專利名稱：一種應(yīng)用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明提供一種治療腫瘤藥物領(lǐng)域，特別涉及一種miR-181a在逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響著婦女的身心健康甚至危及生命?；熓侨橄侔┲委煹某Ｓ梅椒?，但化療過程中出現(xiàn)的耐藥問題嚴(yán)重影響了臨床療效和患者預(yù)后。與乳腺癌耐藥作用密切相關(guān)的乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistantprotein, BCRP)是從耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株MCF7/AdrVP中用mRNA指紋分析法分離出來的跨膜半轉(zhuǎn)運蛋白。其基因定位于人染色體4q22，由ABCG2基因編碼，2.4kb mRNA翻譯的655個氨基酸殘基構(gòu)成，含有一個ATP結(jié)合域和一個疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域，是繼多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、P糖蛋白(P-gp)和肺耐藥蛋白(LRP)之后，腫瘤多藥耐藥機(jī)制研究中的又一熱點蛋白。BCRP通過水解ATP供能將轉(zhuǎn)運底物(化療藥物)從細(xì)胞內(nèi)逆濃度梯度泵到細(xì)胞外，使乳腺癌細(xì)胞內(nèi)米托蒽醌(MX)、拓?fù)涮婵档葷舛认陆担瑥亩鴮?dǎo)致細(xì)胞對藥物抵抗、誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生。近年來微小RNA(microRNA，miRNA)在逆轉(zhuǎn)耐藥中的作用受到相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。miRNA是長度約22nt的內(nèi)源性單鏈的非蛋白編碼RNA，在個體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生理活動中以及在腫瘤發(fā)生、發(fā)展等病理過程中起重要調(diào)控作用。miRNA —般通過與目標(biāo)mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3’ UTR)特異結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。由于BCRPmRNA_3’ UTR長度約為 2kb (Genebank:accession n0.NM_004827;UTR 數(shù)據(jù)庫:UTR database entryUTR: 3HSA117529)，遠(yuǎn)長于人類 mRNAs_3’UTR 的平均長度 700bp，因此，提示 BCRPmRNA_3’UTR可能存在miRNA調(diào)控BCRP表達(dá)的作用靶點。一些研究證實某 些miRNAs可通過作用于BCRPmRNA-3’UTR調(diào)節(jié)BCRP的表達(dá)。Wang等在胰腺癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)miR-520h能夠下調(diào)BCRP的蛋白表達(dá)水平；To KK等在結(jié)腸癌細(xì)胞的研究結(jié)果也證實了這一點:miR-519c具有降低SI結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)源性BCRP轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)作用；Pan等研究發(fā)現(xiàn)在耐藥的乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MX100中轉(zhuǎn)染miR-328或miR_519c后BCRP的蛋白表達(dá)水平明顯下降。可見miRNA對靶向調(diào)控BCRP參與乳腺癌耐藥起到了關(guān)鍵的作用。本發(fā)明中我們應(yīng)用生物學(xué)信息分析可得到，BCRPmRNA-3’ UTR存在miR_181a調(diào)控BCRP表達(dá)的作用靶點，但是miR-181a是否對BCRP的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)以及由此而逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥目前尚不清楚。因此，本發(fā)明在乳腺癌藥物敏感細(xì)胞MCF-7 (BCRP低表達(dá))和耐藥細(xì)胞 MCF-7/MX (BCRP 高表達(dá))中，分別轉(zhuǎn)染 miR_181a inhibitor 和 miR_181a mimic,構(gòu)建miR-181a沉默表達(dá)和過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞模型，及對裸鼠進(jìn)行MCF-7/MX細(xì)胞皮下注射，構(gòu)建在體移植瘤模型，MX處理上述模型后，觀察細(xì)胞及小鼠對MX的敏感性、BCRP的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)MX含量變化，探討離體和在體水平時miRNA-181a對乳腺癌細(xì)胞耐藥性的影響及可能機(jī)制。發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種應(yīng)用miR_181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法，所述方法包括:(1利用miR-181a的模擬物miR_181a mimic，抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中的BCRP表達(dá)與藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對BCRP轉(zhuǎn)運底物鹽酸米托蒽醌MX的敏感性；(2)利用miR-181a的模擬物miR_181a agmir脂質(zhì)體，靶向抑制MCF-7/MX誘導(dǎo)的乳腺癌裸鼠移植瘤內(nèi)BCRP的表達(dá)，增加在體瘤細(xì)胞對MX的藥物敏感性；(3)利用miR-181a的抑制劑miR_181a inhibitor上調(diào)藥物敏感細(xì)胞MCF-7的BCRP表達(dá)和藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對MX的耐藥性。步驟(I)中miR_181a模擬物miR_181a mimic為包含miR_181a核酸序列“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，主要序列如下:5’ -AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’。步驟(I)中所述腫瘤細(xì)胞為乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX。乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX為過表達(dá)BCRP乳腺癌細(xì)胞。步驟(3)中使用的細(xì)胞為乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7 ;乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7為miR-181a過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞。步驟(1)中miR-181a模擬物miR-181a mimic轉(zhuǎn)染入乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中的終濃度范圍為:10nM-80nM，轉(zhuǎn)染時間為48小時。步驟(2)中利用miR_181a模擬物miR_181a agmir脂質(zhì)體,作用于MCF-7/MX誘導(dǎo)的乳腺癌裸鼠移植瘤時，采用的注射方法為裸鼠瘤周及瘤內(nèi)多點注射，脂質(zhì)體注射量為lnmol,注射次數(shù)為每星期注射兩次，共計注射五次。優(yōu)點及效果:在乳腺癌藥物敏感細(xì)胞MCF-7 (BCRP低表達(dá))和耐藥細(xì)胞MCF-7/MX(BCRP高表達(dá))中，通過real time-RCR檢測miR_181a表達(dá)和蛋白免疫印跡分析BCRP表達(dá)，觀察在兩細(xì)胞中miR-181a和BCRP的表達(dá)差異及負(fù)性關(guān)系；通過熒光素酶報告分析，明確在BCRPmRNA-3’ UTR區(qū)是否存在miR_181a的作用靶點；進(jìn)一步在MCF-7和MCF-7/MX細(xì)胞中，分別通過轉(zhuǎn)染miR_181a inhibitor和miR_181a mimic,構(gòu)建miR_181a沉默表達(dá)和過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞模型，及對裸鼠進(jìn)行MCF-7/MX細(xì)胞皮下注射，構(gòu)建在體移植瘤模型，MX處理上述模型后，觀察細(xì)胞及小鼠對MX的敏感性、BCRP的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)MX含量變化，探討離體和在體水平時miR-181a對乳腺癌細(xì)胞耐藥性的影響及可能機(jī)制。本發(fā)明的結(jié)果證實，miR-181a通過與BCRPmRNA_3’UTR靶向結(jié)合，抑制BCRP表達(dá)。干預(yù)miR-181a表達(dá) 可影響乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性，與靶向作用BCRP、影響細(xì)胞內(nèi)MX藥物濃度相關(guān)。因此，本發(fā)明可以用作預(yù)測乳腺癌患者對化療藥物敏感性程度的分子標(biāo)志物，為臨床個體化用藥提供依據(jù)，同時為抗耐藥乳腺癌藥物設(shè)計和篩選提供新的靶點，又可開發(fā)為一種miRNA小分子藥物。


:圖1miRNAs芯片分析MCF-7和MCF-7/MX兩種細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)情況。
圖2miR-181a 靶向抑制 BCRP 表達(dá)。A =RNAhybrid 理論分析 miR_181a 與BCRPmRNA-3’ UTR的核酸堿基序列，預(yù)測兩者的理論結(jié)合位點；B:熒光素酶報告基因分析miR-18Ia 靶向作用于 BCRPmRNA-3’ UTR 區(qū)，與 NC 組比:*P<0.05 ；C:Real-time PCR 檢測轉(zhuǎn)染不同濃度 miR_181a mimic 或 NC_mimic48h 后 MCF-7/MX 中 miR_181a 的表達(dá)情況。D:Real-time PCR 檢測轉(zhuǎn)染不同濃度 miR_181a mimic 或 NC_mimic48h 后，MCF-7/MX 中 BCRP的 mRNA 的表達(dá)水平；E:ffestern Blotting 檢測轉(zhuǎn)染 miR_181a mimic 或 NC_mimic48h 后MCF-7/MX中四種耐藥蛋白的表達(dá)圖；F:統(tǒng)計分析四種耐藥蛋白表達(dá)水平。與NC組比:*P〈0.05圖3Western Blotting檢測MCF-7和MCF-7/MX兩種細(xì)胞內(nèi)耐藥蛋白 MRP、PGP、LRP和BCRP的表達(dá)情況。A:各組代表性結(jié)果圖；B:給予不同濃度MX處理，測定兩種細(xì)胞的增殖水平及IC50值。圖4miR-181a 增加 MCF-7/MX 細(xì)胞對 MX 敏感性。A:MCF_7/MX 中轉(zhuǎn)染 miR-18Iamimic或NC-mimic48h后，·MX處理細(xì)胞0.5小時，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度；B:統(tǒng)計分析不同處理因素下細(xì)胞熒光強(qiáng)度值，以NC組值為1，計算其余處理下變化倍數(shù)；C:MCF-7/MX中轉(zhuǎn)染miR-181a mimic或NC_mimic48h后，以不同濃度MX處理細(xì)胞48h后，檢測細(xì)胞對藥物敏感性的變化；D: (B)MCF-7/MX中轉(zhuǎn)染miR_181a mimic或NC_mimic48h后，以不同濃度依托泊苷處理細(xì)胞48h后，檢測細(xì)胞對藥物敏感性的變化。與NC組比:*P〈0.05圖5瘤體內(nèi)注射miR_181a增加MX抗腫瘤作用。A:不同時間點各組腫瘤生長體積變化曲線:各組瘤組織重量統(tǒng)計；C:Real-time PCR檢測各組瘤內(nèi)miR_181a的表達(dá)情況圖6miR_181a抑制乳腺癌裸鼠移植瘤中BCRP表達(dá)。A:Real-time RT-PCR檢測各組瘤內(nèi)MRP、PGP、LRP、BCRP四種耐藥蛋白mRNA表達(dá)；B =WesternBlot檢測各組瘤內(nèi)MRP、PGP,LRP>BCRP四種耐藥蛋白表達(dá)；C:統(tǒng)計軟件計算各組蛋白平均光密度值的統(tǒng)計結(jié)果。與NC 組比:*P<0.05圖7抑制miR_181a上調(diào)了乳腺癌藥物敏感細(xì)胞MCF-7的BCRP表達(dá)。A:Real_timePCR檢測轉(zhuǎn)染 miR_181a inhibitor 或 NC_inhibitor48h 后 MCF-7 中 miR_181a 的表達(dá)情況；B:Real_time PCR 檢測轉(zhuǎn)染 miR_181a inhibitor 或 NC_inhibitor48h 后，MCF-7 中四種耐藥蛋白 MRP、PGP、LRP、BCRP 的 mRNA 的表達(dá)水平；C:ffestern Blotting 檢測轉(zhuǎn)染 miR_181ainhibitor或NC_inhibitor48h后MCF-7中四種耐藥蛋白的表達(dá)圖；D:統(tǒng)計分析四種耐藥蛋白表達(dá)水平。與NC組比:*P〈0.05圖8抑制miR_181a增加藥物敏感細(xì)胞MCF-7對MX的耐藥性。A:MCF_7中轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor或NC_inhibitor48h后，MX處理細(xì)胞0.5小時，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度:統(tǒng)計分析細(xì)胞內(nèi)藥物濃度；C:MCF-7中轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor或NC-1nhibitor48h后，以不同濃度MX處理細(xì)胞48h后，檢測細(xì)胞對藥物敏感性的變化；D:MCF-7中轉(zhuǎn)染miR_181a inhibitor或NC_inhibitor48h后，以不同濃度依托泊苷處理細(xì)胞48h后，檢測細(xì)胞對藥物敏感性的變化。與NC組比較:*P〈0.05實施方式:一種應(yīng)用miR_181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法，所述方法包括:(I)利用miR_181a的模擬物miR_181a mimic，抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中的BCRP表達(dá)與藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對BCRP轉(zhuǎn)運底物鹽酸米托蒽醌MX的敏感性；
(2)利用miR_181a的模擬物miR_181a agmir脂質(zhì)體，靶向抑制MCF-7/MX誘導(dǎo)的乳腺癌裸鼠移植瘤內(nèi)BCRP的表達(dá)，增加在體瘤細(xì)胞對MX的藥物敏感性；(3)利用miR-181a的抑制劑miR_181a inhibitor上調(diào)藥物敏感細(xì)胞MCF-7的BCRP表達(dá)和藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對MX的耐藥性。以下結(jié)合具體施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但并不是對本發(fā)明的限定:實施例1:miRNA芯片分析乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7和耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中miRNAs表達(dá)譜差異；本發(fā)明所采用的人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自美國ATCC細(xì)胞庫，由本室自行凍存。MCF-7/MX由本實驗室誘導(dǎo)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(高糖)，其中添加青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml，5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過miRNA芯片分析乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7和耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中miRNAs表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)23個miRNAs存在表達(dá)差異(>2倍)(見圖1A和1B)，其中miR-181a在MCF-7/MX中均下調(diào)最為明顯。實施例2:Real-time PCR 檢測 miR_181a 在 MCF-7 和 MCF-7/MX 中的表達(dá)差異；MCF-7和MCF-7/MX細(xì)胞培養(yǎng)24小時后收集細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒(Bioteke，RP5301)步驟，提取總RNA，并用紫外分光光度計測定RNA的濃度和質(zhì)量。采用SYBRreal-time PCR試劑盒(Takera，DRR036S)，按 10 y I 體系(DEPC H2O0.45 u l,5*buffer2u 1，RRI0.25u I, M-MLV0.3 u 1，RT-primmerl u 1，dNTPl u 1，RNA5 u I),反應(yīng)條件為:30 °C，IOmin ;42°C，lh ；85°C,5min ；5°C,5min ;4°C，2h，逆轉(zhuǎn)錄得 cDNA。再按 25 u I 體系(去離子水 l，2*SYBRgreenl2.1，Rox0.5 u 1，上游引物 0.1，下游引物 0.5 y 1，cDNA2 u I)進(jìn)行 real-time PCR 實驗，反應(yīng)條件為:95°C,2min ;95°C，15s ；60°C,30s,40 循環(huán)；95°C,Imin ；55°C, 30s ;95°C，30s。實驗最少重復(fù)三次，對miR_181a細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計分析。本發(fā)明real-time PCR檢測結(jié)果顯示在MCF-7/MX細(xì)胞中miR_181a的表達(dá)水平下降，其中miR-181a的表達(dá)下降約80% (見圖1C)。實施例3:ffestern Blotting 檢測 BCRP 在 MCF-7 和 MCF-7/MX 中的表達(dá)差異；MCF-7和MCF-7/MX細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗一遍，按照膜蛋白提取試劑盒(Therm0，89826)操作，加入新鮮配置的細(xì)胞裂解液，立即用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，冰浴搖床搖30分鐘，充分裂解細(xì)胞。4°C、13，OOOg離心15分鐘，收集上清至新的EP管中，用BCA法(碧云天，P0012)進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白樣品，加5*上樣緩沖液(20%甘油，4%十二烷基硫酸鈉，10%P -巰基乙醇，0.05%溴酚藍(lán)，1.25M Tris - HCl, pH6.8)，金屬浴95°C變性10分鐘后，用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含有5%脫脂奶粉的1%吐溫20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)封閉兩小時，TBST沖洗3次，每次10分鐘，分別進(jìn)行五種蛋白鼠源一抗:ABCG2/BCRP (abeam, ab3380), PGP (abeam, ab3366), LRP (Santa,sc23916), MRP (abeam, ab24102)，^ -actin (SANTA, sc47778)，稀釋 500 倍，室溫孵育兩小時，4° C過夜。TBST沖洗三次，每次10分鐘。添加抗鼠二抗(1:3000，中杉金橋，282305)，室溫孵育1.5小時，TBST沖洗三次，ECL發(fā)光。實驗最少重復(fù)三次，測定灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用蛋白免疫印跡分析顯示四種耐藥蛋白MRP、PGP、LRP、BCRP在MCF-7/MX中均比在MCF-7中表達(dá)增高，其中BCRP表達(dá)差異最大(P〈0.05)(見圖3A)。本發(fā)明綜合實施例2結(jié)果提示導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞耐藥性增加的BCRP過表 達(dá)與miR-181a低表達(dá)相關(guān)。實施例4:生物學(xué)信息分析及熒光素酶報告基因分析miR-181a靶向作用于BCRPmRNA-3’ UTR 區(qū)；通過RNAhybrid 發(fā)現(xiàn) miR_181a 與 BCRPmRNA-3’UTR 區(qū)的 3007bp_3029bp 存在結(jié)合位點(圖2A)。為了進(jìn)一步驗證miR-181a是否與BCRPmRNA-3’ UTR有結(jié)合位點，本發(fā)明應(yīng)用Luciferase 熒光素酶報告分析進(jìn)行檢測。將 pEGFP_BCRP3’ UTR 與 pcDNA3.3_miR-181a或pcDNA3.3空質(zhì)粒(陰性對照)按lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞48h后，應(yīng)用熒光檢測儀檢測熒光強(qiáng)度。實驗最少重復(fù)三次，對熒光素酶結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)(見2B):在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.3_miR-181a和PGL3-BCRP-3’ UTR48h 后，與轉(zhuǎn)染 pcDNA3.3 空質(zhì)粒(陰性對照)和 PGL3-BCRP-3’ UTR 相比，酶活性下降30%左右(P〈0.05)。提示miR-181a與BCRPmRNA-3’ UTR區(qū)存在直接結(jié)合位點。實施例5:miR-181a抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中的BCRP表達(dá)；為了檢測miR_181a是否對BCRP的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，首先在實施例2和實施例3中發(fā)現(xiàn)的BCRP高表達(dá)的耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中轉(zhuǎn)染miR-181a mimic，構(gòu)建miR_181a過表達(dá)的細(xì)胞模型。其轉(zhuǎn)染具體步驟為:將乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX在六孔板(3X IO5個/孔)或IOOmm培養(yǎng)皿(2X IO6個)中培養(yǎng)24小時后，用不含抗生素的無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)I小時，之后按lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟分別轉(zhuǎn)染miR_181a mimic (Ribobio)及非特異性的陰性對照質(zhì)粒(miR-NC) (Ribobio)，終濃度分別為10、20、40、80nM。4小時后，用新鮮的含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，備用。按實施例2所述通過r eal-time PCR檢測miR_181a在MCF-7/MX中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10、20、40、80nM miR-181a mimic轉(zhuǎn)染48小時后，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量增大分別為159、271、335、380倍(見圖2C)，說明miR-181a過表達(dá)模型構(gòu)建成功。進(jìn)一步檢測BCRPmRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在20M miR-181amimic轉(zhuǎn)染48小時后，BCRPmRNA表達(dá)分別下降18%、45%、30%,28% (P<0.05)(見圖 2D)?？梢?，20nM miR_181a mimic 抑制 BCRPmRNA 表達(dá)的作用最明顯。(P〈0.05)。此外，其他三種MRP、PGP、LRP耐藥蛋白mRNA無明顯變化。進(jìn)一步按實施例 3 所述進(jìn)行 Western Blotting 檢測 20nM miR-181a mimic 對 MCF-7/MX 中 BCRP 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCRP的蛋白表達(dá)下降了 30% (P〈0.05)，而其他三種耐藥蛋白均無明顯變化(見圖2E及圖2F)。說明miR-181a能靶向抑制MCF-7/MX耐藥細(xì)胞中的BCRP表達(dá)。實施例6:miR-181a可抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中BCRP的轉(zhuǎn)運功能，增加細(xì)胞內(nèi)MX的含量；按實施例5所述轉(zhuǎn)染方法在六孔板中瞬時轉(zhuǎn)染后的MCF-7/MX細(xì)胞，分別設(shè)置空白組，陰性轉(zhuǎn)染組，miR-181a mimic組，其中后二組加入3 y M的BCRP的特異性轉(zhuǎn)運底物鹽酸米托蒽醌(MX)，I小時后用冷的PBS洗，添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，1.5小時后收獲細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，檢測細(xì)胞對藥物的外排作用。實驗最少重復(fù)3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比，miR-181a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)MX含量明顯升高(見圖4A及圖4B，P〈0.05)。證實了 miR-181a可抑制耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中BCRP的轉(zhuǎn)運功能，增加細(xì)胞內(nèi)MX的含量。實施例7:miR-181a增加乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX對MX的敏感性；取MCF-7/MX的空白組、陰性對照組及miR_181a mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染48h后，在96孔板中培養(yǎng)，每孔細(xì)胞數(shù)為IXlO40分別給予濃度為0,0.01,0.03,0.1,0.3、1、3、10、30 ii M 的 MX 及 O、1、3、10、30、100、300、1000、3000 u M 的依托泊苷培養(yǎng) 48 小時后，添加 20 U I(5mg/ml) MTT, 37 °C孵育4小時后，吸出上清液，添加100 yl/孔二甲基亞砜(DMSO)，搖床搖晃lOmin，用酶標(biāo)儀(安圖)在570nm測量吸光度，同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。計算抑制率，抑制率％=1_(加藥孔-調(diào)零孔)/(對照孔-調(diào)零孔)，用16.0SPSS軟件計算IC50。實驗最少重復(fù)三次，對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。本發(fā)明發(fā)現(xiàn):與陰性轉(zhuǎn)染組比(IC50=3.86 ±0.36 ii M ii M)，miR-181a轉(zhuǎn)染組(IC50=1.57±0.08 u M)細(xì)胞對MX的敏感性明顯增加(見圖4C，P〈0.05)，而對依托泊苷的敏感性無明顯改變(見圖4D)。綜上結(jié)果證實了 miR-181a抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中的BCRP表達(dá)與藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對MX的敏感性。實施例8:miR-181a增加了乳腺癌裸鼠移植瘤對MX的藥物敏感性；為了進(jìn)一步明確miR_181a對MCF-7/MX耐藥性的影響，進(jìn)行了裸鼠在體實驗。首先進(jìn)行裸鼠移植瘤模型構(gòu)建:取4-6周雌性無胸腺BALB/C小鼠(購于上海斯萊克實驗動物有限公司)，均在中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級條件下無菌分籠飼養(yǎng)，操作過程中水和食物充足給予。采用常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞種植法，取對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7和MCF-7/MX細(xì)胞，分別制成4X IOVml的細(xì)胞懸液，取0.2ml接種于每只BALB/C鼠右肩胛皮下，待移植瘤長到5*5*5mm后，隨機(jī)將成瘤裸鼠分為四大組:其中I組(空白組)、11組(陰性轉(zhuǎn)染組)、111組(陰性轉(zhuǎn)染+MX處理組)IV組(miR-181a處理組)，每組6只。每組裸鼠均采用瘤周及瘤內(nèi)多點注射處理。I組:生理鹽水(總量200 ii 1)，II組:對照脂質(zhì)體Inmol+生理鹽水(總量200 ii I), III組:對照脂質(zhì)體Inmol+生理鹽水(總量200 u I), IV:miR-181a agmir脂質(zhì)體lnmol+生理鹽水(總量200 yl )，每星期注射兩次，共計注射五次。第一次給予瘤內(nèi)注射3天后，按照1.5mg/kg尾靜脈注射藥物，I組、II組:生理鹽水，III組、IV組:鹽酸米托蒽醌，每星期注射兩次，共計注射四次。每次給藥前，以游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大直徑及相對應(yīng)的橫徑，根據(jù)公式V (mm3) = H/6 X腫瘤直徑(mm) X腫瘤橫徑(mm) X腫瘤橫徑(mm)，計算腫瘤體積大小。兩星期后處死4組裸鼠，取腫瘤。測量瘤塊質(zhì)量。提RNA及蛋白用于相關(guān)實驗分析。結(jié)果本發(fā)明發(fā)現(xiàn):兩周后，與對照組比，miR-lSla組瘤體積和瘤重明顯受到抑制(見圖5A、圖5B，P〈0.05)，表明miR-181a增加了乳腺癌裸鼠移植瘤對MX的藥物敏感性。進(jìn)一步按實施例2所述方法應(yīng)用real-time PCR檢測各組瘤內(nèi)miR_181a的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:與對照組比，miR-18Ia組瘤內(nèi)miR-18Ia表達(dá)水平明顯升高(P〈0.05)，說明瘤體內(nèi)注射miR-181a agmir誘導(dǎo)瘤組織miR_181a高表達(dá)后可增加MX抗腫瘤作用(見圖5C)。實施例9:miR-181a靶向抑制BCRP在乳腺癌裸鼠移植瘤的表達(dá)；應(yīng)用實施例2所述方法進(jìn)行real-time PCR檢測(反轉(zhuǎn)錄條件:預(yù)變性95°C, 5min ；95°C, 30s ；60°C,45s ;72°C，20s，8 循環(huán)。Real-time PCR 條件:95°C,30s ；56°C,45s ；72°C,20s, 35循環(huán)；95°C,lmin ；55°C,30s ;95°C，30s。)實施例8中各組乳腺癌移植瘤內(nèi)MRP、PGP、LRP、BCRP四種耐藥蛋白mRNA表達(dá)。結(jié)果本發(fā)明發(fā)現(xiàn):與對照組比，miR-181a組瘤內(nèi)BCRPmRNA表達(dá)水平明顯降低(P〈0. 05)，與實施例5中體外實驗結(jié)果具有一致性(見圖6A)。蛋白免疫印跡結(jié)果也顯示BCRP蛋白表達(dá)明顯下降(見圖6B和6C，P〈0.05)，而另外三種蛋白表達(dá)水平無明顯改變。這些發(fā)明表明了在體環(huán)境下，miR-18Ia仍可抑制MCF7/MX細(xì)胞BCRP表達(dá)，增加對MX的敏感性。
實施例10:抑制miR_181a上調(diào)了乳腺癌藥物敏感細(xì)胞MCF-7的BCRP表達(dá)；為了檢測抑制miR_181a是否可上調(diào)BCRP表達(dá)而增加乳腺癌細(xì)胞對MX的耐藥性，進(jìn)一步在BCRP低表達(dá)的敏感細(xì)胞MCF-7中轉(zhuǎn)染miR_181a inhibitor,構(gòu)建miR_181a低表達(dá)的細(xì)胞模型。其轉(zhuǎn)染具體步驟為:將乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7在六孔板(3X105個/孔)或IOOmm培養(yǎng)皿(2X IO6個)中培養(yǎng)24小時后，用不含抗生素的無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)I小時，之后按lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟分別轉(zhuǎn)染miR_181a inhibitor(Ribobio)及其陰性對照質(zhì)粒(Inhibitor-NC)，終濃度為20nmol/l。4小時后，用新鮮的含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，備用。首先應(yīng)用實施例2所述Real-time PCR檢測miR_181a的表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miR-18Ia表達(dá)明顯下降，表達(dá)減少約80% (見圖7A，P〈0.05)，表明miR-18Ia沉默細(xì)胞模型構(gòu)建成功。進(jìn)一步應(yīng)用Real-time PCR檢測各組細(xì)胞內(nèi)MRP、PGP、LRP、BCRP四種耐藥蛋白mRNA表達(dá),結(jié)果本發(fā)明發(fā)現(xiàn):與對照組比，miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞BCRPmRNA表達(dá)明顯增加20% (P〈0.05)，其他三種蛋白mRNA無明顯變化(見圖7B)。Western Blotting檢測結(jié)果也顯示:與對照組比，miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞BCRP蛋白表達(dá)增加15%(P〈0.05)，其他三種蛋·白表達(dá)水平無明顯改變(見圖7C及圖7D)。實施例11:抑制miR_181a增強(qiáng)了乳腺癌藥物敏感細(xì)胞MCF-7中BCRP的轉(zhuǎn)運功能，降低細(xì)胞內(nèi)MX的含量；按實施例10所述轉(zhuǎn)染方法在六孔板中瞬時轉(zhuǎn)染后的MCF-7各組細(xì)胞，分別設(shè)置空白組1，空白組2，陰性對照組，miR-181a inhibitor組，其中后三組加入3 y M的MX，I小時后用冷的PBS洗，添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，1.5小時后收獲細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，檢測細(xì)胞對藥物的外排作用。結(jié)果本發(fā)明發(fā)現(xiàn):與對照組比，miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)MX含量明顯下降(見圖8A及圖8B，P〈0.05)。證實了抑制miR-181a可增強(qiáng)乳腺癌藥物敏感細(xì)胞MCF-7中BCRP的轉(zhuǎn)運功能，即藥物外排能力增加，降低細(xì)胞內(nèi)MX的含量。實施例12:抑制miR_181a增加了藥物敏感細(xì)胞MCF-7對MX的耐藥性；各組MCF-7細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染48h后，分別給予濃度為0,0.01,0.03,0.1,0.3、1、3、10、30iiM 的 MX 及 0、l、3、10、30、100、300、1000、3000iiM 的依托泊苷培養(yǎng) 48h 后，觀察細(xì)胞對藥物耐藥性的變化。結(jié)果本發(fā)明發(fā)現(xiàn):與對照組比(IC50=0.56±0.05iiM)，miR-181ainhibitor轉(zhuǎn)染組(IC50=2.04±0.08 y M)細(xì)胞對MX的耐藥性明顯增加(見圖8C，P〈0.05)，而對依托泊苷的耐藥性無明顯改變(見圖8D)。綜上結(jié)果證實了抑制miR-181a上調(diào)了藥物敏感細(xì)胞MCF-7的BCRP表達(dá)和與藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對MX的耐藥性。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法，所述方法包括: (1)利用miR-181a模擬物miR_181amimic抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中的BCRP表達(dá)與藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對BCRP轉(zhuǎn)運底物鹽酸米托蒽醌(MX)的敏感性； (2)利用miR-181a模擬物miR_181aagmir脂質(zhì)體靶向抑制MCF-7/MX誘導(dǎo)的乳腺癌裸鼠移植瘤內(nèi)BCRP的表達(dá)，增加在體瘤細(xì)胞對MX的藥物敏感性； (3)利用miR-181a抑制劑miR-181ainhibitor上調(diào)藥物敏感細(xì)胞MCF-7的BCRP表達(dá)和藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對MX的耐藥性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法，其特征在于，所述步驟(I)中miR_181a模擬物miR_181a mimic為包含miR_181a核酸序列“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，主要序列如下:5’ - AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU -3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法，其特征在于所述步驟(I)中所述腫瘤細(xì)胞為乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX為過表達(dá)BCRP乳腺癌細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法，其特征在于所述步驟(3)中使用的細(xì)胞為乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7為miR-181a過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng) 用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法，其特征在于所述步驟(I)中miR-181a模擬物miR-181a mimic轉(zhuǎn)染入乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中的終濃度范圍為:10 nM-80 nM，轉(zhuǎn)染時間為48小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法，其特征在于所述步驟(2)中利用miR-181a模擬物miR_181a agmir脂質(zhì)體作用于MCF-7/MX誘導(dǎo)的乳腺癌裸鼠移植瘤時，采用的注射方法為裸鼠瘤周及瘤內(nèi)多點注射，脂質(zhì)體注射量為lnmol，注射次數(shù)為每星期注射兩次，共計注射五次。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療腫瘤藥物領(lǐng)域，特別涉及一種miR-181a在逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥中的應(yīng)用。該方法包括(1)利用miR-181a的模擬物miR-181amimic，抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX中的BCRP表達(dá)與藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對BCRP轉(zhuǎn)運底物鹽酸米托蒽醌MX的敏感性；(2)利用miR-181a的模擬物miR-181aagmir脂質(zhì)體，靶向抑制MCF-7/MX誘導(dǎo)的乳腺癌裸鼠移植瘤內(nèi)BCRP的表達(dá)，增加在體瘤細(xì)胞對MX的藥物敏感性；(3)利用miR-181a的抑制劑miR-181ainhibitor上調(diào)藥物敏感細(xì)胞MCF-7的BCRP表達(dá)和藥物轉(zhuǎn)運功能，增加對MX的耐藥性。本發(fā)明的目的在于應(yīng)用miR-181a逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥的問題。
文檔編號A61P15/14GK103083685SQ20131004973
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者魏敏杰, 趙琳, 焦旭陽, 何苗, 吳慧哲, 任婕, 唐宏濤, 趙鵬飛 申請人:魏敏杰