登革病毒特異性hla-a*2402限制性表位肽及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明首次揭示一組具有較高免疫原性的登革病毒特異性HLA-A*2402限制性表位肽。所述表位肽是登革病毒來(lái)源的，可誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】登革病毒特異性HLA-A*2402限制性表位肽及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及登革病毒特異性HLA-A*2402限制性表位肽及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]登革病毒(Dengue Virus, DV)為黃病毒屬單股正鏈RNA病毒，包括四種血清型(D1V、D2V、D3V和D4V)，基因組編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C，PrM/M和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5KDV可通過(guò)蚊蟲(chóng)(埃及伊蚊和白紋伊蚊等)叮咬傳播，弓丨起輕度登革熱(Dengue fever,DF)或重度登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)/登革休克綜合癥(Dengue shock syndrome, DSS),而DHF/DSS患者死亡率高達(dá)0.5-3.5%。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì):全球每年約有5000萬(wàn)-1億DF患者(包括約25萬(wàn)-50萬(wàn)的DHF/DSS病例)。
[0003]大量研究表明:DV特異性抗體可通過(guò)ADE (抗體依賴(lài)的增強(qiáng)效應(yīng))作用增進(jìn)DV的感染，因而不具有免疫保護(hù)效應(yīng)。早期研究提示IFN-Y在控制DV感染中發(fā)揮作用。隨后的研究表明:DV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL，即活化的⑶8+T細(xì)胞)可通過(guò)分泌細(xì)胞因子(IFN-Y等)或直接殺傷病毒感染的靶細(xì)胞而限制DV感染，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。近期的大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí):DV特異性CTL(尤其是能分泌IFN- Y的CD8+T細(xì)胞)可以清除DV、降低DV滴度，其在 宿主抗DV感染免疫過(guò)程中是必不可少的。由于DV特異性CTL在控制DV復(fù)制和感染中發(fā)揮重要作用，為了避免ADE效應(yīng)，基于CTL表位的疫苗是一種很有希望的新型疫苗。
[0004]由于目前登革病毒嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，因此迫切需要開(kāi)發(fā)出可用于預(yù)防或治療登革病毒感染性疾病的疫苗，尤其是安全性和特異性高的CTL表位肽疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供登革病毒特異性HLA_A*2402限制性表位肽及應(yīng)用。
[0006]在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，所述的多肽是選自如SEQ ID N0:USEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽。
[0007]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多肽來(lái)源于登革病毒。
[0008]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制備誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的藥物組合物。
[0009]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌IFN- Y的細(xì)胞。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是HLA_A*2402限制性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
[0011]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制備預(yù)防或治療登革病毒感染性疾病的藥物組合物。
[0012]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的登革病毒感染性疾病包括(但不限于):登革熱、登革出血熱和登革休克綜合癥。[0013]在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有:
[0014]有效量 的所述的一種或多種多肽；和
[0015]藥學(xué)上可接受的載體。
[0016]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是疫苗。
[0017]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的藥物組合物的用途，用于制備誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的藥盒。
[0018]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的藥物組合物的用途，用于制備預(yù)防或治療登革病毒感染性疾病的藥盒。
[0019]在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥盒，所述的藥盒中含有:一種或多種所述的多肽；或所述的藥物組合物。
[0020]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021 ] 圖1、多肽NS3548_556的質(zhì)譜圖。
[0022]圖2、多肽NS322_3Q的質(zhì)譜圖。
[0023]圖3、多肽C49_57的質(zhì)譜圖。
[0024]圖4、NS3548_556與HLA_A*2402分子的結(jié)合力。不同濃度(紅色為I μ g/ml、綠色為10 μ g/ml、藍(lán)色為100 μ g/ml)的多肽NS3548_556和FITC標(biāo)記的陽(yáng)性表位肽與HLA_A*2402陽(yáng)性B細(xì)胞株共育。流式儀測(cè)定細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
[0025]圖5、NS322_3o與HLA_A*2402分子的結(jié)合力。不同濃度(紅色為I μ g/ml、綠色為10 μ g/ml、藍(lán)色為100 μ g/ml)的多肽NS322_3(I和FITC標(biāo)記的陽(yáng)性表位與HLA_A*2402陽(yáng)性B細(xì)胞株共育。流式儀測(cè)定細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
[0026]圖6、C49_57與HLA_A*2402分子的結(jié)合力。不同濃度(紅色為I μ g/ml、綠色為10 μ g/ml、藍(lán)色為100 μ g/ml)的多肽C49_57和FITC標(biāo)記的陽(yáng)性表位肽與HLA_A*2402陽(yáng)性B細(xì)胞株共育。流式儀測(cè)定細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
[0027]圖7、表位肽體外刺激的HLA_A*2402陽(yáng)性外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中肽特異性CTL的ELISP0T檢測(cè)。上圖為部分ELISP0T結(jié)果圖，下圖為5名HLA_A*2402陽(yáng)性健康志愿者的表位肽刺激的PBMC的ELISP0T結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖，*表示肽刺激組與無(wú)肽刺激組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0028]圖8、表位肽體外刺激的HLA_A*2402陽(yáng)性外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)。表位肽體外刺激的HLA-A*2402陽(yáng)性健康志愿者的PBMC(效應(yīng)細(xì)胞)殺傷負(fù)載相同表位肽的永生化的HLA-A*2402陽(yáng)性B細(xì)胞株的效應(yīng)(靶細(xì)胞)(每組5人)，效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞(E/T)=l 或 5。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，首次揭示一組具有較高免疫原性的登革病毒特異性HLA-A*2402限制性表位肽。所述表位肽是登革病毒來(lái)源的、HLA_A*2402限制性的CTL表位肽，可誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)反應(yīng)。[0030]本發(fā)明公開(kāi)了三條登革病毒特異性HLA-A*2402限制性表位肽(NS3548_556，NS322_30和C49_57)。表位肽均由9個(gè)天然氨基酸殘基組成，其序列分別為:SYKVASEGF，IYRILQRGL和AFMAFLRFL。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明表位肽是登革病毒來(lái)源的、HLA_A*2402限制性的⑶8+T細(xì)胞(CTL)表位，可誘導(dǎo)高水平的⑶8+T細(xì)胞。
[0031]CTL亦叫TC細(xì)胞(cytotoxic T cell)，是白細(xì)胞的亞部，為一種特異T細(xì)胞，專(zhuān)門(mén)分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用。本領(lǐng)域公知，CTL對(duì)病毒、腫瘤細(xì)胞等抗原物質(zhì)具有殺傷作用，可與自然殺傷細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線(xiàn)。
[0032]本發(fā)明人首先通過(guò)對(duì)登革病毒(DlV)采用T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)軟件SYFPEITHI預(yù)測(cè)，選擇合成了多條可能與HLA-A*2402分子結(jié)合并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CTL反應(yīng)的抗原肽，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)，篩選出與HLA-A*2402分子具有高結(jié)合力的表位肽NS3548_556，NS322_3(I和C49_57，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)這些肽可以在HLA-A*2402陽(yáng)性健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中誘導(dǎo)出肽特異性的HLA-A*2402限制性的CTL。
[0033]如本文所用，所述的“HLA-A*2402限制性的CTL表位肽”是指具有SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽(如表1)或其衍生肽，其是登革病毒特異性的，具有誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的功能。所述的“HLA-A*2402限制性的CTL表位肽”在文中也簡(jiǎn)稱(chēng)為“本發(fā)明的表位肽”或“所述的表位肽”。本文所述的“CTL表位肽”是指含有CTL表位的氨基酸序列的蛋白；該蛋白或含有該蛋白的組合物可引發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“多肽”、“蛋白”可互換使用。
[0034]表1
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述的多肽是選自如SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽來(lái)源于登革病毒。
3.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的藥物組合物。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌IFN-Y的細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是HLA-A*2402限制性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療登革病毒感染性疾病的藥物組合物。
7.—種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有: 有效量的權(quán)利要求1所述的一種或多種多肽；和 藥學(xué)上可接受的載體。
8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的藥盒。
9.權(quán)利要求7所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療登革病毒感染性疾病的藥盒。
10.一種藥盒，其特征在于，所述的藥盒中含有:一種或多種權(quán)利要求1所述的多肽；或權(quán)利要求7所述的藥物組合物。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103965288SQ201310047583
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月6日
【發(fā)明者】文金生, 段志良, 郭江龍, 王思娜, 李靜 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院