專利名稱：口蹄疫病毒抗原多肽及疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及口蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒疫苗。本發(fā)明還涉及上述抗原多肽，融合抗原多肽和疫苗的制備及其應用。
背景技術：
口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染的動物傳染病?？谔阋咧饕趾ε继泐悇游?，其臨床診斷特征為口腔粘膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰。成年動物感染口蹄疫后一般致死率不高但其發(fā)病率可達100%，發(fā)病動物的口、蹄部會出現(xiàn)大量水皰，精神沉郁，進而使得畜產量銳減。幼畜感染口蹄疫后則經常會不見癥狀地猝死，嚴重時致死率可達100%。由于·口蹄疫傳播迅速、難于防治、補救措施少，因此每次爆發(fā)后只能屠宰和集體焚毀染病牲畜以絕后患，從而給畜牧產業(yè)造成巨大的經濟損失?？谔阋卟《臼强谔阋叩闹虏≡鋵儆诩毿『颂呛怂岵《?，具有多血清型、高變異性等特點。已知口蹄疫病毒目前有O、Α、C、SATl (南非I型)、SAT2 (南非II型)、SAT3 (南非III型)和Asial (亞洲I型)7個主要血清型。每種主型又分若干亞型，目前發(fā)現(xiàn)的亞型已有70多種。口蹄疫病毒各型之間的抗原性常常不同，彼此之間不能交互免疫，而且在同一種血清型中抗原變異的程度也很大，以至于能夠有效地抵抗一種亞型的口蹄疫疫苗可能對同一血清型中的另一種亞型卻沒有保護。因為口蹄疫病毒的高異變性和各血清型之間通常不能相互免疫，所以給口蹄疫的防治工作帶來巨大的困難。目前仍迫切需要提供對口蹄疫病毒具有良好免疫原性的疫苗，理想的疫苗還應對多種不同亞型的口蹄疫病毒都具有良好的免疫原性，從而可以為牲畜提供廣泛的免疫保護。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及口蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒疫苗,該抗原多肽和疫苗可使宿主動物產生針對多種不同譜系口蹄疫病毒的免疫原性，從而為宿主動物提供針對多種不同譜系口蹄疫病毒的免疫保護。就本發(fā)明而言，術語“免疫”是指，以適宜的形式和通過適宜的途徑對宿主動物給與某一抗原后，誘導宿主動物產生針對該抗原的特異性的細胞介導的和/或基于抗體的免疫應答，例如，抗體和/或細胞因子的產生和/或細胞毒性T細胞、抗原呈遞細胞、輔助T細胞、樹突細胞的活化，和/或其它細胞應答反應。就本發(fā)明而言，術語“免疫原性”是指一種或多種抗原誘導宿主動物產生針對該一種或多種抗原的特異性的免疫反應的能力。就本發(fā)明而言，術語“抗原多肽”是指由兩個或兩個以上氨基酸通過肽鍵共價連接形成的具有免疫原性的肽鏈結構。本發(fā)明的肽鏈結構可以是直鏈的，帶分支結構的，和/或帶環(huán)狀結構的。
就本發(fā)明而言，術語“疫苗”是指含有一種或多種具有機體免疫能力的抗原并被配制成能向宿主動物給藥形式的制劑。將疫苗引入到宿主動物體內后，該疫苗就能激發(fā)宿主動物產生針對該一種或多種抗原的免疫反應。就本發(fā)明而言，術語“宿主動物”是指能夠被口蹄疫病毒侵入并允許口蹄疫病毒在其體內復制的動物。在某些實施方式中，宿主動物是偶蹄動物。在某些實施方式中，宿主動物是豬、牛、羊等家畜動物?？谔阋卟《驹谒拗鲃游镏械那秩牒蛷椭瓶赡苁顾拗鲃游锂a生口蹄疫的臨床特征，也可能不使宿主動物產生任何臨床特征。本發(fā)明提供了一類人工合成的口蹄疫病毒抗原多肽。根據本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8 X9Lys AlaAla ArgX10 Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X11 Ala He Lys (SEQ ID NO:1 )，其中，X2=Gly或 Ser, X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro, X10=Thr 或 Cys, X11=Gly 或 Cys,且 X10 和 X11 必須有一個且只能有一個取Cys。在一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8 X9 Lys AlaAla ArgCys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He LysCSEQ ID NO:2)，其中，X2=Gly或 Ser, X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8X9Lys Ala AlaArgThr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala He Lys (SEQ ID N0:3)，其中，X2=Gly或 Ser, X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuThr Pro Lys AlaAla Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO:4)o在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuThr Gln Lys AlaAla Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO:5)在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Cys Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuAla Gln Lys AlaAla Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO:6)o在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Cys Lys Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuAla Gln LysAla Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO:7)o根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly X1Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln ValLeu X8X9Lys Ala Ala ArgX10Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X11Ala He Lys (SEQ ID NO:8)，其中，X1=Asn 或 Asp，X2=Gly 或 Ser，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg或 His，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro，X10=Thr 或 Cys，X11=Gly或Cys，且Xici和X11必須有一個且只能有一個取Cys。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly X1Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln ValLeu X8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO:9)，其中， X1=Asn 或 Asp，X2=Gly 或 Ser，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或Arg 或 His，X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly X1Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln ValLeu X8X9Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala He Lys (SEQ IDNO: 10)，其中，X1=Asn 或 Asp，X2=Gly 或 Ser，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或Arg 或 His，X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr GlyX3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu GlnVal LeuX8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQID NO: 11)，其中，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 GlyiX5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly GluX4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp LeuGln Val LeuX8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys(SEQ ID NO: 12)，其中，X4=Ser 或 Gly，X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr，X7=Ala或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly GluX4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp LeuGln Val LeuX8X9Lys Ala Ala ArgThr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala He Lys(SEQ ID NO: 13)，其中，X4=Ser 或 Gly，X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr，X7=Ala或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu SerX5X6X7Asn Val Arg Gly Asp LeuGln Val LeuX8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys(SEQ ID NO: 14)，其中，X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr或 Ala，X9=Gln 或 Pro。根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp LeuGln Val LeuX8X9Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr CysAla lie Lys(SEQ IDNO: 15)，其中，X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser ProX6X7Asn Val Arg Gly AspLeu Gln ValLeuX8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala IleLys (SEQ ID NO: 16)，其中，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser ProX6X7Asn Val Arg Gly AspLeu Gln ValLeuX8X9Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala IleLys (SEQ ID NO: 17)，其中，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro ValX7Asn Val Arg Gly AspLeu Gln ValLeuX8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala IleLys (SEQ ID NO: 18)，其中，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro ValX7Asn Val Arg Gly AspLeu Gln ValLeu X8X9Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala IleLys (SEQ ID NO: 19)，其中，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。

在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeuX8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly AlaHe Lys (SEQ ID NO:20)，其中，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu X8X9Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys AlaHe Lys (SEQ ID NO:21 )，其中，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu ThrX9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly AlaHe Lys (SEQ ID NO:22)，其中，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu ThrX9Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys AlaHe Lys (SEQ ID NO:23)，其中，X9=Gln 或 Pro。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Thr Pro Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla He Lys (SEQ ID NO:24)。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Thr Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla He Lys (SEQ ID NO:25)。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla He Lys (SEQ ID NO:26)。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla He Lys (SEQ ID NO:27)。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8X9Lys Ala AlaArgX10Leu Pro Thr Ser Phe Asn TyrX11Ala He Lys，其中，X2=Gly 或 Ser, X3=Glu 或 Asp,X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala,X9=Gln, X10=Thr或Cys，X11=Gly或Cys，且Xltl和X11必須有一個且只能有一個取Cys。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:`
Val Tyr Asn GlyX1Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln ValLeu X8X9Lys Ala Ala ArgX10Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X11Ala He Lys,其中，X1=Asn或 Asp, X2=Gly 或 Ser, X3=Glu 或 Asp, X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala, X9=Gln, X10=Thr 或 Cys, X11=Gly 或 Cys,且 X10 和 X11 必須有一個且只能有一個取Cys。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr GlyX3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu GlnVal LeuX8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys,其中，X3=Glu 或 Asp, X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr,X8=Thr 或 Ala, X9=Gln0本發(fā)明的抗原多肽包含上述氨基酸序列在一個或多個氨基酸位點進行一個或多個氨基酸的替換、添加和/或刪除所產生的序列。氨基酸替換包括保守替換和非保守替換。保守替換是指性質相似的氨基酸之間的替換，例如極性氨基酸之間的替換(如谷氨酰胺和天冬酰胺之間的替換)，疏水性氨基酸之間的替換(如亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸之間的替換)，以及帶相同電荷的氨基酸之間的替換(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸之間的替換，或者谷氨酸和天冬氨酸之間的替換)等。非保守替換是指不同性質的氨基酸之間的替換，本發(fā)明所包含的非保守替換將不會改變所述抗原多肽針對口蹄疫病毒的特異性免疫原性和活性。本發(fā)明所述的氨基酸的添加和/或刪除將不超過I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個氨基酸。根據本發(fā)明的一個方面，在上述氨基酸序列(例如SEQ IDNOs:1-27的序列)的N端添加和/或刪除不超過I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個氨基酸；根據本發(fā)明的另一個方面，在上述氨基酸序列(例如SEQ ID NOs:1-27的序列)的C端添加和/或刪除不超過I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個氨基酸；根據本發(fā)明的另一個方面，在上述氨基酸序列(例如SEQ ID NOs:l-27的序列)的N端和/或C端添加和/或刪除不超過I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10
個氨基酸。根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一類包含兩個或更多個本發(fā)明的抗原多肽的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的多個抗原多肽彼此之間共價或非共價連接。共價連接例如可以是通過酯鍵、醚鍵、磷酸酯鍵、酰胺鍵、肽鍵、二酰亞胺鍵、碳-硫鍵，或者碳-磷鍵相互連接。非共價連接例如可以是通過離子間的相互作用力、疏水作用，或者氫鍵相互連接。在本發(fā)明的一個實施方式中，融合抗原多肽所含的多個抗原多肽通過連接鏈連接。就本發(fā)明而言，術語“連接鏈”是指，用于共價或非共價連接相鄰的兩個多肽序列的結構單元，該結構單元的引入不會對融合抗原多肽的免疫原性產生損害。連接鏈可包括一個或多個氨基酸殘基，連接鏈還可以包括例如C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、芳基或雜芳基等結構?，F(xiàn)有技術披露了一些已知的連接鏈，本領域技術人員可以根據需要容易地加以選擇。

在本發(fā)明的另一個實施方式中，融合抗原多肽中所用的連接鏈由一個或多個賴氨酸，丙氨酸，甘氨酸，絲氨酸和/或脯氨酸或其任意組合組成。例如連接鏈由I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個或更多個前述氨基酸或其任意組合組成。在本發(fā)明的另一個實施方式中，融合抗原多肽中所用的連接鏈為由一個或多個賴氨酸組成的短肽，例如短肽序列 Lys, Lys Lys7Lys Lys Lys7Lys Lys Lys Lys7Lys Lys Lys Lys Lys7Lys LysLysLys Lys Lys。在本發(fā)明的另一個實施方式中，融合抗原多肽中所用的由一個或多個賴氨酸組成的連接鏈包括一個或多個ε-賴氨酸。在本發(fā)明的另一個實施方式中，融合抗原多肽中所用的連接鏈為由一個或多個賴氨酸和丙氨酸混合組成的短肽，例如Lys Ala Lys,Ala Lys Ala，Lys Ala Ala Lys, Ala Lys Lys Ala，Lys Lys Ala Lys, Ala Lys Ala Lys,Lys Lys Ala Lys Lys或者Lys Ala Lys Lys Ala Lys。在本發(fā)明的另一個實施方式中，融合抗原多肽中所用的連接鏈為由一個或多個脯氨酸，和/或絲氨酸和/或甘氨酸混合組成的多妝，例如 Pro Ser Pro, Ser Pro Ser, Ser Ser Pro, Pro Pro Ser, Gly Ser Gly, SerGly Ser, Ser Ser Gly Ser, Gly Gly Ser Gly, Gly Ser Gly Ser, Gly Ser Gly Ser Ser,Gly Gly Gly Gly Ser。融合抗原多肽所包含的抗原多肽數(shù)量例如可以是2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個或者更多個。融合抗原多肽中所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的。例如，融合抗原多肽包含兩個SEQ IDN0.1所示的抗原多肽，或者包含兩個SEQ IDN0.2所示的抗原多肽，亦或者包含一個SEQ ID N0.1所示的抗原多肽和一個SEQ ID N0.2所示的抗原多肽。融合抗原多肽包含的抗原多肽可以是天然的口蹄疫病毒抗原多肽序列，也可以是人工合成的口蹄疫病毒抗原多肽。在本發(fā)明的一個實施方式中，融合抗原多肽包含一個或多個本發(fā)明提供的抗原多肽序列和一個或多個天然抗原多肽序列。例如，融合抗原多肽包含一段本發(fā)明提供的抗原多肽序列和一段天然抗原多肽序列。又例如，融合抗原多肽包含至少一段本發(fā)明提供的抗原多肽序列和至少一段天然的抗原多肽序列。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明的融合抗原多肽包含口蹄疫病毒多聚蛋白的全部或部分氨基酸序列。已知的O型口蹄疫病毒多聚蛋白的一種天然氨基酸序列含有104個氨基酸，其氨基酸序列如下:His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser HisThr Thr Asn ValArg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu ProThr Ser Phe Asn Tyr Gly AlaIle Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg MetLys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg ProLeu Leu Ala He His Pro Asn Glu Ala ArgHis Lys Gln Lys He Val Ala Pro Val Lys Gln Leu LeuAsn Phe Asp Leu Leu Lys LeuAla Gly Asp Val Glu Ser (GenBank N0.:ABU87566.1) (SEQ ID NO:28)。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一類包含本發(fā)明的抗原多肽和T輔助細胞表位的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的抗原多肽和T輔助細胞表位可以分別是一個或多個，例如融合抗原多肽分別包含I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個或更多個抗原多肽和T輔助細胞表位。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的，所包含的T輔助細胞表位可以是相同的也可以是不相同的。相鄰的抗原多肽和T輔助細胞表位之間、相鄰的抗原多肽之間或者相鄰的T輔助細胞表位之間可以通過其自身氨基酸形成的肽鍵連接，亦或通過本發(fā)明前述部分提到的其它任意方式相連接，例如通過連接鏈連接抗原多肽和T輔助細胞表位。此處述及的T輔助細胞表位是指一抗原上供T輔助細胞識別的氨基酸序列。T輔助細胞是指一類特定的T細胞，其作用是輔助T殺傷細胞從而使T殺傷細胞與目標抗原或細胞結合而消滅或殺死該目標抗原或細胞?，F(xiàn)有技術披露了一些已知的T輔助細胞表位，本領域技術人員在了解此目的 的基礎上可以根據其掌握的技術常識選擇合適的T輔助細胞表位并用在本發(fā)明的融合抗原多肽中。T輔助細胞表位的實例包括但不限于，乙肝病毒表面和核心抗原T輔助細胞表位、百日咳毒素T輔助細胞表位、破傷風毒素T輔助細胞表位、麻疹病毒F蛋白T輔助細胞表位、沙眼衣原體主要外膜蛋白T輔助細胞表位、白喉毒素T輔助細胞表位、鐮狀瘧原蟲環(huán)孢子體T輔助細胞表位、曼森氏吸蟲三糖磷酸鹽異構酶T輔助細胞表位，及大腸桿菌TraT T輔助細胞表位。在本發(fā)明的一個實施方式中，T輔助細胞表位為基于麻疹病毒T輔助細胞表位，其包含如下所示的氨基酸序列:Leu Ser Glu He Lys Gly Val He Val His Arg Leu Glu Gly Val (SEQ IDN0:29)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，T輔助細胞表位為基于麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的氨基酸序列:Gly He Leu GluX1X2Gly He X3AlaX4Ile X5X6Thr Glu Leu He PheCSEQ ID NO:30),其中 X1=Ser 或 Thr, X2=Arg 或 Lys, X3=Lys 或 Arg, X4=Arg 或 Lys, X5=Thr 或 Gly, X6=His或 Arg。在本發(fā)明的另一個實施方式中，T輔助細胞表位為基于麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的氨基酸序列:Gly He Leu Glu Ser Arg Gly He Lys Ala Arg He Thr His Thr Glu Leu IlePhe (SEQ ID NO:31)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，T輔助細胞表位為基于麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的氨基酸序列:Gly He Leu Glu Thr Arg Gly He Lys Ala Arg He Thr His Thr Glu Leu IlePhe (SEQ ID NO:32)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，T輔助細胞表位為基于麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的氨基酸序列:Gly He Leu Glu Thr Lys Gly He Lys Ala Arg He Thr His Thr Glu Leu IlePhe (SEQ ID NO:33)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，T輔助細胞表位為基于麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的氨基酸序列:Gly He Leu Glu Thr Lys Gly He Arg Ala Lys He Gly Arg Thr Glu Leu IlePhe (SEQ ID NO:34)。包含有抗原·多肽和T輔助細胞表位的融合抗原多肽的非限定性實例例如是:
權利要求
1.種包含如下所示氨基酸序列的口蹄疫病毒抗原多肽:Cys Lys TyrX2X3X4X5X6X7AsnVal Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuX8X9Lys Ala Ala Arg X10Leu Pro Thr Ser Phe AsnTyrX11Ala He Lys,其中，X2=Gly 或 Ser, X3=Glu 或 Asp, X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg或 His, X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala, X9=Gln, X10=Thr 或 Cys, X11=Gly 或 Cys,且Xltl和X11必須有一個且只能有一個取Cys。
2.權利要求1所述的口蹄疫病毒抗原多肽，其特征在于，包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6，和 SEQ ID NO:7。
3.權利要求1所述的口蹄疫病毒抗原多肽，其特征在于，包含如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly X1Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln ValLeuX8X9Lys Ala Ala Arg X10Leu Pro Thr Ser Phe Asn TyrX11Ala He Lys,其中，X1=Asn或 Asp, X2=Gly 或 Ser, X3=Glu 或 Asp, X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala, X9=Gln, X10=Thr 或 Cys, X11=Gly 或 Cys,且 X10 和 X11 必須有一個且只能有一個取Cys。
4.權利要求3所述的口蹄疫病毒抗原多肽，其特征在于，包含如下所示的氨基酸序列:Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr GlyX3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln ValLeuX8X9Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys,其中，X3=Glu 或 Asp, X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr,X8=Thr 或 Ala, X9=Gln0
5.權利要求4所述的口蹄疫病毒抗原多肽，其特征在于，包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26，和 SEQ ID NO:27。
6.權利要求1-5中任一項所述的口蹄疫病毒抗原多肽，其特征在于所述抗原多肽帶有通過二硫鍵形成的環(huán)狀結構。
7.權利要求6所述的口蹄疫病毒抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽的環(huán)化度至少為85%。
8.種口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，包含至少兩條選自權利要求1-5中任一項所述的抗原多肽。
9.種口蹄疫病毒融合抗原多肽,其特征在于，包含至少一條口蹄疫病毒抗原多肽， 和選自以下組的一種或多種多肽序列:T輔助細胞表位，免疫刺激序列和天然口蹄疫病毒抗原多肽；所述口蹄疫病毒抗原多肽包含如下所示的氨基酸序列:Cys LysTyrX2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuX8X9Lys Ala Ala Arg X10Leu Pro ThrSer PheAsn TyrX11Ala He Lys,其中，X2=Gly 或 Ser, X3=Glu 或 Asp, X4=Ser 或 Gly, X5=Pro或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala, X9=Gln 或 Pro, X10=Thr 或Cys, X11=Gly或Cys，且Xltl和X11必須有一個且只能有一個取Cys。
10.權利要求9所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，包含至少一條口蹄疫病毒抗原多肽，所述口蹄疫病毒抗原多肽包含如下所示的氨基酸序列:Val Tyr AsnGlyX1Cys Lys Tyr X2X3X4X5X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8X9Lys Ala AlaArgX10Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X11Ala He Lys,其中，X1=Asn 或 Asp, X2=Gly 或 Ser,X3=Glu 或 Asp, X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr,X8=Thr 或 Ala, X9=Gln 或 Pro, X10=Thr 或 Cys, X11=Gly 或 Cys,且 X10 和 X11 必須有一個且只能有一個取Cys。
11.權利要求9或10所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，所述融合抗原多肽包含T輔助細胞表位。
12.權利要求11所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，所述T輔助細胞表位包含如下所示的氨基酸序列:Gly He Leu Glu X1X2Gly He X3Ala X4Ile X5X6Thr GluLeuIle Phe,其中 X1=Ser 或 Thr, X2=Arg 或 Lys, X3=Lys 或 Arg, X4=Arg 或 Lys, X5=Thr 或 Gly,X6=His 或 Arg0
13.權利要求1 2所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，所述T輔助細胞表位包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:33 JPSEQ ID NO:34。
14.權利要求12所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，所述融合抗原多肽的抗原多肽和T輔助細胞表位由連接鏈連接,所述連接鏈由一個或多個Lys組成。
15.權利要求13所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，所述融合抗原多肽的抗原多肽和T輔助細胞表位由連接鏈連接,所述連接鏈由一個或多個Lys組成。
16.權利要求15所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，所述的融合抗原多肽包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41 JPSEQ IDNO:42o
17.權利要求9或10所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于所述融合抗原多肽帶有通過二硫鍵形成的環(huán)狀結構。
18.權利要求17所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽，其特征在于，所述融合抗原多肽的環(huán)化度至少為85%。
19.種核酸序列,其特征在于,編碼權利要求1-7中任一項所述的口蹄疫病毒抗原多肽或者編碼權利要求8-18中任一項所述的口蹄疫病毒融合抗原多肽。
20.種口蹄疫病毒疫苗,其特征在于,包含一種或多種選自權利要求1-18中任一項所述的抗原多肽或融合抗原多肽，和藥學上可接受的媒介物。
21.權利要求1-7中任一項所述的抗原多肽或如權利要求8-18中任一項所述的融合抗原多肽在制備預防和/或控制口蹄疫病毒的藥物中的應用。
22.權利要求21所述的應用，其特征在于，所述抗原多肽用于制備預防和/或控制豬、?；蜓蚩谔阋叩乃幬?。
23.種檢測口蹄疫病毒抗體的方法，該方法包括:a)提供一種如權利要求1-7中任一項所述的抗原多肽或者如權利要求8-18中任一項所述的融合抗原多肽；b)將所述抗原多肽或者融合抗原多肽與測試樣品接觸從而形成抗原-抗體復合物；c)檢測樣品中的口蹄疫病毒抗體。
24.種檢測口蹄疫病毒抗體的試劑盒，該試劑盒包含:a)如權利要求1-7中任一項所述的抗原多肽或者如權利要求8-18中任一項所述的融合抗原多肽；b)可以將所述抗原多肽或者融合抗原多肽固定其上的固定相。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種口蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒疫苗。本發(fā)明還提供了該抗原多肽，融合抗原多肽及疫苗的制備方法。本發(fā)明進一步提供了所述抗原多肽，融合抗原多肽及疫苗在預防和控制口蹄疫病毒感染方面的應用。本發(fā)明的口蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽和疫苗具有廣譜的免疫原性，其可以對不同口蹄疫病毒及其變異株都產生良好的免疫原性。
文檔編號A61P31/14GK103087156SQ20131004832
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權日2012年8月10日
發(fā)明者陳智英, 鄭海學, 劉湘濤, 才學鵬, 聶東升, 殷宏 申請人:申聯(lián)生物醫(yī)藥(上海)有限公司, 中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所