDRU CDR2和CDR3的序列分別與SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20和SEQID N0.21所示的序列具有至少80%的同一性，其輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列分別與選自下述組的序列具有至少80%的同一性:
組 1:SEQ ID N0.22，SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24 ；
組 2:SEQ ID N0.25，SEQ ID N0.26 和 SEQ ID N0.27 ；
組 3:SEQ ID N0.28，SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.30 ；
組 4:SEQ ID N0.31，SEQ ID N0.32 和 SEQ ID N0.33 ；
組 5:SEQ ID N0.34，SEQ ID N0.35 和 SEQ ID N0.36 ；
組 6:SEQ ID N0.37，SEQ ID N0.38 和 SEQ ID N0.39 ；
組 7:SEQ ID N0.40，SEQ ID N0.41 和 SEQ ID N0.42 ;或
組 8:SEQ ID N0.43，SEQ ID N0.44 和 SEQ ID N0.45。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述同一性為至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述全人源單克隆抗體的重鏈恒定區(qū)選自α、δ、ε、Y或μ或與α、δ、ε、Y或μ具有至少80%同一'I"生的序列,輕鏈恒定區(qū)選自K或λ或與K或λ具有至少80%同一性的序列，優(yōu)選地，所述同一性為至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于其重鏈序列與如SEQ ID N0.2所示的序列的同一性為至少80%，優(yōu)選地，至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%,98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于其輕鏈序列與如選自下述序列之一的序列的同一性為至少 80%:SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.12,SEQID N0.14,SEQ ID N0.16或SEQ ID N0.18，優(yōu)選地，至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述抗體的類型為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述抗體的類型為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述功能片段或衍生物為(Fab’)2、Fab、單鏈抗體、單鏈sv、多價(jià)單鏈抗體、雙特異性抗體或三特異性抗體。
9.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核苷酸序列，其特征在于重鏈的編碼序列與如SEQIDN0.1所示的序列的同一性為至少80%，優(yōu)選地，至少85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，最優(yōu)選地，100% ;輕鏈的序列與選自下述序列的序列的同一性為至少 80%:SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.9, SEQ IDN0.11、SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.15 或 SEQ ID N0.17，優(yōu)選地，至少 85%，優(yōu)選地至少 90%，更優(yōu)選地，至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優(yōu)選地，100%。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的核苷酸序列在制備阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的藥物中的用途。
12.—種根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的核苷酸序列在制備治療腫瘤和非腫瘤疾病的藥物中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于所述腫瘤為原發(fā)性的、轉(zhuǎn)移性的以及難治愈性的各種固體腫瘤和非固體腫瘤，優(yōu)選地，固體腫瘤選自乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、頭頸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、胃癌、腎癌或皮膚癌，非固體瘤選自各種白血病、淋巴瘤或骨髓瘤；優(yōu)選地，所述非腫瘤疾病選自新生血管性青光眼、冠狀動脈疾病、炎癥性疾病優(yōu)選風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、眼科疾病優(yōu)選糖尿病視網(wǎng)膜疾病或老年性視網(wǎng)膜黃斑退化。
14.一種主要活性成分為根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的核苷酸序列的組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于其還含有化療藥物、腫瘤抑制劑優(yōu)選小分子化合物抑制劑或單克隆抗體，優(yōu)選抗EGFR、IGFlR或TOGFR的單克隆抗體。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其偶聯(lián)有細(xì)胞毒素。
【文檔編號】A61P9/00GK103965356SQ201310047377
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月6日
【發(fā)明者】常永生, 方福德, 董學(xué)雨, 左瑾 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所