專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于稀土金屬化合物納米簇的合成方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及稀土金屬化合物納米簇的合成和成像領(lǐng)域，具體涉及稀土金屬化合物納米簇的合成方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，成像技術(shù)引起了科學(xué)家廣泛的興趣，被應(yīng)用于活體成像的研究中并取得了令人矚目的成果。Hayashi等利用熒光標(biāo)記腫瘤細(xì)胞建立的小動(dòng)物腫瘤模型和實(shí)時(shí)熒光成像系統(tǒng)，開(kāi)展了一系列實(shí)驗(yàn)。RobertMH通過(guò)體內(nèi)熒光蛋白標(biāo)記腫瘤細(xì)胞和高分辨率的小動(dòng)物熒光顯像系統(tǒng)則有可能觀察到腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程。但是這種技術(shù)仍然存在許多局限性，尤其是在體內(nèi)光照時(shí)產(chǎn)生的組織自發(fā)熒光和在斷波激發(fā)光照射下的弱的組織滲透性。為了克服這些困難，科學(xué)家研究了一系列發(fā)光納米材料，它們適用于活體成像并能避免內(nèi)在問(wèn)題，這種技術(shù)的關(guān)鍵是要求納米發(fā)光材料的發(fā)射光是在近紅外區(qū)域。納米顆粒已經(jīng)被作為發(fā)光探針用于光學(xué)成像，但是存在許多缺點(diǎn):首先，來(lái)自組織有機(jī)組成的自發(fā)熒光能導(dǎo)致弱的信噪比；另外，很難實(shí)現(xiàn)深度組織成像，因?yàn)閮?nèi)部組織的信號(hào)衰弱探針的發(fā)射光波長(zhǎng)要調(diào)整到組織透明的條件。在此波長(zhǎng)下，光的衰弱主要是由于光散射而不是被組織吸收，近紅外熒光納米顆粒的使用目前正在探索中，把它與目標(biāo)分子結(jié)合就有可能制成高靈敏的近紅外熒光成像造影劑。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供了稀土金屬化合物納米簇的合成方法及稀土金屬化合物納米簇可作為活體腫瘤影像劑以及其他生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。技術(shù)方案:針對(duì)目前現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，包括以下步驟:
I)將濃度為0.01-lmg/ml的鑭試劑和0.01-lmg/ml銪試劑混合溶液與腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C，含有5%C02共同孵育10-72小時(shí)合成稀土金屬化合物納米簇；2)用熒光光譜儀、共聚焦熒光顯微鏡等對(duì)稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行定性和定量分析；所述鑭試劑是氯化鑭、硝酸鑭、檸檬酸鑭、碳酸鑭、醋酸鑭或硫酸鑭中的一種。所述銪試劑是硝酸銪、硫酸銪、氯化銪、氟化銪、碳酸銪、醋酸銪中的一種。所述腫瘤細(xì)胞為肝癌、肺癌、宮頸癌、白血病、骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞株。上述方法制備的稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行腫瘤靶向成像的方法，包括以下步驟:I)構(gòu)建裸鼠腫瘤模型；2)將所述的稀土金屬化合物納米簇超聲分散后通過(guò)注射方法，注射到裸鼠腫瘤模型上，在裸鼠腫瘤模型上實(shí)現(xiàn)原位、實(shí)時(shí)腫瘤靶向高分辨成像；3)用活體熒光成像儀對(duì)腫瘤部位進(jìn)行腫瘤成像并對(duì)其進(jìn)行定性及定量分析。
上述步驟2)中的注射方法為尾靜脈注射、局部注射或穴位注射。上述步驟3)中的腫瘤成像為熒光成像、核磁成像、拉曼成像、CT成像、熱成像或超聲成像。上述方法制備的稀土金屬化合物納米簇在腫瘤靶向活體成像中的應(yīng)用。有益效果:(I)將一定濃度的氯化鑭和硝酸銪混合溶液與相關(guān)的細(xì)胞在一定條件下共同孵育合成納米簇，共聚焦顯微鏡檢測(cè)表明熒光明顯增強(qiáng)。(2)將腫瘤細(xì)胞合成的稀土金屬化合物納米簇超聲分散后通過(guò)注射方法，在移植腫瘤裸鼠等動(dòng)物模型上實(shí)現(xiàn)了原位、實(shí)時(shí)腫瘤靶向性高分辨成像?；铙w熒光成像儀等檢測(cè)表明具有很好的靶向成像效果。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和研制了鑭、銪等稀土金屬離子靶向腫瘤細(xì)胞合成生物相容性良好的納米簇探針，實(shí)現(xiàn)了活體腫瘤部位的高分辨率成像。由于該方法具有操作方便、結(jié)果直觀、靈敏度高、靶向性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期檢測(cè)與診斷，也可以應(yīng)用在深部腫瘤、大動(dòng)物等活體腫瘤追蹤觀察成像等研究中，具有潛在的臨床疾病追蹤治療成像的應(yīng)用價(jià)值。由于鑭、銪等稀土金屬化合物納米簇成像為本研究組在細(xì)胞內(nèi)和動(dòng)物活體內(nèi)首次合成并用于成像檢測(cè)。因此國(guó)內(nèi)外專(zhuān)利及其他文獻(xiàn)沒(méi)有涉及該發(fā)明的有關(guān)報(bào)道。該發(fā)明可實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷、原位、實(shí)時(shí)腫瘤早期檢測(cè)與診斷及熒光、拉曼、超聲、CT和核磁等成像，可進(jìn)行多形態(tài)與多模態(tài)的同步檢測(cè)，具有廣闊的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)組共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1對(duì)照組共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果圖；圖3是實(shí)驗(yàn)組合對(duì)照組熒光強(qiáng)度對(duì)比圖

圖4是不同硝酸銪濃度配比所得納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度5是硝酸銪和氯化鑭摩爾比為1/19時(shí)所得納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，包括以下步驟:I)將1/17、1/18、1/19、1/20、1/21、1/22、1/23等不同濃度配比的硝酸銪和氯化鑭
混合溶液與肝癌細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C，含有5%C02共同孵育10小時(shí)合成稀土金屬化合物納米簇；2)用熒光光譜儀對(duì)稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行定量分析；選用肝癌細(xì)胞(!fepG2)作為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞(H印G2)按照1.6X 105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后加入已滅菌并用新鮮無(wú)菌的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋的含有不同濃度配比的氯化鑭和硝酸銪混合溶液在細(xì)胞培養(yǎng)箱中共同孵育10小時(shí)合成稀土金屬化合物納米簇。培養(yǎng)時(shí)間終止后向每孔加入磷酸緩沖溶液(PBS，pH=7.4)沖洗2-3次。將所得細(xì)胞收集超聲破碎，1000轉(zhuǎn)離心10分鐘，然后用熒光光譜儀對(duì)稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，氯化鑭和硝酸銪不同濃度比下的熒光強(qiáng)度，當(dāng)氯化鑭和硝酸銪的濃度比為19:1時(shí)，合成的稀土金屬化合物納米簇具有較強(qiáng)的熒光。圖5為硝酸銪和氯化鑭摩爾比為1:19時(shí)在不同波長(zhǎng)下所得納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度圖，從圖中可以看出當(dāng)730nm時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。實(shí)施例2一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，包括以下步驟:I)將濃度為lmg/ml的氯化鑭和0.01mg/ml硝酸銪混合溶液與肝癌細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C，含有5%C02共同孵育10小時(shí)合成稀土金屬化合物納米簇；2)用熒光光譜儀、共聚焦熒光顯微鏡等對(duì)稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行定性和定量分析；選用肝癌細(xì)胞(!fepG2)作為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞(H印G2)按照1.6X 105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后加入已滅菌并用新鮮無(wú)菌的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋的含有濃度為0.0 lmg/ml的氯化鑭和lmg/ml硝酸銪混合溶液。對(duì)照組將培養(yǎng)基中的肝癌細(xì)胞(IfepG2)按照1.6X105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h。培養(yǎng)時(shí)間終止后向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組的每孔加入磷酸緩沖溶液(PBS, pH=7.4)沖洗2-3次。然后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。圖1所示細(xì)胞具有較強(qiáng)熒光，在細(xì)胞內(nèi)部具有納米顆 粒聚集，圖2所示細(xì)胞沒(méi)有明顯熒光。二者熒光強(qiáng)度比較如圖3所示。實(shí)施例3一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，其特征在于包括以下步驟:I)將濃度為lmg/ml的氯化鑭和0.0 lmg/ml硝酸銪混合溶液與乳腺癌細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C，含有5%C02共同孵育24小時(shí)合成稀土金屬化合物納米簇；2)用熒光光譜儀、共聚焦熒光顯微鏡等對(duì)稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行定性和定量分析；構(gòu)建裸鼠皮下接種乳腺癌模型，乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)24h后加入已滅菌并用新鮮無(wú)菌的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋過(guò)的氯化鑭和硝酸銪混合溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)制得稀土金屬化合物納米簇，將含有稀土金屬化合物納米簇的溶液超聲分散后，通過(guò)尾靜脈注射方法注射到裸鼠體內(nèi)，24h后，對(duì)裸鼠進(jìn)行活體熒光成像。實(shí)驗(yàn)表明相關(guān)納米簇可對(duì)腫瘤部位實(shí)現(xiàn)靶向成像，一定濃度稀土金屬化合物納米簇可對(duì)腫瘤部位實(shí)現(xiàn)高分辨快速靶向成像。實(shí)施例5一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，其特征在于包括以下步驟:I)將濃度為0.5mg/ml的硫酸鑭和0.5mg/ml氯化銪混合溶液與肺癌細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C，含有5%C02共同孵育72小時(shí)合成稀土金屬化合物納米簇；2)用熒光光譜儀、共聚焦熒光顯微鏡等對(duì)稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行定性和定量分析；構(gòu)建裸鼠皮下接種肺癌模型，肺癌細(xì)胞培養(yǎng)72h后加入已滅菌并用新鮮無(wú)菌的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋過(guò)的硫酸鑭和氯化銪混合溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)制得稀土金屬化合物納米簇，將含有稀土金屬化合物納米簇的溶液超聲分散后，通過(guò)尾靜脈注射方法注射到裸鼠體內(nèi)，72h后，對(duì)裸鼠進(jìn)行活體熒光成像。實(shí)驗(yàn)表明相關(guān)納米簇可對(duì)腫瘤部位實(shí)現(xiàn)靶向成像，一定濃度稀土金屬化合物納米簇可對(duì)腫瘤部位實(shí)現(xiàn)高分辨快速靶向成像。實(shí)施例6構(gòu)建裸鼠藥物誘導(dǎo)卵巢腫瘤模型，向裸鼠體內(nèi)通過(guò)尾靜脈注射方法直接注射制得的稀土金屬化合物納米簇0.lmmol/ml，24h后，對(duì)裸鼠進(jìn)行靶向熒光成像并對(duì)成像結(jié)果進(jìn)行定性及定量分析。因?yàn)橄⊥两饘偌{米簇在近紅外區(qū)域發(fā)熒光，能制成高靈敏的近紅外熒光成像造影劑。本發(fā)明的一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法只有在一定的摩爾配比下才能制得較強(qiáng)的近紅外熒光納米簇，該納米簇是首次在腫瘤細(xì)胞內(nèi)合成，所制得的納米簇可以在近紅外區(qū)域有較強(qiáng)熒光，所以能制成高靈敏的近紅外熒光成像造影劑。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
權(quán)利要求
1.一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將濃度為0.01-lmg/ml的鑭試劑和0.01-lmg/ml銪試劑混合溶液與腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C，含有5%C02共同孵育10-72小時(shí)合成稀土金屬化合物納米簇； 2)用熒光光譜儀、共聚焦熒光顯微鏡等對(duì)稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行定性和定量分析。
2.如權(quán)利要求1所述的一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，其特征在于:所述鑭試劑是氯化鑭、硝酸鑭、檸檬酸鑭、碳酸鑭、醋酸鑭或硫酸鑭中的一種。
3.如權(quán)利要求1所述的一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，其特征在于:所述銪試劑是硝酸銪、硫酸銪、氯化銪、氟化銪、碳酸銪、醋酸銪中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述的一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法，其特征在于:所述腫瘤細(xì)胞為肝癌、肺癌、宮頸癌、白血病、骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞株。
5.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的方法制備的稀土金屬化合物納米簇進(jìn)行腫瘤靶向成像的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)構(gòu)建裸鼠腫瘤模型； 2)將所述的稀土金屬化合物納米簇超聲分散后通過(guò)注射方法，注射到裸鼠腫瘤模型上，在裸鼠腫瘤模型上實(shí)現(xiàn)原位、實(shí)時(shí)腫瘤靶向高分辨成像； 3)用活體熒光成像儀對(duì)腫瘤部位進(jìn)行腫瘤成像并對(duì)其進(jìn)行定性及定量分析。
6.如權(quán)利要求5所述的腫瘤靶向成像的方法，其特征在于所述步驟2)中的注射方法為尾靜脈注射、局部注射或穴位注`射。
7.如權(quán)利要求5所述的腫瘤靶向成像的方法，其特征在于所述步驟3)中的腫瘤成像為突光成像、核磁成像、拉曼成像、CT成像、熱成像或超聲成像。
8.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的方法制備的稀土金屬化合物納米簇在腫瘤靶向活體成像中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的方法制備的稀土金屬化合物納米簇在制備造影劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種稀土金屬化合物納米簇的合成方法及該稀土金屬化合物納米簇在腫瘤等病變部位靶向成像方面和制備造影劑中的應(yīng)用。本發(fā)明制得的稀土金屬化合物納米簇粒徑小、滲透性好、熒光穩(wěn)定性高、靈敏度高、靶向性強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的精確定位；本發(fā)明的稀土金屬化合物納米簇通過(guò)生物腫瘤細(xì)胞直接合成，具有很好的生物相容性；本發(fā)明操作方便、結(jié)果直觀，可進(jìn)行多形態(tài)與多模態(tài)的同步分析檢測(cè)，具有廣闊的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K49/22GK103143037SQ20131006733
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者王雪梅, 高生平, 李水紅 申請(qǐng)人:東南大學(xué)