一種激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)的方法，包括以下步驟：1）在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因啟動子上游尋找TALE靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)特異性識別TALE靶點(diǎn)序列的靶點(diǎn)識別模塊，該靶點(diǎn)識別模塊由TAL核酸識別單元組成；2）靶點(diǎn)識別模塊編碼序列的構(gòu)建；3）通過酶切連接的方法，將步驟2）制備的所述靶點(diǎn)識別模塊編碼序列與骨架載體連接，獲得重組質(zhì)粒；4）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化目的細(xì)胞并培養(yǎng)。本發(fā)明利用TALE技術(shù)在自體干細(xì)胞中激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的表達(dá)，為缺血性疾病的基因治療提供了新的細(xì)胞來源，并能在組織工程和細(xì)胞治療中發(fā)揮重要的作用。
【專利說明】—種激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]TALE (Transcription activator-effectors)技術(shù)是一種薪新的分子生物學(xué)工具。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，來自植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)分泌的一種TALE蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有著恒定的對應(yīng)關(guān)系。利用TALE的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任何DNA序列的模塊化蛋白，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的(LiT,Huang S,Jiang W Z,et al.TAL nucleases (TALNs):hybrid proteins composed of TALeffectors and FokI DNAcleavage domain.Nucleic Acids Res.2011;39 (I):359-372.)。目前 TALE 技術(shù)主要有兩種應(yīng)用:I) TALEN (transcription activator-like (TAL)effector nucleases)的基因敲除；2) TALEA (transcription activator-like (TAL)effector activator)的轉(zhuǎn)錄激活。TALEA的轉(zhuǎn)錄激活是將識別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域VP64 (VP64Activation Domain)融合,可構(gòu)建成識別啟動子上特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活因子TALEA，將TALEA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，表達(dá)的融合蛋白結(jié)合啟動子附近的特異DNA序列，并通過VP64激活區(qū)域與PolII結(jié)合，激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高了內(nèi)源目標(biāo)基因的表達(dá)(Zhang F, Cong L, Lodato S, et al.Efficient construction ofsequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.NatBiotechnol.2011; 29 (2): 149-153.)。目前，TALEA已經(jīng)成功運(yùn)用到哺乳動物細(xì)胞中，Miller等利用人工設(shè)計(jì)的TALEA在人HEK293細(xì)胞中能夠激活內(nèi)源性NTF3基因的轉(zhuǎn)錄并使其表達(dá)水平增加了 20 倍(Miller JC, Tan S, Qiao G, et al.A TALE nuclease architecture forefficient genome editing.Nat Biotechnol.2011; 29 (2): 143-148.)。因?yàn)?TALE 技術(shù)無基因、細(xì)胞、物種限制，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，毒性低、脫靶情況少等優(yōu)點(diǎn)，TALE技術(shù)在酵母、動植物細(xì)胞的基因組定點(diǎn)修飾、遺傳疾病的基因療法及基因的功能研究等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。[0003]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是不同于造血干細(xì)胞(HSC)的另一類骨髓干細(xì)胞，具有分裂、增殖、分化形成多種間質(zhì)細(xì)胞潛能(Pittenger MF, Mackay AM, BeckSc， et al.Muhilineage potential of adult human mesenehymal stem cell.science.1999:284(1):143-146.)。在骨髓中它是造血間質(zhì)細(xì)胞的來源，通過胞體接觸和分泌多種造血因子，如IL-6，6、粒系集落剌激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)等，為HSC的分裂、增殖、分化提供適合的微環(huán)境(Koc 0N，Gerson SL, Cooper BW, et aL Rapid hematopoietic recovery after coinfuse ofautologous-b10d stem cell and culture-expanded marrow mesenehymal stem celI inadvanced breast cancer patients receiving high—dose chemotherapy.J ClinicalOncology.2000; 18 (2):307-316.)。研究表明MSC體外支持造血干細(xì)胞(HSC)擴(kuò)增，HSC聯(lián)合移植可以體內(nèi)促進(jìn)其植入并重塑造血(Sylwia B, Danuta J, Marcin M.Mesenchymalstem cells: characteristics and clinical applications.Folia Histochemica etCytobiologica.2006;4(44):215-230.)，因此具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，而表達(dá)多種造血因子是MSC支持造血的分子基礎(chǔ)。
[0004]粒細(xì)胞-巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor, GM-CSF)是一個具有多項(xiàng)潛能的造血生成因子，能夠促進(jìn)造血前體細(xì)胞的增殖、分化和成熟，對造血調(diào)控起著極其重要的作用(Parmiani G, Castelli C, Pilla L, etal.0pposite immune functions of GM-CSF administered as vaccine adjuvant incancer patients.Annals of Oncology.2007; 18:226 - 232.),因此過表達(dá) GM-CSF 基因的MSC細(xì)胞較單獨(dú)的MSC細(xì)胞可能提高造血干細(xì)胞的擴(kuò)增能力，有望用于臨床上各種缺血性疾病的治療。
[0005]本研究選擇人GM-CSF基因和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)作為靶基因和靶細(xì)胞，利用TALE技術(shù)在MSC中激活GM-CSF基因的表達(dá)，有可能為造血研究和缺血性疾病治療提供新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種利用TALE技術(shù)在人自體干細(xì)胞中激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因表達(dá)的方法。本發(fā)明選用人GM-CSF基因和人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)作為靶基因和靶細(xì)胞，利用TALE技術(shù)在MSC細(xì)胞中激活GM-CSF基因的表達(dá)，為基因治療提供新了一種新的細(xì)胞來源，并將在組織工程和細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用。
[0007]本發(fā)明首先公開了一種利用TALE技術(shù)在目的細(xì)胞中激活GM-CSF基因表達(dá)的方法，其步驟如下:
[0008]I)在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因啟動子上游尋找TALE靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)特異性識別TALE靶點(diǎn)序列的由TAL核酸識別單元組成的靶點(diǎn)識別模塊；
[0009]2)靶點(diǎn)識別模塊編碼序列的構(gòu)建:構(gòu)建編碼步驟I)所述靶點(diǎn)識別模塊的雙鏈DNA ；
[0010]3)通過酶切連接的方法，將步驟2)制備的所述靶點(diǎn)識別模塊編碼序列與含有轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64(VP64Activation Domain)編碼序列的骨架載體連接，獲得重組質(zhì)粒;
[0011]4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，及目的細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0012]較優(yōu)的，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列為GM-CSF基因啟動子上游15~20個連續(xù)的喊基。
[0013]更優(yōu)的，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列為GM-CSF基因啟動子上游16個連續(xù)的堿基。
[0014]最優(yōu)的，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]較優(yōu)的，步驟I)所述靶點(diǎn)識別模塊的TAL核酸識別單元組成為NN-NN-HD-N1-NG-HD-HD-N1-N1-HD-N1-NN-HD-HD-NN-NG。
[0016]更進(jìn)一步的，步驟I)所述靶點(diǎn)識別模塊的氨基酸組成如SEQ ID NO:19所示。
[0017]靶點(diǎn)識別模塊N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI 的氨基酸序列組成如SEQ ID NO:19所示。
[0018]本發(fā)明的靶點(diǎn)識別模塊由N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識別單元組成。所述TAL核酸識別單元為重復(fù)的34個恒定氨基酸序列，其中12、13位的雙連氨基酸與A、T、G、C四種堿基有恒定的對應(yīng)關(guān)系，即NI識別A，NG識別T，NN識別G，HD識別C。因此，本發(fā)明靶點(diǎn)識別模塊中的N1、NG、NN、HD不指代具體的雙氨基酸，而是代表特異性識別A、T、G、C四種堿基的TAL核酸識別單元；根據(jù)TALE靶點(diǎn)序列的堿基組成，獲得由對應(yīng)TAL核酸識別單元組成的靶點(diǎn)識別模塊。
[0019]通過TALE技術(shù)，能夠組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊蛋白(靶點(diǎn)識別模塊)，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的。
[0020]N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識別單元各自對應(yīng)一個能夠編碼該識別單元的單體，所述單體為雙鏈DNA。對照靶點(diǎn)識別模塊的組成，對編碼不同TAL核酸識別單元的單體進(jìn)行串聯(lián)組裝，即可獲得能夠編碼該靶點(diǎn)識別模塊的雙鏈DNA (靶點(diǎn)識別模塊編碼序列)。所述串聯(lián)組裝方式可以為在首尾相鄰的單體之間設(shè)有相同的粘性末端，具體可通過在單體序列內(nèi)TAL核酸識別單元編碼序列兩側(cè)插入對應(yīng)的酶切位點(diǎn)，通過多步酶切、連接的方法獲得，或采用同序異尾限制性內(nèi)切酶一步酶切法獲得。 [0021]較優(yōu)的，步驟2)所述靶點(diǎn)識別模塊編碼序列的構(gòu)建步驟具體如下:
[0022]A.構(gòu)建單體庫:所述單體庫包括分別針對N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識別單元的四個次庫，每一個次庫包括彼此分離設(shè)置的M個單體，并且M個單體按照第I位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫針對的TAL核酸識別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識別單元編碼序列左右兩側(cè)的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)；
[0023]B.按照所述靶點(diǎn)識別模塊的組成，由N端開始向C端方向，從前述單體庫中依次選擇對應(yīng)的單體，通過酶切、連接的方法獲得靶點(diǎn)識別模塊編碼序列。
[0024]本發(fā)明的連接末端是位于TAL核酸識別單元編碼序列左右兩側(cè)的雙鏈DNA序列，連接末端含有酶切位點(diǎn)序列(包括限制性內(nèi)切酶識別序列和/或限制性內(nèi)切酶剪切序列)，可以經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切獲得特定的粘性末端。當(dāng)某一單體下游的連接序列與另一單體的上游連接序列酶切后獲得互補(bǔ)粘性末端的時候，該兩個單體能夠連接并且連接順序是一定的，因此可以通過特定連接末端序列的設(shè)計(jì)，將多個單體按照特定順序進(jìn)行連接。
[0025]更優(yōu)的，步驟2)所述靶點(diǎn)識別模塊編碼序列的構(gòu)建步驟具體如下:
[0026]a按照所述靶點(diǎn)識別模塊的組成，將靶點(diǎn)識別模塊由N端開始向C端方向，順次按
照每η個TAL核酸識別單元一組的方式分組，構(gòu)成個次模塊；
[0027]b構(gòu)建單體庫:所述單體庫包括分別針對N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識別單元的四個次庫，每一個次庫包括彼此分離設(shè)置的M個單體，并且M個單體按照第I位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫針對的TAL核酸識別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識別單元編碼序列左右兩側(cè)的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)；每一次庫中的M個單體從排序第I的單體開始，順次以每η個單體作為一個分組，共獲得fM/?l個分組，并且同一分組內(nèi)前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)，但與該分組內(nèi)其他單體連接序列酶切后的粘性末端是非互補(bǔ)的；四個次庫之間，排次相同的編碼不同TAL核酸識別單元的四種單體，其上游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游連接序列酶切后的粘性末端也彼此相同；
[0028]c按照所述靶點(diǎn)識別模塊的組成，由N端開始向C端方向，從前述單體庫中依次選擇對應(yīng)的單體,按照每η個單體一組的方式連接,構(gòu)成IMwj個編碼對應(yīng)次模塊的η聯(lián)單體，然后再將Uftij個η聯(lián)單體連接，或者將Uftij個η聯(lián)單體與該靶點(diǎn)識別模塊組成所需要的其他單體連接，獲得靶點(diǎn)識別模塊編碼序列；其中，M為靶點(diǎn)識別模塊中TAL核酸識別單元的數(shù)目，η為整數(shù),并且η的取值范圍為2~6。
[0029]本發(fā)明中M為向上取整的符號，所述『Md為取比[Μ/η]大的最小整數(shù) U為向下取整的符號,所述IMwj為取比LM/;j小的最大整數(shù)。
[0030]本發(fā)明步驟a是指:由于靶點(diǎn)識別模塊由M個TAL核酸識別單元組成，因此從靶點(diǎn)識別模塊N端的第一個TAL核酸識別單元開始向靶點(diǎn)識別模塊的C端，按照每η個TAL核酸識別單元一組的方式，依次將靶點(diǎn)識別模塊分為『M/lll個次模塊，Π為向上取整的符號，當(dāng)Μ/η能夠整除時，所述靶點(diǎn)識別模塊分為個次模塊，并且每個次模塊內(nèi)含有η個TAL核酸識別單元；當(dāng)Μ/η不能整除時，所述靶點(diǎn)識別模塊分為個次模塊，前-1個次模塊的每個次模塊內(nèi)含有η個TAL核酸識別單元,余下的第『Mnl個次模塊內(nèi)包括
I# -11X j個TAL核酸識別單 元，并且Μ-?χ?—Ii的取值大于等于I，小于η。
[0031]步驟b中，由于每一分組內(nèi)前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)，但與該分組內(nèi)其他單體酶切后的粘性末端是非互補(bǔ)的，因此能夠?qū)⒚恳粋€分組內(nèi)的多個單體片段按照其排次順次的連接到一起。又由于每一次庫中的單體，按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)，因此屬于不同分組，但在次庫中排序相鄰的兩個單體酶切后可以通過互補(bǔ)的粘性連接，將不同分組內(nèi)的片段連接到一起。最后，由于四個次庫之間，排次相同的編碼不同TAL核酸識別單元的四種單體，其上游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游連接序列酶切后的粘性末端也彼此相同，才可以保證按照模板識別序列的組成，從不同次庫中選擇對應(yīng)TAL核酸識別單元的單體，與任意來源的前一單體連接。
[0032]步驟c為按照所述靶點(diǎn)識別模塊的組成，從前述的單體庫中選擇對應(yīng)的單體，通過酶切連接的方法獲得多個2聯(lián)單體、3聯(lián)單體、4聯(lián)單體、5聯(lián)單體或6聯(lián)單體。當(dāng)Μ/η能夠整除時，從單體庫中依次選擇對應(yīng)的單體，獲得?ΑΛ/j個編碼對應(yīng)次模塊的η聯(lián)單體，然后再將J個η聯(lián)單體連接；當(dāng)Μ/η不能整除時，先從單體庫中選出η的倍個單體，分別連接獲得lA#/?j個η聯(lián)單體后，將lM/?j個η聯(lián)單體與該靶點(diǎn)識別模塊組成所需要的其他不足η個的單體連接，或者將剩余的不足η個的單體連成寡聚單體，與其他的η聯(lián)單體連接，獲得靶點(diǎn)識別模塊編碼序列。
[0033]最優(yōu)的，每一所述分組內(nèi)η個單體順次排列，同一次庫的每一分組內(nèi)排次第2至第η-l的任一單體，與同一次庫的其他分組內(nèi)排次第2至第η-l的任一單體，排次相同的單體的序列完全相同。即每一分組含有η個單體，η個單體在分組內(nèi)順次排列，分別位于分組的第I至第η位，例如在編碼NN這一 TAL核酸識別單元的次庫中，每一個分組內(nèi)排次第2的單體，其上游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，TAL核酸識別單元編碼序列相同；同理，同一次庫不同分組間，排次第3、第4……第η-1位的單體，排次相同的單體的序列也相同。
[0034]同一次庫內(nèi)設(shè)有序列相同的單體，并將序列相同的單體放入不同分組的目的是為了減少實(shí)驗(yàn)所需要設(shè)計(jì)的粘性末端的數(shù)目，由于同一分組內(nèi)的單體先彼此連接，因此不同分組內(nèi)的單體即使能夠酶切獲得相同的粘性末端，也不會影響整個靶點(diǎn)識別模塊編碼序列的連接。
[0035]最優(yōu)的，每一所述分組內(nèi)，排次第I單體的上游連接序列的5’端外側(cè)與排次最后一位單體的下游連接序列的3’端外側(cè)還分別各設(shè)有一成環(huán)序列，同一分組內(nèi)的兩個成環(huán)序列酶切后，獲得互補(bǔ)的粘性末端。
[0036]本發(fā)明所述成環(huán)序列是位于單體上/下游連接序列外側(cè)的雙鏈DNA序列，成環(huán)序列內(nèi)含有酶切位點(diǎn)序列(包括限制性內(nèi)切酶識別序列和/或限制性內(nèi)切酶剪切序列)，可以經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切獲得互補(bǔ)的粘性末端；由于成環(huán)序列分別位于每一分組內(nèi)排次第I的單體的5’端及排次第η位單體的3’端，因此，當(dāng)該分組的η個單體連成η聯(lián)單體后，可以將該η聯(lián)單體進(jìn)行酶切，環(huán)化，獲得一個環(huán)狀雙鏈DAN。
[0037]進(jìn)一步的，所述次庫中的單體是通過PCR的方法，從含有N1、NG、NN或HD任一 TAL核酸識別單元編碼序列的質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得。
[0038]更進(jìn)一步的，所述靶點(diǎn)識別模塊的TAL核酸識別單元組成為N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI，M 為 16，η 取 4，用于從含有 N1、NG、NN 或 HD 任一TAL核酸識別單元編碼序列的質(zhì)粒中擴(kuò)增單體片段的PCR方法的引物序列為SEQ ID NO:3、
4；SEQ ID NO:5,6 ；SEQ ID NO:7、8 ;SEQ IDNO:9、10 ;SEQ ID NO:11,4 ；SEQ ID NO:9U2 ；SEQ ID NO:13,4 ；SEQ ID NO:9U4 ；SEQ ID N0:15、4;SEQ ID N0:9、16。
[0039]如下表所示，每一個次庫中M個單體按照一定的次序順次排列，因此每個單體在
所屬的次庫中都有各自的排次，如I位、2位......M位。當(dāng)n=4時，單體庫的組成如下表所
示。其中，1) 1-1-N1-2和4’ -N1-5-1 ’表示同一分組內(nèi)，排序第I的單體上游連接序列的5’端與排序第4位單體的下游連接序列的3’端還分別設(shè)有一個成環(huán)序列，同一分組內(nèi)的兩個成環(huán)序列酶切后，獲得互補(bǔ)的粘性末端，使η聯(lián)單體環(huán)化為一雙鏈環(huán)狀DAN。2)每一分組內(nèi)前一單體下游 連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)，但與該分組內(nèi)其他單體連接序列酶切后的粘性末端是非互補(bǔ)的，保證分組內(nèi)的單體按排次順次連接。3)同一次庫中，順次排列的單體之間，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)，保證不同分組內(nèi)排次相鄰的單體能夠彼此連接，獲得靶點(diǎn)識別模塊編碼序列。4)四個次庫之間，排次相同的編碼不同TAL核酸識別單元的四種單體，其上游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游連接序列酶切后的粘性末端也彼此相同，保證來源于不同次庫的單體，能夠通過互補(bǔ)的粘性末端彼此之間連接。
[0040] M 為 16，η 取 4 時
【權(quán)利要求】
1.一種激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)的方法，其特征在于，為利用TALE技術(shù)在目的細(xì)胞中激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的表達(dá)，包括以下步驟: 1)在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因啟動子上游尋找TALE靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)特異性識別該TALE靶點(diǎn)序列的由TAL核酸識別單元組成的靶點(diǎn)識別模塊； 2)靶點(diǎn)識別模塊編碼序列的構(gòu)建:構(gòu)建編碼步驟I)所述靶點(diǎn)識別模塊的雙鏈DNA； 3)通過酶切連接的方法，將步驟2)制備的所述靶點(diǎn)識別模塊編碼序列與含有轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64編碼序列的骨架載體連接，獲得重組質(zhì)粒； 4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，及目的細(xì)胞的培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列為GM-CSF基因啟動子上游15~20個連續(xù)的堿基。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列如SEQID NO:2所示。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述靶點(diǎn)識別模塊的TAL核酸識別單元組成為 NN-NN-HD-N1-NG-HD-HD-N1-N1-HD-N1-NN-HD-HD-NN-NG。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟I)所述靶點(diǎn)識別模塊的氨基酸組成如SEQID NO:19 所示。
6.如權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，步驟2)所述靶點(diǎn)識別模塊編碼序列的構(gòu)建步驟具體如下: A.構(gòu)建單體庫:所述單體庫包括分別針對N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識別單元的四個次庫，每一個次庫包括彼此分離設(shè)置的M個單體，并且M個單體按照第I位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫針對的TAL核酸識別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識別單元編碼序列左右兩側(cè)的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)； B.按照所述靶點(diǎn)識別模塊的組成，由N端開始向C端方向，從前述單體庫中依次選擇對應(yīng)的單體，通過酶切、連接的方法獲得靶點(diǎn)識別模塊編碼序列。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)所述靶點(diǎn)識別模塊編碼序列的構(gòu)建步驟具體如下: a.按照所述靶點(diǎn)識別模塊的組成，將靶點(diǎn)識別模塊由N端開始向C端方向，順次按照每η個TAL核酸識別單元一組的方式分組，構(gòu)成『朦/7〗個次模塊； b.構(gòu)建單體庫:所述單體庫包括分別針對N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識別單元的四個次庫，每一個次庫包括彼此分離設(shè)置的M個單體，并且M個單體按照第I位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫針對的TAL核酸識別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識別單元編碼序列左右兩側(cè)的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)；每一次庫中的M個單體從排序第I的單體開始，順次以每η個單體 作為一個分組，共獲得個分組，并且同一分組內(nèi)前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)，但與該分組內(nèi)其他單體連接序列酶切后的粘性末端是非互補(bǔ)的；四個次庫之間，排次相同的編碼不同TAL核酸識別單元的四種單體，其上游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游連接序列酶切后的粘性末端也彼此相同； c.按照所述靶點(diǎn)識別模塊的組成，由N端開始向C端方向，從前述單體庫中依次選擇對應(yīng)的單體，按照每η個單體一組的方式連接，構(gòu)成LJ///7j個編碼對應(yīng)次模塊的η聯(lián)單體，然后再將I朦/?j個η聯(lián)單體連接，或者將個η聯(lián)單體與該靶點(diǎn)識別模塊組成所需要的其他單體連接，獲得靶點(diǎn)識別模塊編碼序列；其中，M為靶點(diǎn)識別模塊中TAL核酸識別單元的數(shù)目，η為整數(shù),并且η的取值范圍為2~6。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分組內(nèi)η個單體順次排列，同一次庫的每一分組內(nèi)排次第2至第η-1的任一單體，與同一次庫的其他分組內(nèi)排次第2至第η-1的任一單體，排次相同的單體的序列完全相同。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分組內(nèi)，排次第I單體的上游連接序列的5’端外側(cè)與排次最后一位單體的下游連接序列的3’端外側(cè)還分別各設(shè)有一成環(huán)序列，同一分組內(nèi)的兩個成環(huán)序列酶切后，獲得互補(bǔ)的粘性末端。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述次庫中的單體是通過PCR的方法，從含有N1、NG、NN或HD任一 TAL核酸識別單元編碼序列的質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述靶點(diǎn)識別模塊的TAL核酸識別單元組成為 N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI，M 為 16，η 取 4，用于從含有N1、NG、NN或HD任一 TAL核酸識別單元編碼序列的質(zhì)粒中擴(kuò)增單體片段的PCR方法的引物序列為 SEQ ID NO:3、4 ；SEQ ID NO:5、6 ；SEQ ID NO:7、8 ；SEQ IDNO:9、10 ；SEQ ID NO:11、4 ；SEQ ID NO:9、12 ；SEQ ID NO:13、4 ；SEQ ID NO:9、14 ；SEQ ID NO:15、4 ；SEQ ID NO:9、16。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述骨架載體中含有轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64的編碼序列，所述重組質(zhì)粒表達(dá)靶點(diǎn)識別模塊-轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64融合蛋白。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述目的細(xì)胞為人自體干細(xì)胞。
14.一種高效表達(dá)促粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，為以人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為目的細(xì)胞，采用權(quán)利要求1-13任一權(quán)利要求所述方法制備獲得。
15.權(quán)利要求1-13任一權(quán)利要求所述激活粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)的方法、權(quán)利要求14所述高效表達(dá)促粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療缺血性疾病的試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K35/28GK103966247SQ201310047948
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月6日
【發(fā)明者】朱向瑩, 許可, 翁仕強(qiáng), 曹躍瓊, 金楊晟 申請人:上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司