專利名稱：響應(yīng)面法優(yōu)化納米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝的制作方法
響應(yīng)面法優(yōu)化納米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種響應(yīng)面法優(yōu)化納米山茱萸中α -葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝。
背景技術(shù)：
納米技術(shù)是指在納米尺度(lX10-9cm)上對物質(zhì)和材料進(jìn)行加工、制造的一種高新技術(shù)。1998年徐碧輝提出了“納米中藥”的概念，即運(yùn)用納米技術(shù)制造的、粒徑小于100納米的中藥有效成分、有效部位、原藥及其復(fù)方制劑。納米中藥具有提高生物利用度、靶向給藥、增強(qiáng)功效、促進(jìn)中藥制劑的標(biāo)準(zhǔn)化和國際化等優(yōu)點(diǎn)。響應(yīng)面分析法(Response SurfaceMethodology,簡稱RSM)由一組數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法組成，能夠精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，同時可根據(jù)數(shù)學(xué)模型控制響應(yīng)值，選擇不同的操作參數(shù)，從而尋求最佳工藝參數(shù)。中藥在提取過程中常常會受到諸多因素的影響，響應(yīng)曲面優(yōu)化法在中藥有效成分的提取中，可以確定在試驗范圍內(nèi)的任何試驗點(diǎn)的預(yù)測值，因而在對納米山茱萸中的降血糖活性成分的優(yōu)化中，響應(yīng)曲面優(yōu)化法比正交設(shè)計和均勻設(shè)計更合適。
山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc的干燥成熟果肉，是世界上三大名貴木本藥材之一。臨床上多用山萸肉和酒山萸肉，新鮮山茱萸果肉中的主要成分有單糖、多糖、有機(jī)酸、苷類、環(huán)烯醚萜類、黃酮、蒽醌、制本、內(nèi)酯等。山茱萸常出現(xiàn)在中醫(yī)降血糖的組方中，是常用的降血糖藥物?，F(xiàn)代研究表明，山茱萸的有效成分糖蛋白、熊果酸、齊增果酸、多糖、苷類、鞣質(zhì)、環(huán)烯醚萜類等都具有降血糖效果。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)缺陷，提供一種響應(yīng)面法優(yōu)化納米山茱萸中α -葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝，本發(fā)明采用α -葡萄糖苷酶抑制劑微孔板高通量篩選模型，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化山納米茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝，為山茱萸降血糖成分的充分提取做了初步探討，并為 其進(jìn)一步的開發(fā)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
其技術(shù)方案為:一種響應(yīng)面法優(yōu)化納米山茱萸中α -葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝，包括以下步驟:
以1: 25的料液比加樣，即稱取0.5g的山茱萸粉末于試管中，然后加入12.5ml的53%的乙醇，在超聲儀中于50°C的條件下超聲19min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明響應(yīng)面分析法通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數(shù)，是解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，其回歸方程精度高。因此，用響應(yīng)面法優(yōu)化的超聲波提取工藝更為精準(zhǔn)，對山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑的工業(yè)化生產(chǎn)有較高的參考價值，也為山茱萸降血糖成分的進(jìn)一步分離純化及功能性研究提供了科學(xué)依據(jù)，奠定了一定的理論基礎(chǔ)。


圖1是超聲時間對抑制率的影響圖，超聲溫度=300C，乙醇體積分?jǐn)?shù)=40%,料液比=I: 10 ；圖2是超聲溫度對抑制率的影響圖，超聲時間=20min,乙醇體積分?jǐn)?shù)=40%，料液比=1: 10 ；圖3是料液比對抑制率的影響圖，超聲時間=20min，超聲溫度=30°C，乙醇體積分?jǐn)?shù)=40% ；圖4是乙醇濃度對抑制率的影響圖，超聲時間=20min，超聲溫度=30°C，料液比=I: 10 ；圖5是超聲溫度和超聲時間對抑制率影響的響應(yīng)面圖(A)和等高線圖⑶；圖6是超聲溫度和料液比對抑制率影響的響應(yīng)面圖㈧和等高線圖⑶；圖7是超聲溫度和乙醇濃度對抑制率影響的響應(yīng)面圖(A)和等高線圖(B)；圖8是超聲時間和料液比對抑制率影響的響應(yīng)面圖㈧和等高線圖⑶；圖9是超聲時間和乙醇濃度對抑制率影響的響應(yīng)面圖㈧和等高線圖⑶；圖10是料液比和乙醇濃度對抑制率影響的響應(yīng)面圖㈧和等高線圖⑶。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。材料與方法藥材山茱萸于2011年10月至11月采集于陜西佛坪，經(jīng)陜西師范大學(xué)植物學(xué)教研室鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc的干燥成熟果肉，標(biāo)本存于陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。試劑二甲基亞砜(DMSO)，α-葡萄糖苷酶(a-glucosidase,EC3.2.1.20)，4_ 硝基苯-a-D-卩比喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-alpha-d-glucopyranosid, PNPG)均購于 sigma公司，乙醇，磷酸二氫鉀(KH2PO4),磷酸氫二鉀(K2HPO4.3Η20)，碳酸鈉(Na2CO3)均為分析純。儀器酶標(biāo)儀(北京惠安澤泰科技有限公司)，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，PH計(成都世紀(jì)方舟科技有限公司)，XH-B型旋渦混合器(美堰市康健醫(yī)療器具有限公司)，ΗΗ-2Β型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，SHB-HIA型循環(huán)水式多用真空泵(陜西太康生物科技有限公司)，KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DFT-50手提式粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。材料預(yù)處理稱取已去核的山茱萸干品400g，納米技術(shù)粉碎后放置在干燥器中，備用。納米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑提取液的制備準(zhǔn)確稱取納米技術(shù)粉碎的山茱萸粗粉0.5g，放入20mL的試管中，并以一定的料液比加入一定濃度的乙醇，蓋上瓶塞，振蕩搖勻，放置3h后一定條件下超聲三次,抽濾,濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至40mL,乙醚萃取油脂，靜置lOmin，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醚味，定容至40ml并置于錐形瓶中備用。α -葡萄糖苷酶活性的抑制實驗
反應(yīng)體系參照方法，條件優(yōu)化后為:96微孔板上每孔加磷酸鉀緩沖液(ρΗ6.8) 180 μ L，再加入α -葡萄糖苷酶15 μ L，樣品溶液4 μ L，混勻，37°C恒溫15min后，加Λ 10mmol/LPNPG30 μ L，混勻后37。1:恒溫反應(yīng)15min，于405nm波長下測吸光度A值。每個樣品做3份平行，取平均值，計算抑制率?？瞻捉M對照組用緩沖液代替α-葡萄糖苷酶和山茱萸提取液；對照組用緩沖液代替山茱萸提取液。實驗共設(shè)a，b，c，d，e5個組，每組三孔，分別為:a.對照組(緩沖液+酶液+底物)b.空白組對照組(緩沖液)c.樣品測定組(樣品+酶液+底物)d.樣品對照組(樣品+緩沖液)e.陽性對照組(Acarbose+酶液+底物)根據(jù)本實驗方法按下面公式計算樣品抑制率:樣品的百分抑制率(1%) = [l-(c-d)/(a-b)] X100%單因素試驗選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲溫度和料液比4個影響α -葡萄糖苷酶抑制劑提取效果的因素，以對α-葡萄糖苷酶的抑制率為指標(biāo)確定這4個因素的適宜范圍。響應(yīng)面優(yōu)化試驗采用Design-Expert軟件研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲溫度和料液比4個因素對α -葡萄糖苷酶抑制劑的影響，并用BoxBehnken試驗設(shè)計方案,進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗。結(jié)果與分析單因素試驗結(jié)果:實驗結(jié)果見圖1 4。實驗結(jié)果顯示:超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比對α-葡萄糖苷酶抑制作用有較大的影響，超聲時間對其影響相對較小。所以，初步選定α-葡萄糖苷酶抑制劑的超聲輔助提取最佳工藝條件為超聲時間20min、超聲溫度40°C、乙醇濃度40%、料液比1: 20。響應(yīng)面的實驗設(shè)計及結(jié)果根據(jù)Box-Beknhen試驗設(shè)計原理,運(yùn)用Design-Expert軟件對超聲溫度(A)、超聲時間(B)、料液比(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)4個因素作進(jìn)一步的優(yōu)化。響應(yīng)面分析因素與水平和實驗設(shè)計分別見表I和表2。表I響應(yīng)面因素水平編碼表

權(quán)利要求
1.一種響應(yīng)面法優(yōu)化納米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝，其特征在于，包括以下步驟:稱取0.5g的山茱萸粉末于試管中，然后加入12.5ml的53%的乙醇，在超聲儀中于50°C的條件 下超聲19min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種響應(yīng)面法優(yōu)化納米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑的提取工藝，以納米技術(shù)粉碎的山茱萸為原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲溫度和料液比做為響應(yīng)面分析的因素，通過中心組合設(shè)計，以山茱萸乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法研究各因素及其交互作用對山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響。響應(yīng)面分析得到的α-葡萄糖苷酶抑制劑的最佳提取條件為超聲溫度50℃，超聲時間19min，料液比1∶25，乙醇濃度為53％。此工藝為納米山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。
文檔編號A61K131/00GK103169751SQ20131008267
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者康杰芳, 李慧敏, 劉艷妮, 安莉, 王喆之 申請人:陜西師范大學(xué)