專利名稱：一種靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂質(zhì)體運(yùn)載體，特別是涉及一種能夠特異性針對肝臟細(xì)胞的脂質(zhì)體運(yùn)載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
肝癌是常見腫瘤之一，在全球發(fā)病率日益上升，嚴(yán)重危害人類的生命健康。目前治療肝癌無外乎化療或手術(shù)治療，但效果都不很理想。隨著基因技術(shù)的日益發(fā)展，從基因方面治療肝癌成為了可能，且技術(shù)越來越成熟。如何實(shí)現(xiàn)基因治療的靶向性，是目前研究亟待解決的問題。應(yīng)用于基因治療的載體主要有病毒載體和非病毒載體兩種。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特異性差、制備較復(fù)雜及費(fèi)用較高等缺點(diǎn)。因此，人們愈來愈重視非病毒載體的研究。陽離子聚合物作為非病毒基因載體顯示出巨大的優(yōu)勢和潛力，它不但可以降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積和毒性，還可以通過自身降解來控制基因的釋放。陽離子脂質(zhì)體作為一種高效的基因傳遞載體，具有下列優(yōu)點(diǎn):1)可防止核酸被體內(nèi)物質(zhì)降解，可將其特異性傳遞到靶細(xì)胞中；2)無毒、無免疫原性，具有生物惰性，可生物降解；3)易于制備，使用方便，可將大的DNA片斷轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中；4)基因轉(zhuǎn)染率高，離體細(xì)胞可以瞬間表達(dá)外源基因。目前，陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)已經(jīng)在基因治療方面取得了巨大的成果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種脂質(zhì)體運(yùn)載體，使其具有良好的肝細(xì)胞靶向性，從而提高所包裹藥物的作用。同時， 本發(fā)明還提供了該運(yùn)載體的制備方法。本發(fā)明提供的靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體是一種由脂質(zhì)體和載脂蛋白組成的復(fù)合物，其中，所述的脂質(zhì)體為由雙十二烷基二甲基溴化銨與二油酰磷脂酰乙醇胺組成，并經(jīng)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺修飾的雙層包膜的磷脂質(zhì)小囊，且雙十二烷基二甲基溴化銨與二油酰磷脂酰乙醇胺的質(zhì)量比為1:0.6-1.5，所述的載脂蛋白為ApoE，月旨質(zhì)體與載脂蛋白的質(zhì)量比為1000-1200:1。進(jìn)一步地，所述的ApoE預(yù)先以2-亞氨基硫烷鹽酸鹽進(jìn)行活化。本發(fā)明還提供了上述靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體的制備方法，包括以下步驟:
1)將雙十二烷基二甲基溴化銨和二油酰磷脂酰乙醇胺按照1:0.6-1.5的質(zhì)量比溶解在無水乙醇中，于50-70°C加入水中，分別以150-200鹽、80-120鹽及40-60鹽的聚碳酸酯膜擠壓整理，得到粒徑SO-1lOnm的脂質(zhì)體；水洗除去乙醇后，稀釋得到濃度13_17mg/ml的陽離子脂質(zhì)體水溶液；
2)向陽離子脂質(zhì)體水溶液中加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺，力口入量4-10 μ g/ml，于50-70°C溫育0.8-1.2h，得到活化的陽離子脂質(zhì)體；3)按照ApoE蛋白:2-亞氨基硫烷鹽酸鹽為1:1.5-2.5的摩爾比，將ApoE蛋白和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽的PBS溶液混合，室溫反應(yīng)0.8-1.2h，得到活化ApoE蛋白；
4)將活化的陽離子脂質(zhì)體與活化ApoE蛋白按照1000-1200:1的質(zhì)量比混合，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)3-5h，得到所述靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體。本發(fā)明將得到的靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體進(jìn)行進(jìn)一步的純化，其方法為:將甘氨酸與2-亞氨基硫烷鹽酸鹽按照1.5-2.5:1的質(zhì)量比混合，室溫反應(yīng)0.8-1.2 h后，加入到制備得到的運(yùn)載體中，室溫反應(yīng)3-5h，微型凝膠柱離心除去未反應(yīng)的小分子化合物，得到最終
女口
廣叩ο本發(fā)明將上述得到的最終產(chǎn)品的濃度調(diào)整為3.5-4.5mg/ml。本發(fā)明將陽離子脂質(zhì)體與載脂蛋白結(jié)合，共同構(gòu)建成為了靶向性針對肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體。本發(fā)明所構(gòu)建的靶向性基因傳遞載體是一種全新的高效、高靶向性、高安全性的載體體系，該運(yùn)載體中含有ApoE，可以特異性識別肝細(xì)胞膜上受體，從而介導(dǎo)脂質(zhì)體與肝細(xì)胞膜結(jié)合，通過以配體一受體親和性的富集作用來提高載體的靶向性，提高轉(zhuǎn)染效率和肝細(xì)胞內(nèi)的富集度。本發(fā)明提供的靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體可以作為各類治療藥劑的人工膜和賦形劑，通過各種給藥途徑，使所包裹的藥物具有打靶作用，準(zhǔn)確地?fù)糁胁∽儾课?、組織和細(xì)胞，從而增強(qiáng)藥物的療效。


圖1為L-02肝 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染載體I和2號(100X )。左圖轉(zhuǎn)染載體I號4 μ 1+質(zhì)粒pGenesil-1 8 μ I,右圖轉(zhuǎn)染載體2號4 μ 1+質(zhì)粒pGenesil-1 8 μ I。圖2為SMMC-7721肝癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染載體I和2號(100Χ )。左圖轉(zhuǎn)染載體I號4 μ 1+質(zhì)粒pGenesil-1 8 μ I,右圖轉(zhuǎn)染載體2號4 μ 1+質(zhì)粒pGenesil-1 8 μ I。圖3為H9c2心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染載體I和2號(100X )。左圖轉(zhuǎn)染載體I號4 μ 1+質(zhì)粒pGenesil-1 8 μ I,右圖轉(zhuǎn)染載體2號4 μ 1+質(zhì)粒pGenesil-1 8 μ I。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
靶向性導(dǎo)入肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體，是由脂質(zhì)體和載脂蛋白ApoE組成的復(fù)合物。該復(fù)合物是一類具有細(xì)胞膜穿透作用的非病毒運(yùn)載體。其脂質(zhì)體是一種人工制備的攜有雙層包膜的磷脂質(zhì)小囊，因ApoE可以特異性識別肝細(xì)胞膜上受體，從而介導(dǎo)脂質(zhì)體與肝細(xì)胞膜結(jié)合，有利于載體的靶向性。運(yùn)載體的具體制備方法包括以下步驟:
1、陽離子脂質(zhì)體的制備
稱取雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB，AVANTI POLAR LIPIDS, INC.)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，AVANTI POLAR LIPIDS, INC.)各 lOOmg，溶解在 1.2ml 無水乙醇中，于 60。。下注入到12ml注射用水中。分別用規(guī)格150-200nm、80-120nm及40-60nm的聚碳酸酯膜擠壓整理，得到粒徑約為SO-1lOnm的脂質(zhì)體；用8倍體積的水進(jìn)行超濾，除去體系中的乙醇后，定容得到濃度為15mg/ml的普通陽離子脂質(zhì)體,記作CL-1。2、脂質(zhì)體的活化
量取CL-1 5ml，加入含有25 μ g 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺(DSPE-PEG-MAL, AVANTI POLAR LIPIDS, INC.)的水溶液中，60°C溫育 1.2h，記作 CL-2。3、蛋白活化
將ApoE蛋白和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-1T，THERMO)分別用PBS (磷酸鹽緩沖液)溶解后，按照1:2的摩爾比將兩種溶液混合，室溫反應(yīng)lh，記作AP。4、蛋白和脂質(zhì)體連接
將CL-2和AP按照1000:1的質(zhì)量比混合，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)3h，記作CL-P。5、純化
將甘氨酸(SIGMA)與2-1T按照2.5:1的比例混合，室溫反應(yīng)1.2h后，取適量加入到CL-P中，室溫反應(yīng)4h，以微型凝膠柱離心除去未反應(yīng)的小分子化合物后，定容得到濃度為
3.5-4.5mg/ml 的運(yùn)載體。實(shí)施例2
靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的效率研究
1、細(xì)胞培養(yǎng)
供試細(xì)胞:人肝癌細(xì)胞SMMC7721，人正常肝細(xì)胞L-02，心肌細(xì)胞H9c2。SMMC7721體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640中，其余細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖型DMEM(GIBCO)中。2、肝癌細(xì)胞系對運(yùn)載體復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率
實(shí)驗(yàn)設(shè)2組，樣品I號為脂質(zhì)體載體組，樣品2號為脂質(zhì)體-ApoE載體組，具體參數(shù)如表1，比較2種載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異。
表1不同栽體的制備參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體，是由脂質(zhì)體和載脂蛋白組成的復(fù)合物，其特征是所述的脂質(zhì)體為由雙十二烷基二甲基溴化銨與二油酰磷脂酰乙醇胺制成，并經(jīng)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺修飾的雙層包膜的磷脂質(zhì)小囊，其中雙十二烷基二甲基溴化銨與二油酰磷脂酰乙醇胺的質(zhì)量比為1:0.6-1.5，所述的載脂蛋白為ApoE，脂質(zhì)體與載脂蛋白的質(zhì)量比為1000-1200:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體，其特征是將所述的ApoE以2-亞氨基硫燒鹽酸鹽活化。
3.制備權(quán)利要求1所述靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體的方法，其特征是包括以下步驟: 1)將雙十二烷基二甲基溴化銨和二油酰磷脂酰乙醇胺按照1:0.6-1.5的質(zhì)量比溶解在無水乙醇中，于50-70°C加入水中，分別以150-200鹽、80-120鹽及40-60鹽的聚碳酸酯膜擠壓整理，得到粒徑SO-1lOnm的脂質(zhì)體；水洗除去乙醇后，稀釋得到濃度13_17mg/ml的陽離子脂質(zhì)體水溶液； 2)向陽離子脂質(zhì)體水溶液中加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺，力口入量4-10 μ g/ml，于50-70°C溫育0.8-1.2h，得到活化的陽離子脂質(zhì)體； 3)按照ApoE蛋白:2_亞氨基硫烷鹽酸鹽為1:1.5-2.5的摩爾比，將ApoE蛋白和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽的PBS溶液混合，室溫反應(yīng)0.8-1.2h，得到活化ApoE蛋白； 4)將活化的陽離子脂質(zhì)體與活化ApoE蛋白按照1000-1200:1的質(zhì)量比混合，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)3-5h，得到所述靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體的方法，其特征是按照以下方法純化得到的運(yùn)載體:將甘氨酸與2-亞氨基硫烷鹽酸鹽按照1.5-2.5:1的質(zhì)量比混合，室溫反應(yīng)0.8-1.2 h后，加入 到制備得到的運(yùn)載體中，室溫反應(yīng)3-5h，微型凝膠柱離心除去未反應(yīng)的小分子化合物，得到最終產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體的方法，其特征是所述最終產(chǎn)品的濃度為 3.5-4.5mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將基因靶向性導(dǎo)入肝臟細(xì)胞的運(yùn)載體及其制備方法，所述運(yùn)載體是由脂質(zhì)體和載脂蛋白組成的復(fù)合物，其中脂質(zhì)體為由雙十二烷基二甲基溴化銨與二油酰磷脂酰乙醇胺制成，并經(jīng)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺修飾的雙層包膜的磷脂質(zhì)小囊，載脂蛋白為ApoE。本發(fā)明構(gòu)建的靶向性基因運(yùn)載體通過以配體—受體親和性的富集作用來提高載體的靶向性，提高轉(zhuǎn)染效率和肝細(xì)胞內(nèi)的富集度，具有顯著的肝臟細(xì)胞靶向性，可以作為各類治療藥劑的人工膜和賦形劑，以增強(qiáng)藥物的療效。
文檔編號A61P35/00GK103143033SQ20131009451
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月24日
發(fā)明者于保鋒, 牛栓成, 郭睿, 解軍, 張小曼, 李春鋒, 高然朋, 劉丹, 郝宇卉, 牛璐婷, 梁樣紅, 楊麗娟, 胡曉年, 向前, 張悅紅, 陳顯久 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)