專利名稱：一種沉默人乳腺癌特異基因的shRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種shRNA的構(gòu)建及應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明針對人乳腺癌特異基因(breast cancer special gene I, BCSG1)的核苷酸序列設(shè)計合成shRNA，所述shRNA轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞后能抑制所述腫瘤細(xì)胞的BCSGl基因的表達(dá)。
背景技術(shù)：
乳腺癌特異基因(breast cancer special genel,BCSGl)則是一種特異的在乳腺癌中有選擇性表達(dá)的新基因，是1997年用cDNA直接測序法發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)基因，定位于染色體10q23，轉(zhuǎn)錄mRNA全長約10Kb，含5個外顯子，有一 38Ibp的開放讀碼框架，編碼一127個氨基酸的多肽鏈。BCSGl基因與1998年Lavedan等確認(rèn)的SNCs家族新成員SNCG幾乎為同一基因，因此又可稱為SNCG, persyrioBCSGl是一種特異的在乳腺癌中有選擇性表達(dá)的新基因，BCSGl對乳腺癌的進(jìn)展起明顯促進(jìn)作用，BCSGl呈陽性表達(dá)的乳腺癌有更多浸潤和轉(zhuǎn)移傾向；前期研究發(fā)現(xiàn)，BCSGl可作為“三陰性”乳腺癌亞型治療和預(yù)后的評估因子。乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素，最近的研究表明，在乳腺癌的局部浸潤過程中伴隨著上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymaltransition,EMT)的發(fā)生。免疫細(xì)胞化學(xué)分析提示BCSGl與乳腺癌細(xì)胞胞質(zhì)的膜結(jié)構(gòu)有關(guān)，通過影響細(xì)胞骨架組成的變化參與調(diào)節(jié)乳腺癌上皮細(xì)胞網(wǎng)，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)程。這與EMT通過使腫瘤基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的破壞以及細(xì)胞骨架的重建、細(xì)胞間黏附的喪失而導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動性增強(qiáng)和遷移的作用機(jī)理相似。由于BCSGl基因只在乳腺癌中特異性高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)或不表達(dá)，預(yù)示著針對BCSGl的高選擇性分子靶向藥物在乳腺癌個體化治療方面的廣泛前景。RNA干擾是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性基因沉默現(xiàn)象[Fire A, Xu SQ, MontgomeryMK, et al.Potent and specific genetic interference bydouble-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Naturel998 ;391:806-811],因其具有沉默效率高、特異性強(qiáng)以及操作簡便等優(yōu)于傳統(tǒng)基因敲除手段的優(yōu)點而得到迅速發(fā)展。shRNA 即小發(fā)卡 RNA 或者短發(fā)卡 RNA(a small hairpin RNA or short hairpinRNA, shRNA)，是一段外源性的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，能夠在細(xì)胞內(nèi)加工成siRNA，siRNA進(jìn)而與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)。該復(fù)合物能夠結(jié)合到同源的mRNA上并誘導(dǎo)其降解。
侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最普遍的生物學(xué)特征，也是影響患者生存和預(yù)后的關(guān)鍵因素，為了降低腫瘤細(xì)胞BCSGl基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，本發(fā)明構(gòu)建了針對BCSGl分子的shRNA，所述shRNA轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞后，有效抑制了乳腺癌細(xì)胞的BCSGl基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中人乳腺癌特異基因(breast cancer special gene1，BCSG1)的mRNA序列以及shRNA的引物設(shè)計原則，設(shè)計了 3條針對BCSGl基因的干擾序列，另外還設(shè)計了無干擾效果的陰性對照和干擾GAPDH的陽性對照干擾序列，并將設(shè)計完成shRNA的序列送生工生物(上海)有限公司進(jìn)行合成。上述3條針對BCSGl基因的干擾序列其shRNA引物序列如下:干擾I的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.1所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.2所示，干擾I的靶點序列如序列表SEQ ID N0.3所示；干擾2的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.4所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.5所示，干擾2的靶點序列如序列表SEQ ID N0.6所示；干擾3的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.7所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.8所示，干擾3的靶點序列如序列表SEQ ID N0.9所示。上述無干擾效果的陰性對照其siRNA序列如序列表SEQ ID N0.10所示，其正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.11所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.12所示；干擾GAPDH的陽性對照其siRNA序列如序列表SEQ ID N0.13所示，其正義鏈序列如序列表SEQ IDN0.14所示,其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.15所示。本發(fā)明將上述設(shè)計的干擾序列、陰性對照和陽性對照的shRNA引物常規(guī)退火后合成雙鏈，得到退火片段；雙酶切pGCs1-1質(zhì)粒，將退火片段分別與酶切后的pGCs1-1質(zhì)粒連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取單菌落進(jìn)行PCR及測序鑒定，得到了陽性的克隆和質(zhì)粒。 本發(fā)明將陰性對照、陽性對照與3條干擾基因的載體及空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，本發(fā)明通過RT-PCR方法檢測了乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中BCSGlmRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示:干擾I的干擾效果最好，使腫瘤細(xì)胞中MDA-MB-231的mRNA表達(dá)量降低了 49.63% ;干擾2的干擾效果次之，使腫瘤細(xì)胞中MDA-MB-231的mRNA表達(dá)量降低了 43.68%，干擾3沒有干擾效果。本發(fā)明將陰性對照、陽性對照與3條干擾基因的載體及空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，通過Western blot技術(shù)檢測乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中BCSGl蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示:干擾I的干擾效果最好，使腫瘤細(xì)胞中MDA-MB-231的蛋白質(zhì)表達(dá)量降低了 49 %;干擾2的干擾效果次之，使腫瘤細(xì)胞中MDA-MB-231的蛋白質(zhì)表達(dá)量降低了 44%，干擾3沒有干擾效果。以上結(jié)果顯示本發(fā)明所設(shè)計的干擾I和干擾2的shRNA能夠有效沉默細(xì)胞BCSGl基因的表達(dá)，所以本發(fā)明所述的干擾I和干擾2的shRNA可以用于沉默細(xì)胞BCSGl基因的表達(dá)和用于制備治療乳腺癌藥物。本發(fā)明還公開了一種降低細(xì)胞BCSGl基因的表達(dá)的方法，包括以下步驟:(I)轉(zhuǎn)染前一天，以合適的細(xì)胞密度接種到6cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞要達(dá)到90%的融合度；(2)轉(zhuǎn)染前每個孔棄掉舊的培養(yǎng)基，加入5ml不含雙抗5% FBS的培養(yǎng)基；(3) 500 u I opt1-MEM和8 ii g含有干擾I序列的質(zhì)?；旌?，室溫下靜置5min ；(4)將步驟(3)得到的混合物和20 u llip2000輕輕混勻，室溫下靜置20min ；(5)將質(zhì)粒和lip2000的混合液輕輕滴加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，搖動培養(yǎng)板混勻。
(6)在37°C，5%的C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時；(7)6小時后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37°C，5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72h檢測BCSGl基因的表達(dá)水平。


圖1A圖為載體質(zhì)粒pGCs1-1雙酶切回收前電泳圖，B圖為回收之后電泳檢測圖，其中PG為未酶切pGCs1-1質(zhì)粒；圖2含干擾序列的pGCs1-1質(zhì)粒的檢測圖，其中I和2號質(zhì)粒為干擾I序列與雙酶切載體PGCs1-1連接后得到的質(zhì)粒，其中3和4號質(zhì)粒為干擾2序列與雙酶切載體pGCs1-1連接后得到的質(zhì)粒，其中5和6號質(zhì)粒為干擾3序列與雙酶切載體pGCs1-1連接后得到的質(zhì)粒;圖3GAPDH陽性對照組干擾效果；圖4不同組細(xì)胞的BCSGlmRNA相對表達(dá)量；圖5不同干擾質(zhì)粒對細(xì)胞的BCSGlmRNA干擾效率；圖6不同組細(xì)胞的BCSGl蛋白曝光后膠片掃描圖；圖7不同組細(xì)胞的BCSGl蛋白質(zhì)相對表達(dá)量；圖8不同干擾質(zhì)粒對細(xì)胞的BCSGl蛋白干擾效率。實施例1BCSGl的shRNA干擾載體的構(gòu)建一材料和方法1、材料乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 購自美國 ATCC ;RPMI1640、0.05% Trypsin，購于 Gibco公司；胎牛血清購于hyclone公司；0ptiMEM培養(yǎng)液購于Invitrogen公司?？俁NA提取試劑盒、快速膠回收試劑盒、2XTaq PCR Master Mix購自北京天根；⑶14抗體購自santa cruz ;BamH1、HindIII核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa。大腸桿菌DH5 a、pGCs1-1載體均由本實驗室保存；引物委托生工生物(上海)有限公司合成；其他藥品為國產(chǎn)分析純。2、方法2.1、shRNA序列的設(shè)計檢索GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nucleotide)，人乳腺癌特異基因(breast cancer special genel, BCSG1)的mRNA序列，根據(jù)shRNA引物設(shè)計原則[Reynolds A, Leake D,Boese Q,et al.Rational siRNA design for RNA interference.Nat Biotechnol2004 ；22(3):326-330]，設(shè)計并合成3條BCSGl干擾序列及I條無關(guān)干擾序列，同時合成GAPDH干擾序列作為陽性對照。上述3條針對BCSGl基因的干擾序列其shRNA引物序列如下:干擾I的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.1所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.2所示，干擾I的靶點序列如序列表SEQ ID N0.3所示；干擾2的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.4所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.5所 示，干擾2的靶點序列如序列表SEQ ID N0.6所示；干擾3的正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.7所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.8所示，干擾3的靶點序列如序列表SEQ ID N0.9所示。
上述無干擾效果的陰性對照其siRNA序列如序列表SEQ ID N0.10所示，其正義鏈序列如序列表SEQ ID N0.11所示，其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.12所示；干擾GAPDH的陽性對照其siRNA序列如序列表SEQ ID N0.13所示，其正義鏈序列如序列表SEQ IDN0.14所示,其反義鏈序列如序列表SEQ ID N0.15所示。2、引物退火引物合成之后，加水溶解至10uM，反應(yīng)體系如表I所示:表1退火體系
權(quán)利要求
1.一種shRNA，包括正義鏈和反義鏈，其特征在于，所述正義鏈的核苷酸序列如序列表SEQ N0.1所示,所述反義鏈的核苷酸序列如序列表SEQ N0.2所示。
2.權(quán)利要求1所述的shRNA在制備降低細(xì)胞BCSGlmRNA試劑中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的shRNA在制備抑制細(xì)胞BCSGl蛋白表達(dá)試劑中的應(yīng)用。
4.一種降低細(xì)胞BCSGl表達(dá)的方法，具體步驟如下: (1)轉(zhuǎn)染前一天，以合適的細(xì)胞密度接種到6cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞要達(dá)到90%的融合度。
(2)轉(zhuǎn)染前每個孔棄調(diào)舊的培養(yǎng)基，加入5ml不含雙抗5%FBS的培養(yǎng)基。(3)500 u I opt1-MEM和8 ii g含有干擾I序列的質(zhì)?；旌?，室溫下靜置5min。
(4)將步驟(3)得到的混合物和20iillip2000輕輕混勻，室溫下靜置20min。
(5)將質(zhì)粒和lip2000的混合液輕輕滴加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，搖動培養(yǎng)板混勻。
(6)在37°C，5%的C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時。
(7)6小時后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37°C，5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72h檢測BCSGl基因的表達(dá)水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒為pGCs1-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種沉默人乳腺癌特異基因的shRNA，其正義鏈序列如序列表SEQ NO.1所示，其反義鏈序列如序列表SEQ NO.2所示。本發(fā)明所述的shRNA是通過對人乳腺癌特異基因(breast cancer special gene1，BCSG1)的mRNA序列設(shè)計、合成并構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體，通過功能性實驗驗證，得到了有效抑制腫瘤細(xì)胞BCSG1表達(dá)的shRNA。本發(fā)明還公開了所述shRNA的應(yīng)用。
文檔編號A61K48/00GK103088028SQ20131005528
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者何勁松, 陳偉財, 葉偉亮, 袁梓膳, 王坤, 李國勁 申請人:何勁松