專利名稱：活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法與成形系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法與成形系統(tǒng)。屬于組織工程學(xué)與軟骨組織修復(fù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
因創(chuàng)傷、運(yùn)動(dòng)損傷、炎癥和組織退變等原因引起的關(guān)節(jié)組織缺損或損傷在臨床上十分常見(jiàn)。由于軟骨組織中沒(méi)有血管、神經(jīng)和淋巴系統(tǒng)，軟骨細(xì)胞被限制在由膠原和蛋白多糖組成的致密陷窩內(nèi)，自身代謝活力較低，因此關(guān)節(jié)軟骨再生與自我修復(fù)能力極為有限。關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷，如果得不到適當(dāng)?shù)闹委?，損傷的軟骨不僅不能被透明軟骨修復(fù)，反而可能因?yàn)槟p加重而引起軟骨下骨損傷，發(fā)展成為骨性關(guān)節(jié)疾病，導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)功能紊亂甚至整個(gè)關(guān)節(jié)功能喪失。因此，如何實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損的修復(fù)和功能重建成為目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)與快速發(fā)展，為關(guān)節(jié)軟骨組織缺損修復(fù)提供了新的思路和方法。組織工程的本質(zhì)在于通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞-支架材料的復(fù)合體來(lái)修復(fù)或再生缺損的組織或器官。由于人體關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨的細(xì)胞組成與空間結(jié)構(gòu)各不相同，如何構(gòu)建理想的骨軟骨一體化支架以及實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與支架材料的有效復(fù)合是利用組織工程技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨組織損傷的關(guān)鍵。理想的組織工程骨軟骨一體化支架應(yīng)當(dāng)具備一下特點(diǎn):(I)在支架材料組成方面，應(yīng)當(dāng)具有良好的生物相容性與細(xì)胞親和性以利于細(xì)胞黏附、增殖和分化。同時(shí)，軟骨下骨層支架應(yīng)當(dāng)具備良好的力學(xué)強(qiáng)度以支撐缺損部位的負(fù)載，并未軟骨支架的固定提供有效的支撐；(2)在支架物理結(jié)構(gòu)方面，一體化支架的三維貫通孔結(jié)構(gòu)在支架高度方向應(yīng)該具有梯度變化，以滿足骨與軟骨組織細(xì)胞對(duì)生存環(huán)境的不同要求；(3)在組織培養(yǎng)方面，細(xì)胞在支架內(nèi)部應(yīng)當(dāng)可以實(shí)現(xiàn)空間定位和立體分布的可控操作，以滿足具有不同功能、結(jié)構(gòu)要求的復(fù)雜組織和器官的修復(fù)或再生。目前，常用的組織工程骨軟骨一體化支架制備工藝組要分為傳統(tǒng)制備工藝和快速成形工藝兩大類。利用層壓、纖維粘接與熔融鑄型等傳統(tǒng)工藝制備的一體化支架主要依靠手工和模具成形，支架內(nèi)部的孔隙貫通度不佳，支架孔隙率與孔徑分布不可控，支架結(jié)構(gòu)與性能的制備重復(fù)性較差，難以滿足關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)的要求；選擇性激光燒結(jié)、低溫沉積成形、立體光刻和三維打印等快速成形制備工藝能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)工藝的不足，制備出結(jié)構(gòu)復(fù)雜、孔隙率與孔徑大小可控且重復(fù)性好的一體化支架。但是，由于各種快速成形工藝對(duì)加工條件與所適用的材料種類都有嚴(yán)格的要求；無(wú)法用于成形生物性能優(yōu)異的天然生物材料；難以獲得精度要求較高的組織工程支架。由于材料的成形需要利用專用的工具在較為極端的溫度環(huán)境下進(jìn)行，因此利用快速成形工藝制備的組織工程支架只適用于先成形支架后接種細(xì)胞的傳統(tǒng)組織工程培養(yǎng)模式。該培養(yǎng)模式下，細(xì)胞只能由支架表面向內(nèi)部單向生長(zhǎng)，無(wú)法滿足自然組織中細(xì)胞三維均衡生長(zhǎng)的要求；在培養(yǎng)過(guò)程中，難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在支架內(nèi)部立體空間的可控定位與分布，不利于具有功能梯度要求的組織或器官生成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有組織工程骨軟骨支架在制備與細(xì)胞培養(yǎng)方面的不足，提供一種活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法和成形系統(tǒng)，成形具有細(xì)胞活性、良好力學(xué)性能以及梯度結(jié)構(gòu)的骨軟骨一體化支架，為成形后的細(xì)胞提供適宜的生存環(huán)境，便于細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法，其特征在于操作步驟如
下:
O 將離子濃度敏感材料與促凝膠化天然生物材料分別制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6^4.4%和18 22%的水溶液，經(jīng)滅菌后備用；
2)將種子細(xì)胞與所制備的離子濃度敏感材料和促凝膠化天然生物材料水溶液按照質(zhì)量比為1:5:2.5 1:5:10充分混合均勻，制備成凝膠狀細(xì)胞-生物材料混合單元；將合成高分子生物材料經(jīng)過(guò)消毒，加熱到熔融狀態(tài)；將細(xì)胞-生物材料混合單元與熔融態(tài)高分子生物材料分別倒入不同的料筒中。根據(jù)事先設(shè)計(jì)好的支架結(jié)構(gòu)與成形路徑，在4°C ±0.5°C環(huán)境溫度中通過(guò)計(jì)算 機(jī)系統(tǒng)的控制將細(xì)胞-生物材料混合單元與熔融態(tài)高分子生物材料由同軸噴頭擠出，在空間的指定位置逐層增量成形一體化梯度支架中三維通孔尺寸較大的軟骨下骨層支架部分；
3)當(dāng)軟骨下骨層支架成形完成后關(guān)閉熔融態(tài)高分子生物材料的供料動(dòng)力，使噴頭只擠出細(xì)胞-生物材料混合單元，在軟骨下骨層支架的基礎(chǔ)上繼續(xù)增量成形一體化梯度支架中三維通孔直徑較小的軟骨層支架部分，最終得到具有細(xì)胞活性的骨軟骨一體化梯度支架；
4)在逐層增量成形一體化梯度支架的過(guò)程中，每完成一層支架材料的擠出成形后，支架材料接收平臺(tái)就下降一定高度，使剛成形的支架層浸入到含有觸發(fā)離子的水浴溶液中，離子濃度敏感材料與溶液產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)并為支架材料中的種子細(xì)胞提供多水的生存環(huán)境。本發(fā)明所述的離子濃度敏感材料為海藻酸鈉，促使材料進(jìn)行凝膠化轉(zhuǎn)變的天然生物材料為明膠，所述的合成高分子生物材料為分子量為15，000的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)。所述的觸發(fā)離子為Ca2+,水浴溶液為飽和氯化I丐溶液。所述的一體化梯度支架是由細(xì)胞-生物材料混合單元構(gòu)成、孔隙直徑10(Γ150 μ m的軟骨層支架與細(xì)胞-生物材料混合單元包裹PLGA構(gòu)成的包芯材料組成、孔徑尺寸20(Γ250 μ m的軟骨下骨層支架經(jīng)過(guò)逐層堆積成形得到的。一種活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形系統(tǒng)，應(yīng)用于上述方法實(shí)現(xiàn)成形，包括:三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、同軸噴頭擠出單元、氣泵、支架材料接收板、水浴池、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)和料筒，其特征在于:所述氣泵、同軸噴頭擠出單元、料筒安裝在三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)上，處于水浴池上方，可實(shí)現(xiàn)X-Y平面運(yùn)動(dòng)；支架材料接收板與三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)聯(lián)接，可實(shí)現(xiàn)Z方向運(yùn)動(dòng)，且支架材料接收板置于水浴池中；計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)與三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)相連，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的支架模型以及路徑規(guī)劃，控制同軸噴頭擠出單元在X-Y平面的運(yùn)動(dòng)軌跡以及每成形一層支架后支架材料接收板在水浴池中下降的高度，以實(shí)現(xiàn)支架結(jié)構(gòu)與三維通孔的可控成形并使已成形的支架浸入水浴中；氣泵通過(guò)供氣軟管分別與裝有細(xì)胞-生物材料混合單元和熔融高分子生物材料的料筒相連，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)對(duì)氣泵供氣的啟、停控制，實(shí)現(xiàn)不同材料的有序擠出，最終成形由不同材料構(gòu)成，具有梯度結(jié)構(gòu)變化的活性骨軟骨一體化梯度支架。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有以下突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步:
I)本發(fā)明引入增量成形工藝用于成形含有細(xì)胞的骨軟骨一體化梯度支架的制備。基于離散-堆積成形原理的增量成形工藝是一種在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)精確控制下能夠成形具有復(fù)雜內(nèi)、外形狀結(jié)構(gòu)要求的高柔性成形工藝。將該工藝與同軸噴頭相結(jié)合，可用于成形由多種材料組成、具有復(fù)雜梯度結(jié)構(gòu)要求的組織、器官支架。2)本發(fā)明將細(xì)胞作為可成形生物材料加入到組織工程支架的制備過(guò)程中。本發(fā)明所述由離子敏感材料與促凝膠化天然生物材料混合制得的凝膠狀單元材料能夠?qū)⒋罅康乃宙i定在凝膠材料中，能夠?yàn)榧?xì)胞提供基本的生存環(huán)境。同時(shí)，凝膠態(tài)的材料具有良好的可成形性，能夠在適宜細(xì)胞生存的溫度環(huán)境范圍之內(nèi)進(jìn)行材料成形，不僅保證在支架成形前后細(xì)胞都處在適合的生存環(huán)境中，而且還能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞-生物材料混合單元的三維立體成形。3)將同軸噴頭與擠出成形工藝相結(jié)合，利用細(xì)胞-生物材料混合單元包裹PLGA所組成的同軸材料成形一體化支架中的軟骨下骨層部分，軟骨層支架則完全由細(xì)胞-生物材料混合單元構(gòu)成。合成高分子生物材料能夠?yàn)橹Ъ芴峁┧璧牧W(xué)性能，為軟骨層再生提供牢固的力學(xué)支撐，同時(shí)在合成高分子生物材料外層包裹一層細(xì)胞-生物材料混合單元也同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)軟骨下骨層支架的表面改性，提高了支架的生物相容性與細(xì)胞親和性；完全由細(xì)胞-生物材料混合單元構(gòu)成的軟骨層支架因含有大量的種子細(xì)胞而有利于軟骨組織的再生。4)本發(fā)明所述成形工藝可一次性成形由不同材料組成，具有梯度結(jié)構(gòu)變化的骨軟骨一體化梯度支架，支架中軟骨與軟骨下骨層之間不存在明顯的界面力學(xué)缺陷。5)本發(fā)明所述的工藝方法將工程制造所適用的材料范圍擴(kuò)展到具有生物活性的生命體領(lǐng)域。該工藝方法不僅能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的直接三維受控組裝成形，解決了利用組織工程技術(shù)進(jìn)行組織與器官再生時(shí)無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在三維空間中的精確定位與立體生長(zhǎng)；同時(shí)，包裹合成高分子材料的同軸支架纖維不但具有生物活性，還彌補(bǔ)了細(xì)胞-生物材料混合單元自身力學(xué)性能不足的缺點(diǎn)。本發(fā)明的提出是對(duì)傳統(tǒng)加工、制造工藝概念的重要突破，為具有細(xì)胞活性的骨、軟骨類硬支架的制備提供了新的思路。


圖1為活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形工藝路線圖。圖2為活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例結(jié)合附圖詳述如下:
實(shí)施例一: 參見(jiàn)圖1，本活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法，其特征在于操作步驟如下:
1)將離子濃度敏感材料與促凝膠化天然生物材料分別制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6^4.4%和18 22%的水溶液，經(jīng)滅菌后備用；
2)將種子細(xì)胞與所制備的離子濃度敏感材料和促凝膠化天然生物材料水溶液按照質(zhì)量比為1:5:2.5 1:10:10充分混合均勻，制備成凝膠狀細(xì)胞-生物材料混合單元；將合成高分子生物材料經(jīng)過(guò)消毒，加熱到熔融狀態(tài)；將細(xì)胞-生物材料混合單元與熔融態(tài)高分子生物材料分別倒入不同的料筒中；根據(jù)事先設(shè)計(jì)好的支架結(jié)構(gòu)與成形路徑，在4°C ±0.5°C環(huán)境溫度中通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的控制將細(xì)胞-生物材料混合單元與熔融態(tài)高分子生物材料由同軸噴頭一同擠出，在空間的指定位置逐層增量成形一體化梯度支架中三維通孔尺寸較大的軟骨下骨層支架部分；
3)當(dāng)軟骨下骨層支架成形完成后，關(guān)閉熔融態(tài)高分子生物材料的供料動(dòng)力，使噴頭只擠出細(xì)胞-生物材料混合單元，在軟骨下骨層支架的基礎(chǔ)上繼續(xù)增量成形一體化梯度支架中三維通孔尺寸較小的軟骨層支架部分，最終得到具有細(xì)胞活性的骨軟骨一體化梯度支架；
4)在逐層增量成形一體化梯度支架的過(guò)程中，每完成一層支架材料的擠出成形后，支架材料接收平臺(tái)就下降一定高度，使剛成形的支架層浸入到含有觸發(fā)離子的水浴溶液中，離子濃度敏感材料與溶液產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)并為細(xì)胞提供多水的生存環(huán)境。實(shí)施例二:
本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，特別之處是:所述的活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法，所述步驟I)中的離子濃度敏感材料為海藻酸鈉，促使材料進(jìn)行凝膠化轉(zhuǎn)變的天然生物材料為 明膠，合成高分子生物材料為分子量為15，000的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA);所述步驟2)和步驟3)中的一體化梯度支架中，三維通孔尺寸較小的軟骨層支架由凝膠態(tài)細(xì)胞-生物材料混合單元構(gòu)成，三維貫通孔尺寸為10(Γ 50μπι以利于軟骨生成；三維通孔尺寸較大的軟骨下骨層支架由包芯材料組成:內(nèi)層的主體材料為PLGA，在主體材料的表面包裹一層細(xì)胞-生物材料混合單元,三維貫通孔尺寸為20(Γ250μπι以利于血管長(zhǎng)入；所述步驟4)中的觸發(fā)離子為Ca2+，水浴溶液為飽和氯化鈣溶液；在所述步驟4)中，每成形一層支架后，接收平臺(tái)下降的高度即支架浸入水浴溶液中的高度為單層支架高度的90%，以保證下一層支架與已成形支架層之間材料能夠?qū)崿F(xiàn)有效粘接。實(shí)施例三:
參見(jiàn)圖2，本活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形系統(tǒng)，應(yīng)用于所述的活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法實(shí)現(xiàn)成形，包括:三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I )、同軸噴頭擠出單元(2)、氣泵(3)、支架材料接收板(4)、水浴池(5)、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)和料筒
(7)，其特征在于:所述氣泵(3)、同軸噴頭擠出單元(2)、料筒(7)安裝在三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)上，處于水浴池(5)上方，可實(shí)現(xiàn)X-Y平面運(yùn)動(dòng)；支架材料接收板(4)與三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)聯(lián)接，可實(shí)現(xiàn)Z方向運(yùn)動(dòng)，且支架材料接收板(4)置于水浴池(5)中；計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)與三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)相連，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的支架模型以及路徑規(guī)劃，控制同軸噴頭擠出單元(2)在X-Y平面的運(yùn)動(dòng)軌跡以及每成形一層支架后支架材料接收板(4)在水浴池(5)中下降的高度，以實(shí)現(xiàn)支架結(jié)構(gòu)與三維通孔的可控成形并使已成形的支架浸入水浴中；氣泵(3)通過(guò)供氣軟管分別與裝有細(xì)胞-生物材料混合單元和熔融高分子生物材料的料筒(7)相連，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)對(duì)氣泵(3)供氣的啟、?？刂?，實(shí)現(xiàn)不同材料的有序擠出，最終成形由不同材料構(gòu)成，具有梯度結(jié)構(gòu)變化的活性骨軟骨一體化梯度支架。實(shí)施例四:
附圖1所示為本實(shí)施例的工藝路線圖。首先將離子濃度敏感材料與促凝膠化天然生物材料分別制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6^4.4%和18 22%的生物材料水溶液，將種子細(xì)胞、離子濃度敏感材料和促凝膠化天然生物材料溶液按照質(zhì)量比為1:5:2.5^1:10:10充分混合均勻，制備成凝膠狀細(xì)胞-生物材料混合單元；將高分子生物材料經(jīng)過(guò)消毒后加熱到熔融狀態(tài)；將細(xì)胞-生物材料混合單元與熔融態(tài)高分子生物材料分別倒入不同的料筒中。根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的一體化梯度支架的三維模型信息，按照所定義的結(jié)構(gòu)特征、材料組成以及路徑規(guī)劃，利用計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)同軸噴頭在空間的指定位置將細(xì)胞-生物材料混合單元與高分子生物材料擠出成形，通過(guò)逐層堆積完成活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形。附圖2所示為實(shí)現(xiàn)本實(shí)施例所述成形方法的成形系統(tǒng)示意圖。整個(gè)成形系統(tǒng)包括:三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)、同軸噴頭擠出單元(2 )、氣泵(3 )、支架材料接收板(4)、水浴池(5 )、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)和料筒(7)。計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)與三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)相連，用于精確控制同軸噴頭擠出單元(2)在X-Y平面的運(yùn)動(dòng)軌跡以及每成形一層支架后支架材料接收板
(4)在水浴池(5)中下降一定的高度，使已成形的支架層浸入水浴中；將經(jīng)過(guò)滅菌處理的細(xì)胞-生物材料混合單元與熔融態(tài) 合成高分子生物材料分別裝入料筒(7)中，氣泵(3)通過(guò)供氣軟管分別與裝有細(xì)胞-生物材料混合單元和熔融高分子生物材料的料筒(7)相連，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)對(duì)氣泵(3)供氣的啟、?？刂?，實(shí)現(xiàn)不同材料的有序擠出。首先成形由細(xì)胞-生物材料混合單元包裹合成高分子生物材料，三維貫通孔尺寸為200~250 μ m的軟骨下骨層支架部分；當(dāng)軟骨下骨層支架成形完成后，在計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)的控制下，關(guān)閉合成高分子生物材料的供料壓力，使同軸噴頭擠出單元(2)只擠出細(xì)胞-生物材料混合單元，成形三維貫通孔尺寸為100~150μπι的軟骨層支架。在支架增量成形的過(guò)程中，每成形一層支架，支架材料接收板(4)就會(huì)向下下降一定高度，使已成形的支架材料浸入含有觸發(fā)離子的交聯(lián)溶液中進(jìn)行交聯(lián)，并為支架中含有的細(xì)胞提供適宜的生存環(huán)境。最終，通過(guò)逐層的增量成形，得到由不同材料構(gòu)成，具有梯度結(jié)構(gòu)變化的活性骨軟骨一體化梯度支架。本實(shí)施例的工藝過(guò)程:以脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞，利用所述工藝制備活性骨軟骨一體化梯度支架。將海藻酸鈉與能夠促使海藻酸鈉溶液凝膠化并有利于細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)的天然生物材料明膠分別制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%與20%的水溶液，滅菌備用；將脂肪干細(xì)胞與海藻酸鈉溶液、明膠溶液按照溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1:5:5的比例混合均勻，得到凝膠狀細(xì)胞-生物材料的混合物；選擇分子量為15，000的PLGA經(jīng)加熱后成為熔融態(tài)可擠出材料。在計(jì)算機(jī)模型的控制、驅(qū)動(dòng)下，同軸噴頭按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的支架結(jié)構(gòu)與成形路徑運(yùn)動(dòng)，首先成形由細(xì)胞-生物材料包裹PLGA構(gòu)成的包芯纖維逐層搭接，力學(xué)性能良好，支架三維通孔尺寸在200~250μπι之間的軟骨下骨層支架；通過(guò)關(guān)閉PLGA供料動(dòng)力，由細(xì)胞-生物材料混合單元構(gòu)成三維通孔尺寸范圍在100~150μπι，但是細(xì)胞含量更多的軟骨層支架部分。在成形過(guò)程中，每增量成形一層支架，支架材料接收板就會(huì)下降一定高度，使支架材料浸入到交聯(lián)溶液中對(duì)支架進(jìn)行交聯(lián)。通過(guò)逐層的增量成形，最終得到含有脂肪干細(xì)胞的活性骨軟骨一體化梯度支架。
權(quán)利要求
1.一種活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法，其特征在于操作步驟如下: 1)將離子濃度敏感材料與促凝膠化天然生物材料分別制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6^4.4%和18 22%的水溶液，經(jīng)滅菌后備用； 2)將種子細(xì)胞與所制備的離子濃度敏感材料和促凝膠化天然生物材料水溶液按照質(zhì)量比為1:5:2.5 1:10:10充分混合均勻，制備成凝膠狀細(xì)胞-生物材料混合單元；將合成高分子生物材料經(jīng)過(guò)消毒，加熱到熔融狀態(tài)；將細(xì)胞-生物材料混合單元與熔融態(tài)高分子生物材料分別倒入不同的料筒中；根據(jù)事先設(shè)計(jì)好的支架結(jié)構(gòu)與成形路徑，在4°C ±0.5°C環(huán)境溫度中通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的控制將細(xì)胞-生物材料混合單元與熔融態(tài)高分子生物材料由同軸噴頭一同擠出，在空間的指定位置逐層增量成形一體化梯度支架中三維通孔尺寸較大的軟骨下骨層支架部分； 3)當(dāng)軟骨下骨層支架成形完成后，關(guān)閉熔融態(tài)高分子生物材料的供料動(dòng)力，使噴頭只擠出細(xì)胞-生物材料混合單元，在軟骨下骨層支架的基礎(chǔ)上繼續(xù)增量成形一體化梯度支架中三維通孔尺寸較小的軟骨層支架部分，最終得到具有細(xì)胞活性的骨軟骨一體化梯度支架； 4)在逐層增量成形一體化梯度支架的過(guò)程中，每完成一層支架材料的擠出成形后，支架材料接收平臺(tái)就下降一定高度，使剛成形的支架層浸入到含有觸發(fā)離子的水浴溶液中，離子濃度敏感材料與溶液產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)并為細(xì)胞提供多水的生存環(huán)境。
2.按照權(quán)利要求1所述的活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法，其特征在于:所述步驟I)中的離子濃度敏感材料為海藻酸鈉，促使材料進(jìn)行凝膠化轉(zhuǎn)變的天然生物材料為明膠，合成高分子生物材料為分子量為15，000的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polyIactic-co-glycolic acid, PLGA)。`
3.按照權(quán)利要求1或2所述的活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法，其特征在于:所述步驟2)和步驟3)中的一體化梯度支架中，三維通孔尺寸較小的軟骨層支架由凝膠態(tài)細(xì)胞-生物材料混合單元構(gòu)成，三維貫通孔尺寸為10(Γ150 μ m以利于軟骨生成；三維通孔尺寸較大的軟骨下骨層支架由包芯材料組成:內(nèi)層的主體材料為PLGA，在主體材料的表面包裹一層細(xì)胞-生物材料混合單元，三維貫通孔尺寸為20(Γ250 μ m以利于血管長(zhǎng)入。
4.按照權(quán)利要求1或2或3所述的活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法，其特征在于:所述步驟4)中的觸發(fā)離子為Ca2+，水浴溶液為飽和氯化鈣溶液。
5.按照權(quán)利要求1或2或3或4所述的活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法，其特征在于:在所述步驟4)中，每成形一層支架后，接收平臺(tái)下降的高度即支架浸入水浴溶液中的高度為單層支架高度的90%，以保證下一層支架與已成形支架層之間材料能夠?qū)崿F(xiàn)有效粘接。
6.一種活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形系統(tǒng)，應(yīng)用于按照權(quán)利要求1所述的活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法實(shí)現(xiàn)成形，包括:三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)、同軸噴頭擠出單元(2)、氣泵(3)、支架材料接收板(4)、水浴池(5)、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)和料筒(7)，其特征在于:所述的同軸噴頭擠出單元(2)、氣泵(3)、料筒(7)安裝在三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)上，處于水浴池(5)上方，可實(shí)現(xiàn)X-Y平面運(yùn)動(dòng)；支架材料接收板(4)與三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)聯(lián)接，可實(shí)現(xiàn)Z方向運(yùn)動(dòng)，且支架材料接收板(4)置于水浴池(5)中；計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)與三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)(I)相連，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的支架模型以及路徑規(guī)劃，控制同軸噴頭擠出單元(2)在X-Y平面的運(yùn)動(dòng)軌跡以及每成形一層支架后支架材料接收板(4)在水浴池(5)中下降的高度，以實(shí)現(xiàn)支架結(jié)構(gòu)與三維通孔的可控成形并使已成形的支架浸入水浴中；氣泵(3)通過(guò)供氣軟管分別與裝有細(xì)胞-生物材料混合單元和熔融高分子生物材料的料筒(7)相連，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)(6)對(duì)氣泵(3)供氣的啟、?？刂?，實(shí)現(xiàn)不同材料的有序擠出，最終成形由不 同材料構(gòu)成，具有梯度結(jié)構(gòu)變化的活性骨軟骨一體化梯度支架。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活性骨軟骨一體化梯度支架三維可控的增量成形方法及成形系統(tǒng)。該方法將天然生物材料與種子細(xì)胞經(jīng)充分混合后調(diào)制成細(xì)胞-生物材料活性凝膠作為一體化活性支架中軟骨層的主體材料與軟骨下骨層的表面改性材料，力學(xué)性能好、降解性能可控的合成高分子生物材料作為軟骨下骨層支架的主體材料。根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的支架結(jié)構(gòu)與成形路徑，將活性生物凝膠與熔融態(tài)合成高分子生物材料由同軸噴頭擠出，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制合成高分子生物材料供料動(dòng)力的啟停，逐層增量成形具有良好力學(xué)性能與生物活性的骨軟骨一體化梯度支架。具有生物活性的一體化梯度支架不僅可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維可控成形，同時(shí)可以保證支架具有良好的力學(xué)性能，支架的孔隙結(jié)構(gòu)與降解速度可控，有利于細(xì)胞的立體培養(yǎng)與組織再生。
文檔編號(hào)A61L27/18GK103143062SQ20131007008
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者于永澤, 劉瑩, 韓振中, 劉媛媛, 胡慶夕 申請(qǐng)人:上海大學(xué)