專利名稱：發(fā)熱伴血小板減少綜合癥中重要蛋白的抑制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用小分子化合物抑制病毒復制。具體地，本發(fā)明涉及利用小分子化合物蘇拉明(Suramin)抑制布尼亞病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒屬的病毒復制,尤其是抑制發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(SFTSV)的復制。
背景技術：
近年來，由于全球氣候變化等因素，在我國曾發(fā)生過幾起對人類健康造成巨大危害的公共傳染性疾病，如手足口病、禽流感、SARS、豬鏈球菌病等。這些高傳染性疾病對我國的社會、經濟和國家安全提出了嚴峻的挑戰(zhàn)，對這些高危病原體的科學研究、研發(fā)有效防治手段具有一定的重要性和緊迫性。新發(fā)傳染病特異性治療藥物和疫苗的研發(fā)對我國傳染病的防控工作至關重要，對新發(fā)傳染病病原體重要蛋白的結構與功能缺乏深入的認識嚴重制約了傳染病防控工作的有效開展。2009年以來，各大媒體接連報道河南等多地發(fā)生蜱咬引發(fā)以“發(fā)熱”為主要臨床特征的疾病流行，引起社會各界廣泛關注。衛(wèi)生部專家在各地開展病原分離與現(xiàn)場調查工作,2008年目標被鎖定為人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis, HGA)。今年3月17日，中國疾病預防控制中心病毒所的李德新和梁米芳團隊在《The NewEngland Journal of Medicine》發(fā)表了相關最新研究成果，鑒定了自2009年以來發(fā)生在我國中部蝶咬病的真正“元兇”，即引起發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever withthrombocytopenia syndrome, SFTS)的新型布尼亞病毒,并命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTS virus，SFTSV)，發(fā)病初期病死率高達30% [2]。布尼亞科病毒通常為具有包膜的球形負鏈RNA病毒,直徑約80-120nm,表面具有糖蛋白突起(如圖1)。布尼亞病毒科具有350多個病毒成員，是蟲媒病毒中病毒數(shù)最多的一科，分為5個屬,其中4個能感染人和動物,包括白蛉病毒屬(Phlebovirus)、布尼亞病毒屬(Bunyavirus)^R坦病毒屬(Hantavirus)和內羅病毒屬(Nairovirus),以及一個至今僅發(fā)現(xiàn)感染植物的番爺斑萎病毒屬(Tospovirus) [3]。除了漢坦病毒屬的病毒通過哨齒類與食蟲類動物傳播外，其他4個屬的病毒均由蚊、白蛉、蜱、蠓和薊馬等節(jié)肢動物傳播。發(fā)熱伴血小板減少綜合征SFTS主要傳播途徑為蜱蟲叮咬，最近的一些病例表明接觸可能為其傳播途徑之一 [4]。SFTS的發(fā)病機理尚不明確，該病毒具有泛嗜性，對血液系統(tǒng)、內臟、消化道等都有侵犯，主要表現(xiàn)為發(fā)熱，血小板顯著減少，白細胞減少，嚴重者出現(xiàn)多臟衰竭而死亡氣然而，該新型布尼亞病毒SFTSV感染引起的疾病具有病程進展快速、疾病后果危重，并且能通過動物媒介和接觸傳播的特點，極可能引起局部地區(qū)的暴發(fā)流行，而造成突發(fā)的公共衛(wèi)生事件。由于對新型布尼亞病毒SFTSV感染的致病機制認識有限，缺乏成熟的治療手段，而且目前該類病毒在國內部分地區(qū)和國外仍不斷涌現(xiàn)[6’7]，因此，對于新型布尼亞病毒SFTSV特效治療藥物或疫苗的研發(fā)迫在眉睫。蘇拉明(Suramin，又稱3O9Fi3O9F ourneau, Bayer205, Moranyl, Naganin,Naganine等)是由德國Oskar Dressel和Richard Kothe于1916年發(fā)明的，目前仍以“Germanin”的商標名在銷售。蘇拉明主要用于治療錐體蟲引起的人類嗜睡病和盤尾絲蟲病(onchocercosis) [8’9]。另外，蘇拉明也可以用于治療前列腺癌_。目前仍無蘇拉明及其類似物用于治療發(fā)熱伴血小板減少綜合癥病毒(SFTSV)等布尼病毒家族(Bunyaviridaefamily)白蛉病毒屬(Phlebovirus)病毒的報道。

發(fā)明內容
發(fā)熱伴血小板減少綜合征是由一種新型布尼亞病毒(SFTSV)引起的急性傳染病，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱伴血小板減少為主要特征，少數(shù)患者病情較重且發(fā)展迅速，可因多臟器功能衰竭而死亡。該病毒屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒屬(Phlebovirus)。與布尼亞病毒科白蛉病毒屬的裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)、Uukuniemi病毒(UUKV)的氨基酸同源性約為30%。本發(fā)明涉及通過高通量篩選方法獲得一種高親和力小分子藥物蘇拉明(Suramin)，其特異性結合白蛉病毒屬核蛋白從而抑制病毒的復制和增殖。采用結構生物學方法解析了 SFTSV核蛋白及其與小分子藥物蘇拉明的復合物的晶體的結構，該小分子蘇拉明能明顯抑制SFTSV的復制。更具體地，本發(fā)明提供以下各項:1.一種用于治療由布尼亞病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒屬(Phlebovirus)的病毒引起的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含蘇拉明(Suramin)作為活性成分。2.根據第I項所述的藥物組合物，其中所述布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒是發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)、布埃納文圖拉(Buenaventura)病毒或格拉納達(Granada)病毒。

3.根據第I項所述的藥物組合物，其中所述由布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒引起的疾病是發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)。4.蘇拉明在制備用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病是由布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒引起的。5.根據第4項所述的用途，其中所述布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒是發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒、布埃納文圖拉病毒或格拉納達病毒。6.根據第4項所述的用途，其中所述疾病是發(fā)熱伴血小板減少綜合征。7.一種用于治療由布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒引起的疾病的試劑盒，所述試劑盒包含蘇拉明。8.根據第7項所述的試劑盒，其中所述布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒是發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒、布埃納文圖拉病毒或格拉納達病毒。9.根據第7項所述的試劑盒，其中所述疾病是發(fā)熱伴血小板減少綜合征。下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1:蘇拉明的篩選，A:蘇拉明的結構；B:FTS實驗方法驗證SFTSV-N與蘇拉明結合；c:ITC法驗證SFTSV-N與蘇拉明結合(Kd = 0.44 μ M)。圖2:蘇拉明特異性結合布尼亞家族白蛉病毒屬成員N蛋白，A =FTS實驗方法證明蘇拉明與白蛉病毒屬成員GRAV和BUEV的N蛋白結合；Β和C =ITC法證明GRAV-N(Kd =2.02 μ Μ)和BUEV-N(Kd = 2.48 μ Μ)分別與蘇拉明結合；D:FTS實驗方法證明蘇拉明與白蛉病毒屬成員RVFV和變復性的SFTSV-N結合；E:FTS實驗方法證明蘇拉明與非白蛉病毒屬成員N蛋白不結合，CCHFV:克里米亞-剛果出血熱病毒；LEAV:Leanyer病毒；Hantaan:漢坦病毒；Flu:A型流感病毒；RV:狂犬病病毒；HIV:人類免疫缺陷病毒/愛滋病病毒；Lassa:拉沙病毒。圖3 =SFTSV-N蛋白與白蛉病毒屬其它同源N蛋白的序列進行比對。SFTSV-N和RVFV-N 二級結構分別標記在序列的上下端。序列號為:SFTSV-N (GenBank號G1:395406763)、BUEV-N(GenBank 號 G1: 146336910)、GRAV-N(GenBank 號 G1:308197170)、SFSV-N(GenBank 號 G1:146336862),CORV-N(GenBank 號 G1:146336856)、PHLV1-N(GenBank號 G1:146336838) , PHLV2-N (GenBank 號 G1:146336850)、PUTV-N (GenBank 號 GI:146336898)、MASV-N(GenBank 號 G1:208610196)、PUNV-N(GenBank 號 G1:269799032)、SFNV-N(GenBank號 G1:146336883),UUKV-N(GenBank 號 G1:38371708),HEAV-N(GenBank號G1:399207760)、RVFV-N(GenBank 號 G1:127925)。圖4:蘇拉明抑制細胞內SFTSV復制。圖5:蘇拉明與SFTSV-N復合物的結構解析，A:SFTSV-N/蘇拉明復合物整體結構；B:蘇拉明頭部萘-1，3，5-三磺酸密度顯示及與SFTSV-N的氫鍵(黃色氨基酸)和疏水性(粉紅色氨基酸)相互作用；C:蘇拉明頭部萘-1，3，5-三磺酸結合于中心正電荷溝槽中；D:精確的蘇拉明頭部萘-1，3，5-三磺酸與SFTSV-N相互作用。
具體實施例方式實施例1、SFTSV-N蛋白(SFTSV N蛋白，SFTSV核蛋白)及SFTSV-N/蘇拉明復合物制備將編碼SFTSV-N(G1:395406763)的基因序列(SFTSV-N的氨基酸序列見SEQ IDN0.1，其編碼核酸序列 見SEQ ID N0.2)構建到pMCSG7載體(見參考文獻[11])中得到陽性重組質粒PMCSG7-SFTSV-N，并將其轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)的表達菌株(Novagen)中，并涂布新鮮的帶有氨芐青霉素抗性的LB平板培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆接入5ml的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)12小時左右。然后將其以1: 100的比例轉入500ml的LB培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)。待細菌0D600達到0.6-0.8時，把培養(yǎng)溫度降到16°C，加入IPTG至終濃度0.2mM,繼續(xù)培養(yǎng)約20小時后，離心(4000rpm，30min)收菌，菌體直接使用或儲存于_20°C備用。重組蛋白以可溶性蛋白形式高量表達。菌體用PBS(137mM NaCl,
2.7mM KCl,50mM Na2HPO4 和 IOmMKH2PO4, pH7.4)+3M 尿素 +IM NaCl 緩沖液重懸后轉移到燒杯中(按IL培養(yǎng)基使用40ml PBS的比例)放置于冰上用超聲破碎儀裂解細菌。超聲功率100W，工作時間10秒，間隙10秒，每個工作循環(huán)10次，依細菌量進行3-5個循環(huán)，待細菌顏色比較清澈為止。破碎后的菌體在4°C，18，000rpm/min離心30分鐘使破碎后的細胞碎片與目標融合蛋白溶液分開。取上清液直接上到用PBS緩沖液平衡好的N1-NTA離子親和層析柱中。上樣結束后，用PBS+50mM咪唑充分清洗去除雜蛋白(100ml)。然后用300mM咪唑洗脫并收集目的蛋白(10ml)。將收集的蛋白用濃縮管換緩沖液至20mMTris-HC17.5，150mMNaCl,lmM DTT。加入適量的TEV酶進行酶切，4°C過夜(視目標蛋白穩(wěn)定性而定)。酶切后跑SDS-PAGE檢測酶切效率，若未有切干凈則適量補充TEV酶繼續(xù)酶切至基本切完為止。酶切完成后的樣品再次過Ni離子親和柱，用IOml的20mM咪唑清洗介質。收集流穿和20mM咪唑洗脫的蛋白。收集的蛋白樣品濃縮，加載到用緩沖液(20mM Tris-HC17.5,150mM NaCl,ImM DTT)充分平衡的分子篩(Superdex G75，120ml)，收集蛋白樣品。分子篩和SDS-PAGE電泳結果表明目的蛋白以均一形式存在。對于SFTSV-N/蘇拉明復合物的制備，將蘇拉明(Sigma)與SFTSV-N蛋白以L2: I的比例(摩爾比)混合孵育1_2小時后，再次過分子篩(SuperdexG75,120ml)以去除未結合的蘇拉明，獲得SFTSV-N/蘇拉明復合物。以與上述制備SFTSV-N蛋白的方法相同的方法制備Buenaventura病毒(布埃納文圖拉病毒)和Granada病毒(格拉納達病毒)的N蛋白(BUEV-N和GRAV-N ；GenBank號分別為:GI =146336910和G1:308197170 ；BUEV-N的氨基酸序列見SEQ ID N0.3，其編碼核酸序列見SEQ ID N0.4 ；GRAV-N的氨基酸序列見SEQ ID N0.5，其編碼核酸序列見SEQ IDN0.6)。實施例2、基于熒光的熱量遷移實驗篩選SFTSV-N的潛在抑制劑基于突光的熱量遷移(Fluorescence-based Thermal Shift, FTS)實驗是新近發(fā)展起來的一種基于熒光技術的實驗檢測方法。檢測工作原理是利用蛋白質對環(huán)境變化敏感的突光染料，如Sypro Orange,來監(jiān)測體系中蛋白質自身的熱穩(wěn)定性以及可能影響蛋白質熱穩(wěn)定性的相關因子，如相互作用蛋白、緩沖液以及配體等。該技術將Sypro Orange染料的聞度敏感性和可反映蛋白質折置狀態(tài)的特性，以及可以在小體積中反應和檢測等特點，與高通量操作并可以進行熒光信號檢測的real-time PCR相結合。該技術可以通過對體系中蛋白質溶解曲線的檢測，實現(xiàn)對上述的蛋白質及其穩(wěn)定性相關因子的快速高通量篩選與檢測(參見參考文獻[12]、[13]和[14])。該技術的運用包括蛋白結構的研究，特別適用于蛋白結晶條件的摸索和優(yōu)化；蛋白相互作用研究，鑒定蛋白配體，后續(xù)結晶實驗；優(yōu)化蛋白生產、純化和保存條件；蛋白相關藥物的篩選等多領域中的應用日益拓寬和深入。本發(fā)明便是采用基于熒光的熱量遷移實驗來篩選潛在小分子抑制劑，篩選實驗是在自動化流水工作站上進行的。該流水線采用Echo550聲音傳導機器人(Labcyte)來增加小分子化合物，Mosq uito機器人(TTP Labtech)來分配蛋白，之后在實時PCR儀CFX384(Bio-Rad Laboratories)進行熱量掃描并檢測熒光。本實驗在384孔PCR板上運行，每孑L 10 μ I 包含 Hepes 緩沖液(20mM Hepes, ρΗ7.5，150mM NaCl)和 I μ g SFTSV-N 蛋白和10nl5000XSypro Orange (Invitrogen)染料。化合物添加完成之后以透光膜將PCR板封口，混勻并離心。熱量掃描從10到95°C，溫度升高速度為1.50C /min，每IOsec記錄一次熒光值。數(shù)據分析和報告產生由自制軟件excel FTS完成。SFTSV-N蛋白篩選了庫容量為2000個分子的 Spectrum collection(MicroSource Discovery Systems, Inc)中的 1600 個。首批篩選有6個化合物有溫度遷移，其中最明顯的是蘇拉明，具有可達12度的遷移，在5 μ M濃度下便開始達到最高值，如圖1A和IB所示。說明蘇拉明能以很強的親和力與SFTSV-N蛋白相結合，從而使SFTSV-N蛋白更難去折疊，即蛋白變得更穩(wěn)定。實施例3、ITC (等溫滴定量熱法)驗證SFTSV-N與蘇拉明的相互作用采用ITC法進一步驗證蘇拉明與SFTSV-N蛋白的相互作用。采用透析法將如實施例I中所述制備的SFTSV-N蛋白樣品的緩沖液更換為Tris緩沖液(20mM Tris-HCl,pH8.0，200mM NaCl,2mM DTT)。蛋白濃度通過A280nm光吸收法測定。滴定前蛋白及蘇拉明(Sigma)均經過4°C、18，OOOXg離心10分鐘以去除可能的碎片和氣泡。熱量滴定在MicroCalITC200儀器(Microcal Inc.，Northampton, MA)上進行，反應溫度為 25°C。將 50 μ M SFTSV-N 蛋白反應物放置在300 μ I樣品室中，500 μ M的蘇拉明采用注射法分20次，每次2 μ I (第一次注射0.5 μ I)，間隔120秒。數(shù)據采用ORIGIN軟件分析，并計算結合常數(shù)(Ka)、熱含量變化(DH)、化學計量(N)。結果發(fā)現(xiàn)SFTSV-N與蘇拉明具有很高的親和力，Kd值為0.44 μ Μ，如圖1C所示。實施例4、蘇拉明特異性結合布尼亞病毒科白蛉病毒屬病毒N蛋白我們利用如在實施例2中所述的FTS方法發(fā)現(xiàn)蘇拉明與布尼亞家族白蛉病毒屬成員Buenaventura病毒和Granada病毒的核蛋白BUEV-Pv^P GRAV-N(如以上實施例1中所述方法制備)具有6°C左右的遷移(圖2A)，該結果表明蘇拉明也能與BUEV-N和GRAV-N蛋白結合從而增加了它們的穩(wěn)定性。利用如在實施例3中所述的ITC實驗檢測蘇拉明與上述BUEV-N和GRAV-N蛋白的親和力分別為2.02 μ M和2.48μΜ(圖2B、2C)。同樣利用如在實施例2中所述的FTS方法，我們發(fā)現(xiàn)變復性法全部去除了 RNA的SFTSV-N也能結合蘇拉明(圖2D),而不與布尼亞家族其它病毒屬如正布尼亞病毒、內羅病毒或漢坦病毒等病毒的N蛋白相結合(圖2E);此外，我們還發(fā)現(xiàn)蘇拉明不能與A型流感病毒、狂犬病毒、拉沙病毒以及HIV的核衣殼等蛋白相結合(圖2E)。因此，蘇拉明是特異性地結合布尼亞家族白蛉病毒屬病毒的N蛋白。實施例5、蘇拉明抑制SFTSV復制實驗通過包括以下步驟的方法驗證蘇拉明對SFTSV復制的抑制作用:I)細胞培養(yǎng):非洲綠猴腎細胞(Vero細胞，ATCC，CCL_81)是一種SFTSV易感細胞，其是經獼猴腎細胞培養(yǎng)衍化后產生的。Vero細胞最適培養(yǎng)溫度為37°C。培養(yǎng)條件為貼壁:高糖DMEM+10% FBS+5mM谷胺酰胺及雙抗青霉素-鏈霉素(在細胞培養(yǎng)液中推薦的青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.lmg/ml)。需要CO2，培養(yǎng)箱中也需要放水來保持濕度。 2)細胞傳代:棄去廢液，用PBS輕洗一次，然后加入0.02% EDTA與0.25%胰蛋白酶消化，輕搖培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面，即將其吸除或棄去消化30秒，然后吸去，再讓殘余的EDTA/胰蛋白酶作用30秒，鏡下觀察細胞變圓，就可加含10%血清的DMEM終止消化，反復吹打至細胞都成為單個懸浮細胞即可。12小時-24小時90%以上細胞貼壁。Vero細胞傳代時為80-90%融合度，傳代比例為1: 3到1: 6。3)細胞復蘇:從液氮罐中取出凍存管，立即投入37°C水浴，并不斷的搖動，使之迅速融化。將溶解的細胞凍存管取出，用酒精消毒后打開，吸出溶有細胞的凍存液，加入事先裝好培養(yǎng)液(37°C預熱，8 10倍體積)離心管內，稍微吹打混勻，然后IOOOrpm離心5min，去除上清，加入適量培養(yǎng)液，吹打成細胞懸液，以IXlO5個細胞/mL的密度接種于T25培養(yǎng)瓶內，在37 °C、5 % CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。4)病毒感染和給藥:將Vero細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，當細胞生長至85%融合度時，將100 μ I的IOOTCId50的SFTSV病毒(ΗΒ29，見參考文獻[2])加入每孔細胞中，孵育I小時后，清洗感染的細胞以去除未結合的病毒。之后將蘇拉明(以肝素(heparin)為對照，同蘇拉明一樣肝素也是攜帶強負電的小分子)以4個重復孔，每孔分別為0.8,0.4、
0.2,0.1,0.05和Oy g/μ I的濃度梯度添加到預吸收SFTSV病毒的Vero細胞中。培養(yǎng)液每3天更換一次(補加同樣量的蘇拉明)，采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的SFTSV病毒量。ELISA是以抗原抗體免疫學反應為基礎，將抗原抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種高敏感性實驗技術。抗原-抗體的反應在一種固相載體聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去未結合的游離反應物，從而保證實驗結果的特異性與穩(wěn)定性。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。操作步驟如下:包被是將抗SFTSV多克隆抗體包被在每個聚苯乙烯板的反應孔中4°C 12小時。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液PBST (1XPBS+0.5% Tween20)洗3次后，加入80 μ I實施例7的Vero細胞培養(yǎng)上清和20 μ I PBS,孵育I小時后，清洗ELISA板，并每孔添加100 μ 15%脫脂奶粉稀釋的HRP-偶聯(lián)的兔抗SFTSV-N抗體，37°C孵育I小時后再清洗。最后每孔添加100μ 13，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺TMB底物以顯色。每孔0D450的數(shù)值由酶標儀讀取。 結果:6天時檢測發(fā)現(xiàn)，較高劑量的蘇拉明(0.4yg/y l、0.8yg/y I)顯示了抑制效果(上清中的SFTSV病毒量相比對照減少)，更低劑量(0.2、0.1、0.05和Oyg/μ I)的效果與對照肝素相當(如圖4所示)。第9天時，0.8μ g/μ I劑量的蘇拉明仍對病毒有抑制效果(如圖4所示)。因此，0.8μ g/μ I的劑量便可以發(fā)揮持續(xù)的抑制病毒復制的效果。該結果表明小分子藥物蘇拉明能夠阻礙病毒SFTSV-N蛋白對基因組RNA的保護作用，從而影響SFTSV病毒的產生。 實施例6、SFTSV-N/蘇拉明復合物晶體結構解析實驗一、結晶篩選及晶體優(yōu)化初始篩選采用稀疏矩陣法(Sparse matrix screen)的策略來篩選晶體,商業(yè)化晶體篩選試劑盒包括 Hampton Research 公司的 Crystal Screenl&2, PEG/10N1&2, Index,SaltRxl&2以及Emerald BioSystem s公司的Wizardl, 2, 3和4等晶體篩選條件,所用溫度為25°C。采用懸滴氣相擴散法，將I μ I上述制備的SFTSV-N/蘇拉明復合物與等量結晶條件(5-8% PEG8000,0.1M NaAc (ρΗ4.3-4.7)，0.2Μ ZnAc2)混合，母液體積為 300 μ 1，25°C下兩三天即可獲得晶體。蛋白晶體經室內光源檢測獲得較好分辨率以后，用液氮凍存起來，送同步輻射實驗室進行數(shù)據收集。二、數(shù)據收集、處理和結構解析SFTSV-N/蘇拉明二元復合物數(shù)據收集是在100K溫度條件下使用日本KEK光子工廠(the Photon Factory, KEK, Japan)線站 BL17A 同步福射光源(λ = 0.97928 A )上進行衍射數(shù)據收集(檢測器:ADSC Q315CXD)。衍射數(shù)據的處理采用HKL2000程序[15]。結構解析方法為分子置換法Phaser程序[16]，模型是SFTSV_N(PDB code,4J4R) [17]0模型構建和反復的精修是交替采用Coot[18]、Phenix_refine[19]和Refmac[2°]進行。所有結構分子圖形由 Pymol [21]生成。三、結果分析2.30 A分辨率的蘇拉明與SFTSV-N 二元復合物五聚體結構(C2空間群)獲得解析(如圖5A)，數(shù)據收集及結構修正參數(shù)見以下表I。蘇拉明的頭部萘-1，3，5-三磺酸密度清晰可見，而其它部分則比較弱并且不連續(xù)(如圖5A、5B)。每個蘇拉明分子結合一分子SFTSV-N，這與ITC實驗結果相一致(圖1C)。蘇拉明的萘-1，3，5-三磺酸部分結合于SFTSV-N核心部分的中心形成的口袋內，通過3對氫鍵(K67-NZ與077-蘇拉明；T63_0與Ν53-蘇拉明；Ν66-Ν與078-蘇拉明)和靜電吸引力相結合(如圖5C)。詳細的相互作用見圖對蘇拉明周圍5.0 A內的氨基酸進行分析，我們發(fā)現(xiàn)在參與蘇拉明結合的16個氨基酸中，8是絕對保守，7個高度保守，僅一個氨基酸不保守(參見圖3:SFTSV-N與白蛉病毒屬其它同源N蛋白的序列比對結果)，表明蘇拉明采用非常相似的模式與白蛉病毒屬N蛋白相結合。表1.SFTSV-N/蘇拉明復合物數(shù)據收集和結構修正參數(shù)
權利要求
1.一種用于治療由布尼亞病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒屬(Phlebovirus)的病毒引起的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含蘇拉明(Suramin)作為活性成分。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒是發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)、布埃納文圖拉(Buenaventura)病毒或格拉納達(Granada)病毒。
3.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述由布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒引起的疾病是發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)。
4.蘇拉明在制備用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病是由布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒引起的。
5.根據權利要求4所述的用途，其中所述布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒是發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒、布埃納文圖拉病毒或格拉納達病毒。
6.根據權利要求4所述的用途，其中所述疾病是發(fā)熱伴血小板減少綜合征。
7.一種用于治療由布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒引起的疾病的試劑盒，所述試劑盒包含蘇拉明。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其中所述布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒是發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒、布埃納文圖拉病毒或格拉納達病毒。
9.根據權利要 求7所述的試劑盒，其中所述疾病是發(fā)熱伴血小板減少綜合征。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用小分子化合物抑制病毒復制。具體地，本發(fā)明公開了小分子化合物蘇拉明(Suramin)在制備用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病是由布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒引起的，并且具體地是由發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒引起的。
文檔編號A61K31/185GK103142566SQ20131005860
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月25日 優(yōu)先權日2013年2月25日
發(fā)明者劉志杰, 歐陽松應, 焦聯(lián)營, 牛峰峰, 欒棋浩, 尼爾·肖恩 申請人:中國科學院生物物理研究所