專利名稱：用于治療微生物病癥的組合物和方法
技術領域：
—般而言，本發(fā)明涉及通過調控宿主免疫應答來治療微生物病癥。
背景技術：
微生物病原體感染構成全世界的一項主要死因，而且繼續(xù)構成全球健康的嚴重威脅(WHO, The World Health Report (2004))。例如，粘附和抹消(attaching andeffacing, A/E)細菌病原體諸如腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸致病性大腸桿菌(EPEC)在引起腹瀉、發(fā)病和死亡的細菌之中，尤其是在發(fā)展中世界的嬰兒和兒童中(2)。大腸桿菌0157:H7 (—種EHEC菌株)去年在美國引起許多人住院和3例死亡(MMWR Morb MortalWkly R印55，1045 (S印29，2006))。還認為工業(yè)化國家所有腹瀉后溶血尿毒綜合征(HUS)病例中超過90%是由大腸桿菌0157:H7感染引起的(R.L.Siegler, Pediatr Clin NorthAm42, 1505 (Dec, 1995))。其它EPEC菌株諸如大腸桿菌055:H7也在全世界的嬰兒中引起腸病(T.S.Whittam 等，Infect Immun61, 1619 (May, 1993))。我們關于宿主如何控制 A/E 病原體感染的許多知識來自對哨齒類朽1檬酸桿菌(Citrobacter rodentium)(小鼠中的一種天然病原體)感染的研究(L.Eckmann, Ann NYAcad Sci 1072，28 (Augustl, 2006))。與人類中EHEC或EHPC的發(fā)病機制相似，嚙齒類檸檬酸桿菌對鼠結腸上皮細胞的緊密粘附導致刷狀緣微絨毛的抹消(稱作附著和抹消(A/E)損害)及結腸增生(D.B.Schauer, S.Falkow, InfectTmmun 61, 2486 (Jun, 1993))。
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腸上皮和免疫細胞都在宿主針對A/E病原體的防御中發(fā)揮至關重要的作用。腸上皮細胞的緊密連接構成阻止微生物離開腸腔的第一道屏障(T.T.MacDonald，G.Monteleone, Science 307，1920 (March25，2005))。另外，上皮細胞分泌抗微生物肽來控制胃腸(GI)道中的病原體(A.Takahashi 等，FEBSLett 508，484(Nov23, 2001))。用嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間的免疫缺陷小鼠品系進行的研究確立了 CD4+T細胞、B細胞、和抗嚙齒類檸檬酸桿菌特異性抗體應答都是抑制和根除感染的適應性免疫的關鍵成分(L.Bry, M.B.Brenner, J Immunol 172，433 (January 1，2004))。感染期間由淋巴細胞生成的許多細胞因子能增強上皮細胞的先天免疫應答。然而，仍然不清楚這些細胞因子在A/E病原體感染期間的具體功能。IL-22 (一種IL-10家族細胞因子)是由淋巴細胞(特別是Thl7細胞)生成的(Y.Zheng 等，Nature445, 648 (Feb 8，2007))。Thl7 細胞屬于最近發(fā)現的、也生成 IL-17 的 CD4+T輔助細胞子集。IL-17在控制細胞外細菌感染中具有重要功能(K.1.Happel等，J.Exp.Med.202，761 (Septemberl9, 2005))。然而，仍然不太知道IL-22在宿主防御中的作用。腫瘤壞死因子(TNF)相關蛋白在本領域被認定為具有多種活性(范圍自宿主防御至對凋亡的免疫調節(jié))的蛋白質大家族。TNF最初被鑒定為在體外對數種轉化細胞系有細胞毒性且在體內引起某些腫瘤壞死的血清衍生因子。在該超家族中鑒定到一種相似的因子，并稱作淋巴毒素("LT")。由于二十世紀八十年代早期在TNF和LT之間觀察到的相似性，有人提出將TNF和LT分別稱作TNF- a和TNF- ^。如此，科學文獻提到這兩種命名。如本申請中所使用的，術語“TNF”指TNF-a。稍后的研究揭示了淋巴毒素的兩種形式，稱作LT a和LT 3。US2005-0129614記載了基于結構和生物學相似性的TNF配體超家族的另一種多肽成員，其被稱作TL-5。TNF蛋白質家族的成員以膜結合的形式(其經由細胞-細胞接觸局部地起作用)或作為分泌蛋白存在。一個TNF相關受體家族與這些蛋白質起反應，并觸發(fā)多種信號傳導途徑，包括細胞死亡或凋亡、細胞增殖、組織分化、和促炎癥應答。TNF-a自己涉及炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒、細菌、和寄生物感染、惡性腫瘤、和/或神經變性性疾病，而且是諸如RA和克羅恩氏病等疾病中特定生物學療法的有用靶物。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于通過調控宿主免疫應答來治療微生物病癥的組合物和方法。例如，可以通過提高或降低一種或多種介導抗微生物免疫應答的抗微生物多肽(AMP)的活性來增強或抑制宿主中的抗微生物免疫應答。更具體地說，本發(fā)明提供AMP、其調控劑、及使用此類組合物來治療微生物感染的方法。所述微生物病癥包括但不限于傳染病例如由EHEC和EPEC引起的腹瀉、炎性腸病(IBD)和更具體的潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)。本發(fā)明的AMP是介導抗微生物免疫應答的多肽，而且包括但不限于LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23 (包括例如IL_23pl9或IL_23p40)、和由Reg超家族的基因編碼的Reg或Reg相關蛋白質。Reg超家族包括來自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相關基因，而且分成四個亞類，即I型、II型、III型、和IV型。例如，I型包括人REGI a、人REGIP、大鼠Regl、和小鼠RegI ;II型包括小鼠RegII ;III型包括人REG II1、人HIP/PAP(在肝細胞癌-腸-胰中表達的基因/編碼胰腺炎相關蛋白的基因)、大鼠PAP/肽23、大鼠RegI II/PAPI1、大鼠PAPII1、小鼠RegIII a、RegIII ^、RegIII y、小鼠RegIII 8、和倉鼠INGAP (胰島新生相關蛋白)。IV型含有人REG IV。在一個方面，所述REG蛋白質由人REG基因家族的成員編碼，包括但不限于 REG I a、REG I 旦、HIP/PAP、REG II1、REG IV、和 Reg 相關序列(RS)。在一些方面，本發(fā)明AMP的氨基酸序列包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQID NO: 52、SEQ ID NO: 54、和 SEQ ID NO: 56。在其它方面，編碼本發(fā)明AMP的核酸序列包含選自下組的核酸序列:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13,SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID N0:3USEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:49,SEQID NO: 51、SEQ ID NO: 53、和 SEQ ID NO: 55。本發(fā)明AMP的活性可以相對于另一種AMP或同一種AMP的活性提高或降低和/或差異調節(jié)。本發(fā)明AMP的活性的例子包括但不限于AMP表達、結合至結合配偶、信號轉導、抗微生物活性、或其其它生物學或免疫學活性。在一個方面，一種或多種本發(fā)明AMP的活性的升高導致受試者中增強的抗微生物免疫應答。在一個方面，本發(fā)明的AMP包括但不限于與IL-22直接或間接相互作用的多肽，例如位于介導宿主對微生物病原體(例如細菌或病毒)感染的抵抗力的IL-22信號轉導途徑的上游或下游的多肽。此類AMP的例子包括但不限于LT、IL-6、IL-18、和IL-23 (包括例如IL-23pl9 或 IL-23p40)。本發(fā)明的調控劑包括但不限于直接或間接調控AMP活性的多肽和核酸分子(例如DNA分子或RNA分子)。所述調控的例子包括但不限于本發(fā)明AMP活性的升高、降低、誘導或活化、抑制、或調節(jié)(例如上調或下調)。在一個方面，所述調控劑通過降低或抑制IL-22結合蛋白(BP)活性并由此提高IL-22活性來間接調控IL-22活性。在一個具體的方面，所述調控劑降低或抑制IL-22BP結合IL-22并由此提高IL-22活性。在一些方面，所述調控劑是多肽，例如結合AMP或以其它方式與AMP相互作用以提高、誘導、或調節(jié)AMP活性的多肽。在一個方面，所述調控劑是調控AMP活性的融合多肽。

在一個方面，所述調控劑是結合AMP的抗體。在一個具體的方面，所述抗體是單克隆抗體。在另一個方面，所述抗體是選自Fab、Fab’_SH、Fv、scFv、或(Fab’)2片段的抗體片段。在另一個方面，所述抗體是融合多肽(例如Fe融合多肽)。在另一個方面，所述抗體是嵌合抗體。在一個具體的方面，所述抗體是人源化的。在另一個方面，所述抗體是人抗體。在另一個方面，所述抗體與選自人、非人靈長類、或其它哺乳動物(例如豬、綿羊、家兔、土撥鼠、大鼠、或小鼠)的抗體結合相同表位。在一個具體的方面，所述抗體是AMP激動劑。在另一個具體的方面，所述調控劑是重組AMP或編碼AMP的核酸分子(例如DNA或RNA分子)。本發(fā)明進一步提供通過調控抗微生物免疫應答來治療微生物病癥的方法。在一個方面，本發(fā)明提供治療受試者中的微生物病癥的方法，包括對所述受試者施用有效量的包含AMP或AMP調控劑的藥物組合物，其中所述AMP選自下組:LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REG I a ,REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV 和 Reg 相關序列(RS)。在一個方面，所述病癥是傳染病例如由EHEC或EPEC引起的腹瀉、炎性腸病(IBD)或更具體的潰瘍性結腸炎(UC)或克羅恩氏病(⑶)。在具體的方面，本發(fā)明提供通過刺激或抑制由AMP介導的信號傳導途徑和/或Thtt_17細胞功能來調控抗微生物免疫應答的方法。所述方法對于治療微生物病癥是有用的。例如，在一個方面，本發(fā)明提供通過刺激由AMP介導的信號傳導途徑例如由IL-22和/或IL-23介導的信號傳導途徑來增強抗微生物免疫應答的方法。在另一個方面，本發(fā)明提供通過刺激或抑制由細胞因子介導的信號傳導途徑來調控抗微生物免疫應答的方法。例如，在一個方面，本發(fā)明提供通過刺激由細胞因子介導的信號傳導途徑例如IL-22和/或IL-23信號傳導途徑來增強抗微生物免疫應答的方法。此外，本發(fā)明提供通過刺激或抑制Th&17細胞功能來調控抗微生物免疫應答的方法。在一個方面，本發(fā)明提供刺激生物學系統(tǒng)中由AMP介導的信號傳導途徑的方法，該方法包括給所述生物學系統(tǒng)提供AMP激動劑。所述生物學系統(tǒng)的例子包括但不限于體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的或生物體體內的哺乳動物細胞。在另一個方面，本發(fā)明提供抑制生物學系統(tǒng)中由AMP介導的信號傳導途徑的方法，該方法包括給所述生物學系統(tǒng)提供AMP拮抗劑。在一個具體的方面，本發(fā)明提供通過刺激生物學系統(tǒng)中由IL-23和/或IL-22介導的信號傳導途徑來增強生物學系統(tǒng)中的抗微生物免疫應答的方法，該方法包括給所述生物學系統(tǒng)提供IL-22或IL-22激動劑。在一個方面，所述IL-22激動劑是IL-22。在另一個方面，所述IL-22激動劑是結合IL-22的抗體。在另一個方面，提供抑制生物學系統(tǒng)中由IL-23介導的信號傳導途徑的方法，該方法包括給所述生物學系統(tǒng)提供IL-22拮抗劑。在一個方面，所述IL-22拮抗劑是抗體，例如中和性抗IL-22抗體和/或中和性抗IL-22R抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供刺激Th^7細胞功能的方法，該方法包括將Th^7細胞暴露于AMP的激動劑，其中所述AMP介導由IL-23介導的信號傳導途徑(例如IL_23、IL_6、或IL-22)。所述方法對于治療微生物病癥是有用的。在一個方面，IL-22激動劑是IL-22。在另一個方面，所述IL-22激動劑是結合IL-22的抗體。在另一個方面，提供抑制Th^7細胞功能的方法，該方法包括將Th^7細胞暴露于AMP的拮抗劑，其中所述AMP介導由IL-23介導的信號傳導途徑(例如IL-23、IL-6、或IL-22)。在一個方面，所述拮抗劑是抗IL-22抗體，例如中和性抗IL-22抗體。例示性的Thiw7細胞功能包括但不限于刺激由細胞介導的免疫(遲發(fā)型超敏感性)；募集先天免疫細胞，諸如髓樣細胞(例如單核細胞和嗜中性粒細胞)至炎癥部位；和刺激炎癥細胞浸潤入組織中。在一個方面，Th^7細胞功能是由IL-23和/或IL-22介導的。在又一個方面，本發(fā)明提供治療受試者中的微生物病原體(例如細菌或病毒)感染的方法,包括對所述受試者施用有效量的包含AMP或AMP調控劑的藥物組合物,其中所述八1^選自下組丄1\比-6、11-18、11-22、11-23、1 6 I a ,REG I ^ ,HIP/PAP,REG III,REG IV和Reg相關序列(RS)。 在另一個方面，本發(fā)明提供治療受試者中的微生物病癥的方法，包括使所述受試者的細胞接觸編碼AMP或AMP調控劑的核酸分子(例如DNA或RNA分子)，其中所述AMP選自下組:LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REGI a、REG I ^ ,HIP/PAP,REG III,REG IV 和 Reg相關序列(RS)。在一個方面，所述病癥是傳染病例如由EHEC或EPEC引起的腹瀉、炎性腸病(IBD)或更具體的潰瘍性結腸炎(UC)或克羅恩氏病(CD)。在另一個方面，本發(fā)明提供調控受到微生物病原體(例如細菌或病毒)感染的受試者的細胞中AMP的活性的方法，包括使所述細胞接觸編碼AMP或AMP調控劑的核酸分子(例如 DNA 或 RNA 分子)，其中所述 AMP 選自下組:LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REG I a、REGI ^ ,HIP/PAP, REG III (例如 REG III ^ 或 REGIII Y )、REG IV、和 Reg 相關序列(RS)。微生物病原體的例子包括但不限于細菌或病毒。在一個方面，所述微生物病原體是細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌。在一個具體的方面，所述細菌是革蘭氏陰性細菌。在另一個方面，所述細菌是粘附或抹消(A/E)細菌，而且更具體地是腸出血性大腸桿菌(EHEC)或腸致病性大腸桿菌(EPEC)。在一個方面，所述細菌是腸致病性大腸桿菌(EHEC)，是大腸桿菌0157:H7或大腸桿菌055:H7。在另一個方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明AMP或其調控劑的多核苷酸。在另一個方面，本發(fā)明提供包含所述多核苷酸的載體。在另一個方面，本發(fā)明提供包含所述載體的宿主細胞。在一個方面，所述宿主細胞是真核細胞。在另一個方面，所述宿主細胞是CHO細胞、酵母細胞、或細菌細胞(例如大腸桿菌)。在一個方面，本發(fā)明提供制備結合本發(fā)明AMP的抗體的方法，其中該方法包括在適合于編碼所述抗體的多核苷酸表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞，并分離所述抗體。在一個具體的方面，本發(fā)明提供制備作為本發(fā)明AMP激動劑的抗體的方法。在一個方面，本發(fā)明提供檢測生物學樣品中AMP的存在的方法，包括在容許下述抗體結合AMP的條件下使所述生物學樣品接觸AMP的抗體，并檢測是否形成所述抗體和AMP之間的復合物。在另一個方面，本發(fā)明提供包含一種或多種本發(fā)明AMP和/或其調控劑的試劑盒。在另一個方面，本發(fā)明提供包含一種或多種藥物組合物的試劑盒，所述藥物組合物每一種包含本發(fā)明的AMP或其調控劑。本發(fā)明涉及下述各項。1.一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)，其中所述AMP是IL-22。2.一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體感染的方法，包括對所述 受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)或其調控劑，其中所述 AMP 選自下組:IL-6、IL-18、IL-23、REG Ia、REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV,Reg相關序列(RS)和LT。3.一種調控受到微生物病原體感染的受試者的細胞中抗微生物多肽(AMP)的活性的方法，包括使所述細胞接觸分離的AMP，其中所述AMP是IL-22。4.一種調控受到微生物病原體感染的受試者的細胞中抗微生物多肽(AMP)的活性的方法，包括使所述細胞接觸分離的AMP，其中所述AMP選自下組:IL-6、IL-18、IL-23、REG1 a , REG 1 β、HIP/PAP、REG II1、REG IV、Reg 相關序歹lj (RS)和 LT。5.項I的方法，其中所述感染是微生物病癥。6.項5的方法，其中所述微生物病癥是炎性腸病(IBD)。7.項5的方法，其中所述微生物病癥是克羅恩氏或潰瘍性結腸炎(UC)。8.項I的方法，其中所述微生物病原體是細菌。9.項8的方法，其中所述細菌是革蘭氏陰性的。10.項8的方法，其中所述細菌是革蘭氏陽性的。11.項8的方法，其中所述細菌是粘附或抹消(A/E)細菌。12.項11的方法，其中所述粘附或抹消(A/E)細菌是腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸致病性大腸桿菌(EPEC)。13.項12的方法，其中所述腸致病性大腸桿菌(EHEC)是大腸桿菌0157: H7或大腸桿菌 055:H7。14.項2的方法，其中所述抗微生物多肽(AMP)是RegIII β和RegIII Y。15.項I的方法，其中所述微生物病原體是病毒。16.一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)調控劑，其中所述AMP調控劑是IL-22激動劑。17.項16的方法，其中所述激動劑提高所述IL-22的表達和/或活性。18.項16的方法，其中所述激動劑是多肽或核酸分子。19.項16的方法，其中所述激動劑是融合多肽。20.項16的方法，其中所述激動劑是Fe融合多肽。21.項16的方法，其中所述激動劑是抗體或其生物學活性片段。22.項16的方法，其中所述激動劑是單克隆抗體。23.項16的方法，其中所述激動劑是人源化抗體。24.項I或3的方法，其中所述IL-22的氨基酸序列包含SEQ ID N0:8所示序列。25.項2或4的方法，其中所述AMP的氨基酸序列包含選自下組氨基酸序列的序列:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26、SEQ ID N0:50、和 SEQ ID N0:52。26.項I或3的方法，其中編碼所述IL-22的核酸序列是SEQ ID NO:7所示序列。27.項I或3的方法， 其中編碼所述AMP的核酸序列包含選自下組核酸序列的序列:SEQ ID N0:USEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 19,SEQ ID N0:2USEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25、SEQ ID N0:49、和 SEQ ID N0:51。28.一種試劑盒，其包括用于治療微生物病癥的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含抗微生物多肽(AMP)，其中所述AMP是IL-22。29.一種試劑盒，其包括一種或多種用于治療微生物病癥的藥物組合物，其中所述藥物組合物每一種包含不同的抗微生物多肽(AMP)或其調控劑，且其中所述AMP選自下組:IL-6、IL-18、IL-23、REG I a、REG I P、HIP/PAP、REG II1、REG IV、Reg 相關序列(RS)、和LT0附圖簡述

圖1(A-H)描繪的數據展示了針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的宿主防御。圖1(A)描繪了未感染野生型小鼠GI道中IL-22受體亞基的實時RT-PCR分析的結果；圖1 (B-F)描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染后野生型小鼠結腸中各種細胞因子表達的實時RT-PCR分析；圖1(G)描繪了 C57Bl/6(n=5)11^-6+(11=5)小鼠在嚙齒類檸檬酸桿菌感染后的存活；而圖1 )描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染后C57B1/6UL-23P40+、和IL-6+小鼠結腸中IL-22和IL-17表達的時間過程實時RT-PCR分析。對于嚙齒類檸檬酸桿菌感染，小鼠口服接種2xl09CFU細菌。所有上述數據是兩項獨立實驗的代表。圖2(A-F)描繪的數據展示了 IL-22缺陷使得小鼠對嚙齒類檸檬酸桿菌感染易感。6-7 周齡 IL-22+ (圖 2 (A-C) )、IL-17RC+(D)、IL-20R3 + 小鼠(圖 2 (F))或野生型小鼠(圖2 (A-C, E) ) 口服接種2x109CFU嚙齒類檸檬酸桿菌并在指定時間點稱重。來自接種后8天IL-22+和野生型小鼠的結腸的組織學分析，使用蘇木精和曙紅(H&E)染色(圖2(B和C))。箭指示粘膜下發(fā)炎(圖2 (B))和細菌侵入粘液腺中(圖2 (C))。顯示了代表性數據(圖2(B)的棒=IOOiim而圖2(C)的棒=25iim)。野生型C57B1/6小鼠自第0天或接種后第8天開始隔天腹膜內接受150 ii g抗IL-22單抗或同種型對照IgGl單抗(圖2 (E) )。*p〈0.05，**p〈0.01, ***p〈0.0Olo所有數據是兩項獨立實驗的代表。圖3(A-G)描繪的數據展示了嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間小鼠中IL-22缺陷的影響。C57B1/6小鼠(圖3(A、B、和F))、IL_22V_和野生型小鼠(圖3 (C-EjPG)) 口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。小鼠還自嚙齒類檸檬酸桿菌接種的同一天開始隔天腹膜內接受150 ii g抗IL-22單抗或同種型對照IgGl單抗(圖3(A和B))。在第10天，對結腸照相，并測量各結腸長度(圖3(A))。使用蘇木精和曙紅(H&E)染色對結腸實施組織學分析(圖3(B))。使用H&E染色對來自受感染IL-22+和野生型小鼠的結腸和肝(第8天)實施組織學分析(圖3(C和E))。圖3(C)中的箭指示結腸透壁性炎癥和潰瘍形成。圖3(E)描繪了 IL-22+小鼠中的肝膿毒性微膿瘍。圖3(C)顯示了代表性數據，其中上部小圖的棒=500 iim，而下部小圖的棒=IOOii m。在3 (E)中，棒=25iim。圖3 (D)描繪了結腸、肝、脾、和腸系膜淋巴結中的嚙齒類檸檬酸桿菌的log1(lCFU。圖3(F-G)描繪了通過ELISA獲得的血清抗嚙齒類檸檬酸桿菌IgG水平。*p〈0.05。所有上述數據是兩項獨立實驗的代表。圖4 (A-C)描繪的數據展示了 IL-22在嚙齒類檸檬酸桿菌感染后誘導抗微生物RegIII家族蛋白質表達。將C57B1/6小鼠結腸的體外培養(yǎng)物用10 u gIL-22處理24小時，分離RNA，并用于微陣列分 析(圖4 (A))和實時RT-PCR分析(圖4 (B))。在圖4 (C)中，IL-22+小鼠和野生型同窩小鼠口服接種2x109CFU嚙齒類檸檬酸桿菌，并對自指定時間點收集的各小鼠結腸分離的RNA實施實時RT-PCR。所有數據是兩項獨立實驗的代表。圖5 (A-C)描繪的數據展示了鼠IL-17RC基因的靶向破壞。圖5 (A)描繪了用于生成IL-17RC敲除小鼠的策略。將涵蓋IL-17RC編碼序列的外顯子1-5 (空心框)用新霉素抗性盒置換。圖5(B)描繪了使用指定引物集(PU P2和P3)對來自野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的后代的基因分型。生成來自WT和KO小鼠的尾尖成纖維細胞，在體外用各種濃度的IL-17A和IL-17F刺激24小時，并收集培養(yǎng)物上清液，用于IL-6ELISA (圖5(C))。圖6描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染后野生型小鼠結腸中IL-19、IL_20和IL-24表達隨時間的實時RT-PCR分析的數據。C57B1/6小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。在指定時間點收集結腸，并將分離的RNA用于實時RT-PCR分析。圖7描繪的數據展示了 GI道中的IL-20Ra和IL-2OR0表達。未感染野生型小鼠GI道中IL-19、IL-20和IL-24的受體亞基的實時RT-PCR分析。圖8 (A-C)描繪的數據展示了鼠IL-20RP基因的靶向破壞。圖8 (A)描繪了用于生成IL-20RP敲除小鼠的策略。將外顯子I (空心框)用新霉素抗性盒置換。圖8(B)描繪了使用指定引物集(pl、p2和p3)對來自野生型(WT)、雜合(HET)和敲除(KO)小鼠的后代的表型分型。圖8(011'和1(0小鼠耳部皮內注射含5001^重組11-20的20111 PBS或單獨的20iU PBS。24小時后，收集小鼠耳，用于分離RNA。將分離的RNA用于對已知在IL-20信號傳導后上調的基因的實時RT-PCR分析。圖9描繪了來自接種嚙齒類檸檬酸桿菌、用抗IL-22單抗處理的野生型小鼠的小鼠結腸的組織學分析的數據。C57B1/6小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。小鼠還自接種嚙齒類檸檬酸桿菌的同一天開始隔天腹膜內接受150y g抗IL-22單抗或同種型對照IgGl單抗。在第10天，使用蘇木精和曙紅(H&E)染色對結腸實施例行組織學分析。箭指示粘膜潰瘍形成及透壁性炎癥。顯示了代表性圖像，上部小圖的棒=500 ym，而下部小圖的棒=250 u m。
圖10 (A-B)描繪的數據展示了嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間IL-22+小鼠和野生型同窩小鼠中的血清Ig水平。IL-22+和野生型同窩小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。在指定時間點，收集小鼠血液。通過ELISA測定總血清IgM和IgG (圖10 (A))及血清抗嚙齒類檸檬酸桿菌IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3 (圖10(B))的水平。所有數據是兩項獨立實驗的代表。圖11描繪的數據展示了嚙齒類檸檬酸桿菌感染后C57B1/6、IL-23P19+、和IL-6+小鼠結腸中IL-22 (圖11左邊小圖)和IL-17 (圖11右邊小圖)表達的離體結腸培養(yǎng)物ELISA。對于嚙齒類檸檬酸桿菌感染，小鼠口服接種2xl09CFU細菌。所有數據是至少兩項獨立實驗的代表。圖12(A-B)描繪了分離的小鼠IEL、LPMC和結腸上皮細胞上的IL-22R表達的FACS分析(圖12 (A))，及原代人結腸上皮細胞上的IL-22R表達的FACS分析(圖12(B))。所有數據是至少兩項獨立實驗的代表。圖13 (A_C、E)和圖13D描繪的數據展示了由樹突細胞(DC)生成的IL-22對于針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的先天性免疫應答是至關重要的。在圖13(A)中，Rag2+和野生型Balb/c小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。在圖13(B和C)中，小鼠還自接種細菌的同一天開始隔天腹膜內接受150 μ g同種型對照IgGl單抗或抗IL-22單抗,并在指定時間點稱重。圖13(B)描繪了時間過程實時RT-PCR分析，而圖13(C)描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染后野生型Balb/c和RagZ+小鼠的結腸中的IL-22和IL-17表達的離體結腸培養(yǎng)物ELISA。圖13D描繪了來自受到嚙齒類檸檬酸桿菌感染的Rag2+小鼠的第4天結腸中的IL-22、⑶11c、和DAPI免疫組織化學染色。放大倍數:400x。圖13(E)描繪的數據證明了在體外IL-23直接誘導分離的鼠⑶Ilc+DC生成IL-22，通過ELISA測量。所有數據是兩項獨立實驗的代表。圖14 (A-E)描繪的數據展示了 IL-22能`在人結腸細胞系中誘導STAT3活化。在圖14(A)中，IL-22+小鼠和野生型同窩小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。一組IL-22V_小鼠還接受mRegllI Y-1g融合蛋白。在指定時間點對動物稱重并監(jiān)測。*p〈0.05，**ρ〈0.01。在圖14(B)中，IL-23直接誘導分離的人DC生成IL-22，通過ELISA測量。圖14(C)描繪了通過FACS獲得的人結腸細胞系上的IL-22R表達。圖14(D)描繪的Western印跡顯示了 IL-22能在人結腸細胞系中誘導STAT3活化。圖14(E)描繪了用IL-22處理的人結腸上皮細胞系中RegIIlP和RegIII Y表達的實時RT-PCR分析。所有數據是兩項獨立實驗的代表。圖15A-15B描繪了用于免疫組織化學的抗IL-22單抗的表征。圖15A描繪了來自第4天的受到嚙齒類檸檬酸桿菌感染的IL-22+和野生型小鼠或未受感染的野生型小鼠的結腸切片，用偶聯有Alexa555的抗IL-22單抗(8E11)或同種型對照染色。圖15B描繪了表達IL-22的293細胞的細胞團，用偶聯有Alexa555的抗IL-22單抗(8E11)或同種型對照染色。放大倍數為200x。圖16描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染后C57B1/6和IL-23P19+小鼠結腸中RegIII Y和RegIIIP表達的時間-過程分析。C57B1/6和IL-23P19+小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。在指定時間點，收集小鼠結腸，用于提取RNA和后續(xù)小鼠RegIII Y和RegIII β表達的實時RT-PCR分析。
圖17描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染后IL-22+和野生型小鼠結腸中其它Reg家族成員表達的時間-過程分析。IL-22+和野生型同窩小鼠口服接種2x109CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。在指定時間點，收集小鼠結腸，用于提取RNA和后續(xù)實時RT-PCR分析。圖18描繪的數據展示了重組人RegIII_融合蛋白能在嚙齒類檸檬酸桿菌感染后部分保護IL-22+。IL-22+小鼠和野生型同窩小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。一組IL-22+小鼠還接受人RegIII_-cFlag融合蛋白。在指定時間點對動物稱重并監(jiān)測。*p〈0.05。圖19A-19C描繪了 161種在來自IL-22處理的結腸中差異表達的基因。圖20描繪了 161種在來自IL-22處理的結腸中差異表達的基因的2D分級聚類，其中通過根據Pearson相關系數有最高聯系的矢量的迭代凝聚對選定基因聚類，凝聚矢量的數據通過平均聯系來匯總(where selected genes were clustered byiterative agglomeration of vectors most highly linked by Pearson correlationcoefficient, with data for agglomerated vectors summarized by average linkage)。圖21描繪的數據展示了 LTbRFc和抗IL-22單抗都在嚙齒類檸檬酸桿菌感染后導致死亡。圖22(A_E)描繪的數據展示了 IL-22生成所涉及的多個上游方面的LT途徑調節(jié)。圖23 (A-B)描繪的數據展示了 IL-22部分挽救在用LTbR處理的小鼠中看到的缺陷。圖24 (A-C)描繪的數據展示了抗IL-22單抗處理導致結腸濾泡減少、B/T組構受損、及結腸中DC、T細胞和B細胞數目減少。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于通過調控宿主免疫應答來治療微生物病癥的組合物和方法。本發(fā)明人發(fā)現了一種介導免疫應答和哺乳動物對傳染性微生物病原體的抵抗力的新細胞因子途徑。具體而言，本發(fā)明人發(fā)現了 IL-22是在粘附或抹消(A/E)細菌病原體感染早期期間連接適應性免疫應答和先天性上皮防御的關鍵細胞因子之一。如本文中所顯示的，在感染早期階段期間由免疫細胞生成的細胞因子諸如IL-22是腸上皮細胞引發(fā)完全抗微生物應答和傷口愈合應答以阻止病原性微生物系統(tǒng)性侵入宿主所必需的。本文中的研究顯示IL-22保護腸上皮屏障的完整性并阻止細菌侵入及系統(tǒng)性擴散。另外，本文中的研究指示IL-22涉及早期抗細菌IgG應答的引發(fā)，而且是在細菌感染期間自結腸上皮細胞誘導抗微生物凝集素諸如RegIIIP和RegIII Y不可缺少的。在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間的IL-22+小鼠中，這兩種機制之一或二者的缺失可促成宿主防御應答受損及系統(tǒng)性擴散和死亡升高。如本文中所顯示的，對RegIIIP和RegIII Y的誘導指示IL-22在控制各種細菌感染中可具有更寬的功能。本文中的研究進一步支持Thtt_17細胞及其效應器細胞因子在傳染性病癥和自身免疫性病癥中的作用。另外，本文中的研究指示IL-22及其下游產物諸如ReglIIP和RegIII Y對于治療傳染性病癥可以是有益的。
因此，本發(fā)明提供通過調控宿主免疫應答來治療此類微生物病癥的方法。例如，可以通過提高或降低一種或多種介導抗微生物免疫應答的抗微生物多肽(AMP)的活性來增強或抑制受試者中的抗微生物免疫應答。
更具體地說，本發(fā)明提供AMP、其調控劑、及使用此類組合物來治療微生物病癥的方法。所述微生物病癥包括但不限于傳染病例如由EHEC和EPEC引起的腹瀉、炎性腸病(IBD)和更具體的潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)。通過述及將本文中所引用的所有參考文獻包括專利、申請、和科學文獻完整收入本文。通用技術本文中所描述或提到的技術和規(guī)程一般得到本領域技術人員的充分理解，而且通常使用常規(guī)方法得以采用，諸如例如下列文獻中所記載的廣泛應用的方法:Sambrook 等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第 3 版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Current Protocols inMolecular Biology (F.M.Ausubel 等編，2003);叢書 Methods in Enzymology (AcademicPress, Inc.):PCR2:A Practical Approach (M.J.MacPherson，B.D.Hames 和 G.R.Taylor 編，1995)，Harlow 和 Lane 編(1988)Antibodies，A Laboratory Manual, andAnimal Cell Culture (R.1.Freshney 編，1987) ;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait 編，1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis 編，1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.1.Freshney 編，1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P.Mather 和 P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laborat·ory Procedures(A.Doyle, J.B.Griffiths 和 D.G.Newell 編，1993-8) J.Wiley and Sons; Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 編);Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells (J.M.Miller 和 M.P.Calos 編，1987) ;PCR:The PolymeraseChain Reaction, (Mullis 等編，1994) ;Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan 等編，1991);Short Protocols in Molecular Biology (Wiley andSons, 1999) ;Immunobiology(C.A.Janeway 和 P.Travers, 1997) ;Antibodies (P.F inch, 19 9 7) ;Antibodies:A Practical Approach(D.Catty 編，IRLPress, 1988-1989);Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P.Shepherd 和C.Dean編，Oxford University Press, 2000) ;Using Antibodies:A LaboratoryManual (E.Harlow 和 D.Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies(M.Zanetti 和 J.D.Capra 編，Harwood Academic Publishers,1995);及 Cancer!Principlesand Practice of Oncology (V.T.DeVita 等編，J.B.Lippincott Company, 1993) 01.定義為了解釋本說明書的目的，應用以下定義，而且在任何適宜的時候，以單數使用的術語也會包括復數，反之亦然。在下文所列任何定義與通過述及收入本文的任何文件抵觸的情況中，應當以下文所列定義為準?！翱刮⑸锒嚯摹被颉癆MP”指介導或以其它方式影響對微生物病原體的抗微生物免疫應答的多肽，而且涵蓋其保留AMP活性(例如抗微生物活性或調控抗微生物免疫應答的活性)的片段、變體、類似物、衍生物或模擬物。這些方法可用于治療感染了或有風險感染傳染性微生物病原體(例如病毒或細菌)的受試者。AMP的活性可以相對于另一種AMP或同一種AMP調控或差異調節(jié)(例如上調或下調)。
本發(fā)明的AMP涵蓋天然AMP及其變體形式(在本文中有進一步定義)，而且可以從多種來源分離，諸如人的組織或其它來源，或者可以通過重組或合成方法制備。天然AMP可以來自任何物種，例如鼠或人。本發(fā)明的AMP包括但不限于LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23(包括例如IL-23pl9或IL-23p40)、和由Reg超家族的基因編碼的Reg或Reg相關蛋白。Reg超家族包括來自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相關基因，而且分成四個亞類，即I型、II型、III型、和IV型。例如，I型包括人REGIa、人REGI β、大鼠Reg1、和小鼠RegI ;II型包括小鼠RegII ;III型包括人REG II1、人ΗΙΡ/ΡΑΡ (在肝細胞癌-腸-胰中表達的基因/編碼胰腺炎相關蛋白的基因)、大鼠PAP/肽23、大鼠RegIΙΙ/ΡΑΡΙΙ、大鼠PAP II1、小鼠RegIII a、RegIIIP、RegIII Y、小鼠RegIII δ、和倉鼠INGAP (胰島新生相關蛋白)。IV型含有人REG
IV。另外，人Reg相關序列(RS)據報告是假基因。在一個實施方案中，所述REG蛋白質由人REG基因家族的成員編碼，包括但不限于REG Ia、REG I β、HIP/PAP、REG III, REG IV、和Reg相關序列(RS) ο淋巴毒素(LT)是腫瘤壞死家族中的一種三聚體細胞因子；由活化的T、B、和NK細胞表達；且涉及炎癥應答信號傳導和次級淋巴樣器官體系結構?！傲馨投舅鼗颉癓T”在本文中定義為具有美國專利N0.5，824，509圖2A所示氨基酸序列的生物學活性多肽?！癓T”定義為明確排除人TNFa或其天然動物類似物(Pennica 等，Nature312:20/27:724-729 (1984)及 Aggarwal 等，J.Biol.Chem.260:2345-2354(1985))。如本文中所使用的，“LT”指一種或多種如本文中所描述的LT亞基?！傲馨投舅?α ”或“LTci ”定義為明確排除人LT β，例如US5，661，004中所定義的?！傲馨投舅卅?3三聚體”或“LTci3”指LTa單體的同三聚體。此同三聚體通過LTiK跨膜和胞質結構域錨定至細胞表面?！傲馨投舅?α β ”或“LTa β ”或“LT α β復合物”指LT a與LT β異三聚體。這些異三聚體含有兩個LT α亞基和一個LT β亞基(LT a 2 β I)或一個LT α亞基和兩個LT β亞基(LTa 1β2)。如本文中 所使用的，術語“LT α β ”或“LTab”指由一個LT α亞基和兩個LT β亞基構成的異三聚體(LT a I β 2)?！澳[瘤壞死因子受體-1”或“TNFRI”和“腫瘤壞死因子受體-1I”或“TNFRII”指LT a 3同三聚體的細胞表面TNF受體，分別也稱作p55和p75?！傲馨投舅?β受體”或“LT P-1TIgLTa β異三聚體所結合的受體。在一些實施方案中，本發(fā)明AMP的氨基酸序列包含選自下組的氨基酸序列:SEQID N0:2(人 IL-6)、SEQ ID NO:4(人 IL-12B)、SEQ ID NO:6 (人 IL-18)、SEQ ID N0:8(人IL-22)、SEQ ID NO: 10 (人IL_23pl9或 IL-23A)、SEQID NO: 12 (人REGIA)、SEQ ID N0:14(人REGIB)、SEQ ID NO: 16 (人 REG3A，變體 I)、SEQ ID NO: 18 (人 REG3A，變體 2)、SEQ IDN0:20(人REG3A，變體3)、SEQ ID NO: 22 (人 REG3G，變體 2)、SEQ ID NO: 24 (人 REG3G，變體I)、SEQ ID N0:26(人 REG4)、SEQ ID NO: 28 (鼠 IL-6)、SEQID NO: 30 (鼠 IL-12B)、SEQ IDN0:32(鼠 IL-18)、SEQ ID NO:34(鼠 IL—22)、SEQ ID NO:36(鼠 IL_23pl9 或 IL-23A)、SEQID N0:38(鼠 PAP)、SEQ ID N0:40(鼠 REG1)、SEQ ID N0:42(鼠 REG2)、SEQ ID N0:44(鼠REG3A)、SEQ IDN0:46(鼠 REG3D)、SEQ ID NO:48 (鼠 REG4)、SEQ ID NO:50 (人LT a )、SEQIDNO: 52(人 LTP )、SEQ ID N0:54(鼠 LT α)、和 SEQ ID N0:56(鼠 LT β )。
在其它實施方案中，編碼本發(fā)明AMP的核酸序列包含選自下組的核酸序列:SEQID N0:1(AIL-6)、SEQ ID NO:3 (人 IL-12B)、SEQ ID NO:5 (人 IL-18)、SEQ ID N0:7(人IL-22) ,SEQ ID N0:9(人 IL-23pl9 或 IL-23A)、SEQID NO: 11 (人 REGIA)、SEQ ID NO: 13 (AREGIB)、SEQ ID NO: 15 (人 REG3A，變體 I)、SEQ ID NO: 17 (人 REG3A，變體 2)、SEQ ID勵:19(人1 63六，變體3)、5￡0 ID NO: 21 (人 REG3G，變體 2)、SEQ ID NO: 23 (人 REG3G，變體I)、SEQ ID N0:25(人 REG4)、SEQ ID NO: 27 (鼠 IL-6)、SEQID NO: 29 (鼠 IL-12B)、SEQ IDNO:31(鼠 IL-18)、SEQ ID NO:33(鼠 IL—22)、SEQ ID NO:35(鼠 IL_23pl9 或 IL-23A)、SEQID NO:37(鼠 PAP)、SEQ ID NO: 39 (鼠 REG1)、SEQ ID NO: 41 (鼠 REG2)、SEQ ID NO:43(鼠REG3A)、SEQ IDNO:45 (鼠 REG3D)、SEQ ID NO:47 (鼠 REG4)、SEQ ID NO:49 (人LT a )、SEQIDNO: 51 (人 LTP )、SEQ ID NO: 53(鼠 LT a)、和 SEQ ID NO: 55(鼠 LT 3 )。“天然序列AMP多肽”或“天然序列AMP多肽”指與衍生自自然界的相應AMP多肽包含相同氨基酸序列的多肽。此類天然序列AMP多肽可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成手段生成。該術語明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的特定AMP多肽(例如缺少其相關信號肽的IL-22)、該多肽的天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體。在本發(fā)明的各種實施方案中，本文中所公開的天然序列AMP多肽是成熟的或全長的天然序列多肽。多肽“變體”指與全長天然多肽序列具有至少約80%氨基酸序列同一性的活性多肽。通常，多肽變體與全長的或成熟的天然多肽序列將具有至少約80%的氨基酸序列同一性、或者至少約81%的氨基酸序列同一性、或者至少約82%的氨基酸序列同一性、或者至少約83%的氨基酸序列同一性、或者至少約84%的氨基酸序列同一性、或者至少約85%的氨基酸序列同一性、或者至少約86%的氨基酸序列同一性、或者至少約87%的氨基酸序列同一性、或者至少約88%的氨基酸序列同一性、或者至少約89%的氨基酸序列同一性、或者至少約90%的氨基酸序列同一性、或者至少約91%的氨基酸序列同一性、或者至少約92%的氨基酸序列同一性、或者至少約93%的氨基酸序列同一性、或者至少約94%的氨基酸序列同一性、或者至少約95%的氨基酸序列同一性、或者至少約96%的氨基酸序列同一性、或者至少約97%的氨基酸序列同一性、或者至少約98%的氨基酸序列同一性、和或者至少約99%的氨基酸序列同一丨I"生。`“百分比(%)氨基酸序列同一性”定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與特定或參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領域技術人員可決定用于測量對比的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。對于氨基酸序列比較，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一 ％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算:分數X/Y 乘 100其中X是由序列對比程序在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的氨基酸殘基數，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數。可以領會，若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨基酸序列同一性。作為使用這種方法計算％氨基酸序列同一性的例子，下文表I和2演示了如何計算指派為“參照蛋白質”的氨基酸序列相對于指派為“IL-22”的氨基酸序列的％氨基酸序列同一性，其中“IL-22”代表感興趣IL-22多肽的氨基酸序列，“參照蛋白質”代表感興趣“IL-22”多肽針對其進行比較的多肽的氨基酸序列，而“X”、“Y”和“Z”各自代表不同氨基酸殘基。表 1IL-22XXXXXXXXXXXXXXX (長度=15 個氨基酸)參照蛋白質XXXXXYYYYYYY(長度=12個氨基酸)%氨基酸序列同一性=(兩種多肽序列間相同匹配的氨基酸殘基的數目)除以(IL-22多肽的氨基酸殘基的總數)=5除以15=33.3%表 2IL-22XXXXXXXXXX(長度=10 個氨基酸)參照蛋白質XXXXXYYYYYYZZYZ (長度=15個氨基酸)%氨基酸序列同一性=(兩種多肽序列間相同匹配的氨基酸殘基的數目)除以(IL-22多肽的氨基酸殘基的總數)=5除以10=50%“分離的”生物學分子，諸如本文中所披露的各種多肽、多核苷酸、和抗體，指已經鑒定且自其天然環(huán)境的至少一種成分分開和/或回收的生物學分子?！坝谢钚缘摹被颉盎钚浴鄙婕岸嚯臅r指天然多肽的生物學和/或免疫學活性，其中“生物學”活性指除誘導針對天然多肽所擁有的抗原性表位的抗體生成的能力外的天然多肽生物學功能?！懊庖邔W”活性指誘導針對天然多肽所擁有的抗原性表位的抗體生成的能力。術語“拮抗齊『以最廣義使用，而且包括部分地或完全的阻斷、抑制、或中和多肽生物學活性的任何分子?！稗卓箘边€涵蓋完全地或部分地抑制編碼多肽的mRNA轉錄或翻譯的分子。合適的拮抗劑分子包括例如拮抗性抗體或抗體片段；天然多肽的片段或氨基酸序列變體；肽；反義寡核苷酸；有機小分子；及編碼多肽拮抗劑或拮抗性抗體的核酸。提及“一種”拮抗劑涵蓋單一拮抗劑或者兩種或更多種不同拮抗劑的組合。術語“激動劑”以最廣義使用，而且包括部分地或完全地模擬多肽(例如天然AMP)生物學活性的任何分子?！凹觿边€涵蓋刺激編碼多肽的mRNA轉錄或翻譯的分子。合適的激動劑分子包括例如激動性抗體或抗體片段；天然多肽；天然多肽的片段或氨基酸序列變體；肽；反義寡核苷酸；有機小分子；及編碼多肽激動劑或抗體的核酸。提及“一種”激動劑涵蓋單一激動劑或者兩種或更多種不同激動劑的組合?！翱刮⑸锩庖邞稹卑ǖ幌抻趯ξ⑸锊≡w感染的抵抗或防御。所述抵抗或防御可導致對微生物病原體的微生物感染性、復制、增殖或其它活性的抑制或降低。具體而言，導致抗微生物免疫應答的治療可導致微生物病癥或微生物病癥癥狀的緩解?！熬徑狻薄ⅰ皽p輕”或其等同表述指治療性處理和預防性或防范性措施二者，其中目標是緩解、預防、減緩(減輕)、降低/減少或抑制所針對的微生物病癥或其癥狀。需要治療的受試者包括那些早就患有病癥的以及傾向于患上病癥的或者要預防病癥的。關于治療微生物病癥，“治療”、“處理”、或其等同表述指改善具有病癥的受試者中的微生物病癥或微生物病癥癥狀?！伴L期”施用指與短期模式相反，以連續(xù)模式施用藥劑，從而將初始治療效果維持較長一段時間?！伴g歇”施用指不是無間斷連續(xù)進行的治療，而是本質上周期性的。為了治療的目的，“哺乳動物”指歸入哺乳類的任何動物，包括人，嚙齒類(例如小鼠和大鼠)，和猴；家畜和牲畜；及動物園、運動、實驗或寵物動物，諸如犬、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、家兔、等。在有些實施方案中，哺乳動物選自人、嚙齒類、或猴。類似地，為了治療的目的，“受試者”指哺乳動物受試者，而且包括人類和獸醫(yī)受試者?！奥摵稀币环N或多種其它治療劑的施用包括同時(共同)施用和任意次序的序貫施用。如本文中所使用的，“載體”包括藥學可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它們在所采用的劑量和濃度對暴露于其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受載體是PH緩沖水溶液。生理學可接受載體的例子包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合齊U，諸如EDTA ;糖醇,諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子,諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如 TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS ?！翱贵w” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相似結構特征的糖蛋白。雖然抗體展現出對特定抗原的結合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體和一般缺乏抗原特異性的其它抗體樣分子二者。后一類多肽例如由淋 巴系統(tǒng)以低水平生成及由骨髓瘤以升高的水平生成。術語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義可互換使用，而且包括單克隆抗體(例如全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現出期望的生物學活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細描述的)?？贵w可以是嵌合的、人的、人源化的和/或親和力成熟的。特異性結合特定抗原的抗體指能夠以足夠親和力結合抗原，使得該抗體在靶向抗原中可用作診斷劑和/或治療劑的抗體。優(yōu)選的是，根據例如放射免疫測定法(RIA)的測量，此類抗體與非靶多肽的結合程度小于該抗體對靶抗原的結合的約10%。在某些實施方案中，結合靶抗原的抗體具有彡I μ M、彡ΙΟΟηΜ、彡ΙΟηΜ、彡InM、或彡0.1nM的解離常數(Kd)。抗體的“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結構域。重鏈的可變域可稱為“VH”。輕鏈的可變域可稱為“VL”。這些結構域一般是抗體的最易變部分且包含抗原結合位點。術語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)(HVR)的三個區(qū)段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區(qū)，它們大多采取β_折疊片構象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β_折疊片結構一部分的三個⑶R連接。每條鏈中的⑶R通過FR區(qū)非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的⑶R —起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5版，National Institute of Health, Bethesda, MD(1991))。恒定域不直接涉及抗體對抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體依賴性細胞的細胞毒性中抗體的參與。根據其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(λ)。根據其重鏈恒定域氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白分成五大類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可進一步分為亞類(同種型),例如IgG1'IgG2, IgG3、IgG4, IgA1和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Υ和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的，而且一般性記載于例如Abbas等，Cellular and Mol.1mmunology,第4版(2000)?？贵w可以是抗體與一種或多種其它蛋白質或肽共價或非共價關聯而形成的更大融合分子的一部分。術語“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體而非如下文所定義的抗體片段。該術語具體指重鏈包含Fe區(qū)的抗體?！翱贵w片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分保留該部分存在于完整抗體中時通常與之有關的至少一項、多至大多數或所有功能。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合位點，如此保留結合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含Fe區(qū)的抗體片段，保留Fe區(qū)存在于完整抗體中時通常與之有關的至少一項生物學功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調控、ADCC功能和補體結合。在一個實施方案中，抗體片段是體內半衰期與完整抗體基本上相似的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個抗原結合臂，其與能夠賦予該片段以體內穩(wěn)定性的Fe序列相連接。用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個抗原結合位點，及一個剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結晶的能力。胃蛋白酶處理產生一個F (ab’)2片段，它具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。“Fv”是包含完整抗原結合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈Fv種類由緊密、非共價結合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連接，使得輕鏈和重鏈在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結構中相結合。正是在這種構造中，各可變域的三個CDR相互作用而在VH-VL 二聚體表面上確定一個抗原結合位點。六個CDR共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，只是親和力低于完整結合位點。Fab片段包含重鏈和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結構域的羧基末端增加了少數殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab’的稱謂。？(&13’)2抗體片段最初是作為在Fab’片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab’片段生成的。還知道抗體片段的其它化學偶聯形式。“單鏈Fv”或“scF v”抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在VH與VL結構域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結合抗原的期望結構。關于scFv的綜述參見Pluckthun,于:The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg 和 Moore 編,Springer-Verlag, NewYork, pp.269-315(1994)。
術語“雙抗體”指具有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連接的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使這些結構域與另一條鏈的互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完整地記載于例如 EP404, 097; W093/1161; Hudson 等(2003) Nat.Med.9:129-134;及 Hollinger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)。三抗體(triabody)和四抗體(tetrabody)也記載于 Hudson 等(2003) Nat.Med.9:129-134。如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。如此，修飾語“單克隆”表明抗體不是分立的抗體的混合物的特征。在某些實施方案中，此類單克隆抗體典型地包括包含結合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結合多肽序列在內的過程獲得的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應當理解，所選擇的靶物結合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結合序列人源化、提高其在細胞培養(yǎng)物中的產量、降低其在體內的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型地包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”表明抗體從一群基本上同質的抗體獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術來生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler等，Nature256:495 (1975) ;Harlow 等，Antibodies:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988;Hammerling 等,于:MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas,563-681, Elsevier, N.Y, 1981)> 重組 DNA法(參見例如美國專利N0.4，816，567)、噬菌體展示技術(參見例如Clackson等，Nature352:624-628( 1991);Marks 等，J.Mol.Biol.222:581-597 (1992);Sidhu等,J.Mol.Biol.338 (2): 299-310 (2004) ; Lee 等,J.Mol.Biol.340 (5): 1073-1093 (2004) ;Fellouse, Proc.Nat.Acad.Sc1.USAlOl (34): 12467-12472(2004);及 Lee 等,J.1mmunol.Methods284 (1-2):119-132 (2004))、及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如WO98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735 ;W091/10741; Jakobovits 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:2551(1993);Jakobovits 等，Nature362:255_258(I993);Bruggemann 等，Yearin Immun0.7:33 (1993);美國專利 N0.5，545，807; 5，545，806; 5，569，825; 5，625，126; 5，633, 425;5, 661, 016;Marks 等,Bi0.TechnologylO:779-783 (1992);Lonberg 等,Nature368:856-859 (1994);Morrison, Nature368:812-813(1994);Fishwild 等，Nature Biotechnol.14:845-851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnol.14:826(1996)及 Lonberg 和Huszar, Intern.Rev.1mmunol.13:65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬于特定抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或屬于另一抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利N0.4，816，567;及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見 Jones 等，Nature321:522-525 (1986) ; Riechmann 等，Nature332:323-329 (1988);及 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。還可參見以下綜述及其引用的參考文獻:Vaswani 和 Hamilton, Ann.Allergy, Asthma&Immunol.1:105-115 (1998);Harris, Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038 (1995);Hurle 和 Gross, Curr.0p.Biotech.5:428-433(1994)。“人抗體”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。根據其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2?！坝H和力成熟的”抗體指在抗體的一個或多個HVR中具有一處或多處改變、導致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。在一個實施方案中，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領域已知規(guī)程來生成。Marks等，Bio/Technology 10:779-783 (1992)記載了通過VH和VL結構域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了 HVR和/或框架殘基的隨機誘變:Barbas 等,Proc.Nat.Acad.Sc1.USA91:3809-3813 (1994) ; Schier等,Genel69:147-155(1995);Yelton 等,J.1mmunol.155:1994-2004(1995);Jackson等，J.1mmunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins 等，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)?！白钄嘈浴笨贵w、“中和性”抗體或“拮抗性”抗體指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗體。此類抗體可實質性地或完全地抑制抗原的生物學活性。如本文中所使用的，“激動性抗體”指部分地或完全地模擬感興趣多肽的生物學活性的抗體。抗體“效應器功能”指那些可歸于抗體Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學活性?？贵w效應器功能的例子包括:Clq結合和補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化?！敖Y合親和力”通常指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，如本文中所使用的，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶Y的親和力通?？捎媒怆x常數(Kd)來表述。親和力可通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速地結合抗原且趨于保持更長時間的結合。本領域知道測量結合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的示例性實施方案。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”是通過如下測定法所述使用Fab型式的目的抗體及其抗原實施的放射性標記抗原結合測定法(RIA)來測量的。通過在存在未標記抗原的滴定系列的情況中，用最小濃度的125I標記抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結合親和力(Chen，等(1999)J Mol Biol293:865-881)。為了確定測定條件，用50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5 μ g/ml捕捉用抗Fab抗體(CappelLabs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨后用PBS中的2%(w/V)牛血清清蛋白于室溫(大約23 ° C)封閉2-5小時。在非吸附平板(Nunc#269620)中，將IOOpM或26pM[125I]_抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab混合(例如與Presta等(1997)CancerRes.57:4593-4599中抗VEGF抗體，Fab-12的評估一致)。然后將目的Fab溫育過夜；然而，溫育可持續(xù)更長時間(例如約65個小時)以確保達到平衡。此后，將混合物轉移至捕捉平板以進行室溫溫育(例如I小時)。然后除去溶液，并用含0.l%Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔閃爍液(MicroScint-20; Packard),然后在Topcount伽馬計數器(Packard)上對平板計數10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結合之20%的濃度用于競爭性結合測定法。

依照另一個實施方案，Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測定法使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)在 25 ° C 使用固定化抗原CM5芯片在約10個響應單位(RU)測量的。簡言之，依照供應商的說明書用鹽酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5 μ g/ml (約0.2 μ Μ),然后以5 μ I/分鐘的流速注入至獲得約10個響應單位(RU)的偶聯蛋白質。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應基團。為了進行動力學測量，在25° C以約25μ I/分鐘的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(0.78nM 至 500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結合模型(BIAcore EvaluationSoftware version3.2)通過同時擬合結合和解離傳感圖來計算結合速率(km)和解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)以比率IwZkm計算。參見例如Chen，Y.等(1999) J MolBiol293:865-881。如果根據上文表面等離振子共振測定法，結合速率超過10 -1^,那么結合速率可使用熒光淬滅技術來測定，即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(astop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量,在存在濃度漸增的抗原的情況中，測量PBS pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25° C的熒光發(fā)射強度(激發(fā)=295nm ；發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的升高或降低。
依照本發(fā)明的“結合速率”(on-rate,rate of association, associationrate)或“k ”也可如上所述使用BIAcore -2000或BIAcore -3000系統(tǒng)(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)來測定。“分離的”抗體指已經鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，而且可以包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(I)根據Lowry法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)根據還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優(yōu)選的銀染色，達到同質。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。術語“標記物”在用于本文時指與某分子(諸如核酸、多肽、或抗體)直接或間接偶聯以生成“經過標記的/帶標記物的”分子的可檢測化合物或組合物。標記物可以是自身可檢測的(例如放射性同位素標記物或熒光標記物)，或者在酶標記物的情況中，可催化底物化合物或組合物發(fā)生化學改變，產生可檢測的產物?！肮滔唷币庵改撤肿?諸如核酸、多肽、或抗體)可粘著其上的非水性基質。本文中所涵蓋的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些實施方案中，根據語境，固相可包括測定板的孔；在其它實施方案中，它指純化柱(例如親和層析柱)。此術語還包括離散顆粒的不連續(xù)固相，諸如美國專利N0.4，275，149中所記載的?！爸|體”指由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的，可用于對哺乳動物投遞藥物(諸如核酸、多肽、抗體、激動劑或拮抗劑)的小囊泡。脂質體的成分通常排列成雙層形式，與生物膜的脂質排列相似。“小分 子”或“有機小分子”在本文中定義為分子量小于約500道爾頓的有機分子。結合靶多肽的“寡肽”指能夠以足夠親和力結合靶多肽，使得該寡肽在靶向多肽中可用作診斷劑和/或治療劑的寡肽。在某些實施方案中，根據例如表面等離振子共振測定法的測量，寡肽對無關非靶多肽的結合程度小于該寡肽對靶多肽的結合的約10%。在某些實施方案中，寡肽以彡I PM、彡100nM、彡10nM、彡InM、或彡0.1nM的解離常數(Kd)結合靶多肽。結合靶多肽的“有機分子”指除本文中所定義的寡肽或抗體以外，能夠以足夠親和力結合靶多肽，使得該有機分子在靶向多肽中可用作診斷劑和/或治療劑的有機分子。在某些實施方案中，根據例如表面等離振子共振測定法的測量，有機分子對無關非靶多肽的結合程度小于該有機分子對靶多肽的結合的約10%。在某些實施方案中，有機分子以彡Iii M、彡100nM、彡10nM、彡InM、或彡0.1nM的解離常數(Kd)結合靶多肽?！吧飳W系統(tǒng)”指包含享有共同信號傳導途徑的哺乳動物細胞的體外、離體/回體(ex vivo)、或體內系統(tǒng)。“微生物病癥”指其中微生物病原體引起、介導、或以其它方式促成疾病或狀況的發(fā)病的疾病或狀況。還包括其中刺激或干預抗微生物應答對疾病進展具有改善效果的疾病。此術語內包括傳染性疾病或狀況,和源自微生物病原體原發(fā)性感染的機會性疾病。此類傳染病的例子包括但不限于由EHEC和EPEC引起的腹瀉、炎性腸病(IBD)和更具體的潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)。術語“T細胞介導的疾病”指其中T細胞直接或間接介導或以其它方式促成哺乳動物發(fā)病的疾病。T細胞介導的疾病可能與細胞介導的效應、淋巴因子介導的效應等有關，甚至與B細胞有關的效應，如果B細胞得到刺激的話，例如受到由T細胞分泌的淋巴因子的刺激?！白陨砻庖咝圆“Y”或“自身免疫(性)”指其中發(fā)生了針對身體自己組織的體液或細胞介導的免疫應答的任何疾患?！癐L-23介導的自身免疫性病癥”指由IL-23活性引起的、維持的、或加劇的任何自身免疫性病癥。“炎癥”指損傷或感染部位白細胞的積累和血管的擴張，典型地引起疼痛、腫脹、和發(fā)紅。“慢性炎癥”指引起炎癥的原因持續(xù)存在且難以或不可能消除的炎癥。“自身免疫性炎癥”指與自身免疫性病癥有關的炎癥?！瓣P節(jié)炎炎癥”指與關節(jié)炎有關的炎癥?！把仔阅c病”或“IBD”指特征為胃腸道炎癥的慢性病癥。IBD涵蓋潰瘍性結腸炎，其影響大腸和/或直腸，及克羅恩氏病，其可以影響整個胃腸系統(tǒng)，但更常見的是影響小腸(回腸)和可能的大腸。術語“有效量”指某分子(例如核酸、多肽、激動劑、或拮抗劑)導致具體所述目的實現的濃度或量?！坝行Я俊笨梢詰{經驗來確定?！爸委熡行Я俊敝改撤肿佑行崿F所述治療效果的濃度或量。此量也可以憑經驗來確定`。如本文中所使用的，術語“細胞毒劑”指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9tl和Re186)、化療劑、和毒素諸如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段?！吧L抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內抑制細胞，尤其是過表達任何基因的細胞生長的化合物或組合物。如此，生長抑制劑是顯著降低處于S期的過表達所述基因的細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導Gl停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、泰素(taxol)、和拓撲異構酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯,例如DNA燒化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿卩密卩定(5-fIuorouracil)和 ara_C。更多信息可參見 TheMolecular Basis ofCancer, Mendelsohn 和 Israel 編，第 I 章，題為“Cell cycle regulation, oncogenes, andantineoplastic drugs，，，Murakami 等，WB Saunders, Philadelphia (1995),尤其是第 13頁。術語“細胞因子”是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用于另一種細胞群的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-P ;淋巴毒素-a和-0 ;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO);神經生長因子，諸如NGF-P ;血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-a和TGF-P ;胰島素樣生長因子-1和-1I ;促紅細胞生成素(EPO);骨誘導因子(osteoinductive factor);干擾素,諸如干擾素_ a、-0和-y ;集落刺激因子(CSF),諸如巨噬細胞CSF (M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF (GM-CSF)和粒細胞CSF (G-CSF);白介素(IL)，諸如 IL-U IL-1 a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6, IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-6、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23 ;腫瘤壞死因子，諸如TNF-a或TNF-P ;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文中所使用的，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物。如本文中所使用的，術語“炎癥細胞”指增強炎癥應答的細胞，諸如單個核細胞、嗜曙紅細胞、巨噬細胞和多形核嗜中性細胞(PMN)。I1.本發(fā)明的組合物和方法A.抗微生物多肽(AMP)及其調控劑本發(fā)明的抗微生物多肽(AMP)指介導或以其它方式影響對微生物病原體的抗微生物免疫應答的多肽。本發(fā)明的AMP包括但不限于LT、IL-6、IL-22、IL-23 (包括例如IL-23pl9或IL-23p40)、和由Reg超家族的基因編碼的Reg或Reg相關蛋白。Reg超家族包括來自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相關基因，而且分成四個亞類，即I型、II型、III型、和IV型。例如，I型包括人REGI a、人REGIP、大鼠Reg1、和小鼠RegI ;II型包括小鼠RegII ；III型包括人REGII1、人HIP/PAP(在肝細胞癌-腸-胰中表達的基因/編碼胰腺炎相關蛋白的基因)、大鼠 PAP/肽 23、 大鼠 Reglll/PAPI1、大鼠 PAP II1、小鼠 RegIII a、RegIII^、RegIII Y、小鼠RegIII S、和倉鼠INGAP (胰島新生相關蛋白)。IV型含有人REGIV。另外，人Reg相關序列(RS)據報告是假基因。在一個實施方案中，所述REG蛋白質由人REG基因家族的成員編碼，包括但不限于REG Ia、REG I P、HIP/PAP、REG III, REG IV、和Reg相關序列(RS)。在一些方面，本發(fā)明AMP的氨基酸序列包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQID NO: 52、SEQ ID NO: 54、和 SEQ ID NO: 56。在其它方面，編碼本發(fā)明AMP的核酸序列包含選自下組的核酸序列:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13,SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID N0:3USEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:49,SEQID NO:51、SEQ ID NO:53、和 SEQ ID NO:55。
本發(fā)明AMP的活性可以相對于另一種AMP或同一種AMP的活性提高或降低和/或差異調節(jié)。本發(fā)明AMP的活性的例子包括但不限于AMP表達、信號轉導、結合至結合配偶、抗微生物應答、或其其它生物學或免疫學活性。在一個實施方案中，一種或多種本發(fā)明AMP的活性的升高導致受試者中抗微生物免疫應答的增強或誘導。在一個實施方案中，本發(fā)明的AMP包括但不限于與IL-22直接或間接相互作用的多肽，例如位于介導宿主對微生物病原體(例如細菌或病毒)感染的抵抗力的IL-22信號轉導途徑的上游或下游的多肽。此類AMP的例子包括但不限于LT、IL-6、IL-18、和IL-23 (包括例如 IL-23pl9 或 IL-23p40)。本發(fā)明的調控劑包括但不限于直接或間接調控AMP活性的多肽和核酸分子(例如DNA分子或RNA分子)。所述調控的例子包括但不限于本發(fā)明AMP活性的升高、降低、誘導或活化、抑制、或調節(jié)(例如上調或下調)。在一個具體的實施方案中，所述調控劑通過降低或抑制IL-22結合蛋白(BP)活性并由此提高IL-22活性來間接調控IL-22活性。在又一個實施方案中，所述調控劑降低或抑制IL-22BP結合IL-22并由此提高·I·L-22活性。在一些實施方案中，所述調控劑是多肽，例如結合AMP或以其它方式與AMP相互作用以提高、誘導、或調節(jié)AMP活性的多肽。在一個實施方案中，所述調控劑是調控AMP活性的融合多肽。在一個實施方案中，所述調控劑是結合AMP的抗體。在一個具體的實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在另一個實施方案中，所述抗體是選自Fab、Fab’ _SH、Fv、scFv、或(Fab’)2片段的抗體片段。在另一個實施方案中，所述抗體是融合多肽(例如Fe融合多肽)。在另一個實施方案中，所述抗體是嵌合抗體。在一個具體的實施方案中，所述抗體是人源化的。在另一個實施方案中，所述抗體是人抗體。在另一個實施方案中，所述抗體與選自人、非人靈長類、或其它哺乳動物(例如豬、綿羊、家兔、土撥鼠、大鼠、或小鼠)的抗體結合相同表位。在一個具體的實施方案中，所述抗體是AMP激動劑。在一個具體的實施方案中，所述調控劑是重組AMP或編碼AMP的核酸分子(例如DNA或RNA分子)。在另一個具體的實施方案中，所述調控劑是重組AMP或編碼AMP的核酸分子(例如DNA或RNA分子)，其能在細胞中表達。本發(fā)明的AMP涵蓋天然全長或成熟AMP及其變體。AMP變體可以通過向編碼AMP的DNA中引入適宜核苷酸變化和/或通過合成期望的抗微生物多肽來制備。本領域技術人員會領會，氨基酸變化可能改變本發(fā)明多肽的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數目或位置或改變膜錨定特征。如本文中所描述的，在天然AMP中或在AMP的各個結構域中的變異可以通過，例如，使用保守性和非保守性突變的任何技術和原則，例如美國專利N0.5，364，934中所列舉的來產生。變異可以是編碼AMP的一個或多個密碼子的替代、刪除或插入，其導致與天然序列AMP相比AMP的氨基酸序列中的變化。任選的，所述變異是在AMP的一個或多個結構域中至少一個氨基酸用任何其它氨基酸替代。確定哪個氨基酸殘基可以被插入、替代或刪除而不會不利地影響期望活性的指導可以通過比較AMP的序列與同源的已知蛋白質分子的序列并最小化在高同源性區(qū)域中進行的氨基酸序列改變的數目來發(fā)現。氨基酸替代可以是一個氨基酸用具有相似結構和/或化學性質的另一個氨基酸替換的結果，諸如用絲氨酸替換亮氨酸，即保守性氨基酸替換。插入或刪除可以任選地在約I到5個氨基酸的范圍內。通過在序列中系統(tǒng)性地產生氨基酸的插入、刪除或替代并對使得變體測試由全長或成熟天然序列展現的活性，可以確定容許的變異。在特定的實施方案中，感興趣的保守性替代在表3中優(yōu)選替代表頭下顯示。如果這種替代導致生物學活性的改變，那么引入更為實質性的改變，在表6中稱為例示替代，或如下文對于氨基酸種類所進一步描述的，并篩選產物。表權利要求
1.一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)，其中所述AMP是IL-22。
2.一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)或其調控劑，其中所述AMP 選自下組:IL-6、IL-18、IL-23、REG I a , REG I P、HIP/PAP、REG III, REG IV、Reg 相關序列(RS)和LT0
3.—種調控受到微生物病原體感染的受試者的細胞中抗微生物多肽(AMP)的活性的方法，包括使所述細胞接觸分離的AMP，其中所述AMP是IL-22。
4.一種調控受到微生物病原體感染的受試者的細胞中抗微生物多肽(AMP)的活性的方法，包括使所述細胞接觸分離的AMP，其中所述AMP選自下組:IL-6、IL-18、IL-23、REGIa、REG IP、HIP/PAP、REG II1、REG IV、Reg 相關序歹 lj (RS)和 LT。
5.一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)調控劑，其中所述AMP調控劑是IL-22激動劑。
6.一種試劑盒，其包括用于治療微生物病癥的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含抗微生物多肽(AMP) ，其中所述AMP是IL-22。
7.一種試劑盒，其包括一種或多種用于治療微生物病癥的藥物組合物，其中所述藥物組合物每一種包含不同的抗微生物多肽(AMP)或其調控劑，且其中所述AMP選自下組:IL-6、IL-18、IL-23、REG I a、REG I P、HIP/PAP、REG II1、REG IV、Reg 相關序列(RS)、和LT0
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療微生物病癥的組合物和方法。本發(fā)明涉及用于通過調控宿主免疫應答來治療微生物病癥的組合物和方法。更具體地說，本發(fā)明涉及介導抗微生物免疫應答的組合物及使用此類組合物來治療微生物感染的方法。
文檔編號A61K38/17GK103142999SQ20131005001
公開日2013年6月12日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權日2007年11月7日
發(fā)明者亞歷山大.R.阿巴斯, 迪米特里.M.達尼蘭科, 弗雷德里克.J.德索瓦格, 尼科.P.吉拉蒂, 佐拉.莫德魯桑, 歐陽文軍, 帕特里夏.A.瓦爾德茲, 鄭衍 申請人:健泰科生物技術公司