一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應(yīng)用。發(fā)酵方法包括以下步驟：（1）宿主菌懸液的制備；（2）蛭弧菌游泳體濃縮液的制備；（3）蛭弧菌制劑的制備。本發(fā)明所述的發(fā)酵方法中采用的宿主菌均為有益的或?qū)Νh(huán)境無(wú)害的革蘭氏陽(yáng)性菌，既可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革蘭氏陰性菌的能力，用該方法制得的蛭弧菌制劑對(duì)致病菌的裂解能力有了一定的提高；所制得的蛭弧菌制劑又可以直接使用，無(wú)需經(jīng)過(guò)更多的發(fā)酵后處理，該制劑的使用范圍也大大的增加。本發(fā)明在得到高濃度蛭弧菌菌液的同時(shí)，相對(duì)也縮短了發(fā)酵周期，這樣有效的解決了發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致的能源消耗過(guò)大，生產(chǎn)成本過(guò)高的問(wèn)題，得到的蛭弧菌制劑不僅成本低，而且活性高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應(yīng)用
[0001 ] 本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮椤?201010270772.9”的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為“2010年8月31日”，申請(qǐng)?zhí)枮椤?01010270772.9”，發(fā)明名稱(chēng)為“一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵
方法和應(yīng)用”。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各種物理和/或化學(xué)的方法，包括各種抗生素的使用。物理和/或化學(xué)的方法都存在著明顯的弊端，首先，抗生素大量濫用，會(huì)導(dǎo)致一些副作用的產(chǎn)生，如病原菌的抗藥性、抑制有益菌群等。其次，酸堿處理的方法雖可達(dá)到一定的滅菌/殺菌效果，但在有害菌形成生物膜后，這些方法的效果就極不理想。最后，物理的方法對(duì)各種致病菌的消除作用只能應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域的某一環(huán)節(jié)，而難以擴(kuò)展到整個(gè)領(lǐng)域的所有環(huán)節(jié)。生物防治的方法則可具有強(qiáng)大的優(yōu)越性，極有可能使其服務(wù)于日常生活的病害防治以及生物戰(zhàn)和恐怖襲擊中大規(guī)模的水源性、食源性污染的處理等。
[0004]近年來(lái)微生物生態(tài)制劑的研究開(kāi)發(fā)受到各方關(guān)注，特別是蛭弧菌的研究受到人們的青睞。蛭弧菌自1963年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因其是一種寄生菌，能裂解大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、嗜水氣單胞菌、弧菌等革蘭氏陰性致病菌且對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害，而備受關(guān)注。
[0005]將蛭弧菌應(yīng)用于防治致病菌的關(guān)鍵是獲得濃度高、裂解能力強(qiáng)的蛭弧菌制劑。為此，人們對(duì)蛭弧菌制劑的制備方法進(jìn)行了不懈的研究，譬如專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?3111749.6、名稱(chēng)為“生物制菌王及其生產(chǎn)方法”的國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)岢鲇酶邷?70~150°C)或化學(xué)藥物(氯仿等)將大腸桿菌殺死，制造滅活的宿主菌，接著用其培養(yǎng)蛭弧菌，得到蛭弧菌制劑；專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00810145709.5、名稱(chēng)為“蛭弧菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)方法”提供了蛭弧菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)方法，主要和傳統(tǒng)方法不同的是將宿主大腸桿菌凍干成菌粉使用。上述兩份專(zhuān)利申請(qǐng)都采用活的大腸桿菌作為宿主菌，最終會(huì)影響生態(tài)環(huán)境。而本發(fā)明所用的宿主菌均為有益菌或是對(duì)環(huán)境無(wú)害的菌，不會(huì)對(duì)環(huán)境構(gòu)成威脅。專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00810202809.7、名稱(chēng)為“雙效蛭弧菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法”的國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N雙效蛭弧菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，即先發(fā)酵制備宿主菌的混懸液，再加入宿主菌混懸液和蛭弧菌液到配制好的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵。雖然該生產(chǎn)方法生產(chǎn)出的蛭弧菌含量較高(5X108pfu/mL)，但是其宿主菌選用了致病性的嗜水氣單胞菌，而且發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)(72~120h)，會(huì)導(dǎo)致其生產(chǎn)成本的增加。另外，此技術(shù)也可能存在著所得的蛭弧菌裂解活性不高的問(wèn)題。而本發(fā)明采用的是革蘭氏陽(yáng)性菌為宿主，實(shí)驗(yàn)證明，以此宿主發(fā)酵制得的蛭弧菌能夠維持，甚至提高對(duì)其他革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的裂解能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有方法所制備的蛭弧菌制劑含量低以及裂解活性低的問(wèn)題，本發(fā)明的首要目的在于提供一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述發(fā)酵方法制備得到的蛭弧菌制劑。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供上述蛭弧菌制劑的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，包括以下步驟:
[0010](I)宿主菌懸液的制備
[0011]將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體，接著用磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度，得到濃度為IO17~1022cfu/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2~15°C中保存?zhèn)溆茫?br> [0012](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0013]在磷酸鹽緩沖液中加入步驟(1)制備的宿主菌懸浮液，調(diào)整宿主菌的濃度為101°~1015cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后將此培養(yǎng)液在20~40°C培養(yǎng)20~60h，再在2~15°C, 5000~8000rpm離心15~35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在2~15°C，12000~20000rpm離心15~40min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?沉淀為蛭弧菌游泳體,在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為IO6~109pfu/mL，得到蛭弧菌游泳體濃縮液，置于2~15°C保存?zhèn)溆茫?br> [0014](3)蛭弧菌制劑的制備:
[0015]將氯化鈉溶于溶劑中形成質(zhì)量體積比濃度為O~30g/L的氯化鈉溶液，滅菌，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的宿主菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌游泳體濃縮液，使宿主菌起始濃度為101°~1015cfu/mL，蛭弧菌游泳體起始濃度為IO1~103pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵溫度控制在28~30°C，pH值控制在7.2~7.6 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在20%~3`0% ;發(fā)酵過(guò)程中加I~3次宿主菌懸浮液，每次加入宿主菌懸浮液的間隔時(shí)間12~18h，每次加入宿主菌懸浮液的量以新加入的宿主菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為101°~1015cfu/mL為準(zhǔn)；發(fā)酵培養(yǎng)36~48h即制成蛭弧菌制劑；所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基、蒸餾水或磷酸鹽緩沖液。
[0016]步驟(1)所述宿主菌為有益的或?qū)Νh(huán)境無(wú)害的革蘭氏陽(yáng)性菌，優(yōu)選為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、納豆芽抱桿菌(Bacillus natto)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)或戍糖片球菌(Pediococcus pentasaceus)；
[0017]步驟(2)所述蛭弧菌為 BDR) 1、BDF02, BDF03, BDJO1、BDJ02、BDMO1、BDSO1、BDS02、BDSM08 或 BDFM05。
[0018]所述BDF01于2008年I月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208008 ;所述BDF02于2008年I月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208009 ;所述BDR)3于2008年I月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO:M208010 ;所述 BDJ01 (蛭弧菌 BDJOlBdellovibrio sp.BDJOl)于 2008 年 I 月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208011 ;所述BDJ02于2008年I月14日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208012 ;所述BDMOl于2008年4月28日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208066 ;所述BDSOl于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M209169 ;所述BDS02于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M209170 ;所述BDSM08于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M209171 ;所述BDFM05于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO:M209172。
[0019]步驟(1)所述收集菌體的方式優(yōu)選為通過(guò)離心分離得到，離心條件為2~15°C，5000 ~8000rpm 離心 15 ~35min ； [0020]步驟(1)所述宿主菌懸浮液的濃度優(yōu)選為IO17~1022cfu/mL ；
[0021]步驟(2)所述蛭弧菌斑采用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng))進(jìn)行分離得到。
[0022]步驟(1)~(3)任一項(xiàng)所述磷酸鹽緩沖液優(yōu)選為濃度是0.1~0.3mol/L, pH是
7.2~7.6的磷酸鹽緩沖液；
[0023]步驟(2)所述蛭弧菌游泳體濃縮液的濃度優(yōu)選為IO6~109pfu/mL ；
[0024]步驟(3)所述蛭弧菌來(lái)源于咸水環(huán)境時(shí)，所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基或蒸餾水，所述氯化鈉溶液的質(zhì)量體積比濃度為25~30g/L ；
[0025]步驟(3)所述蛭弧菌來(lái)源于咸淡水環(huán)境時(shí)，所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基或蒸餾水，所述氯化鈉溶液的質(zhì)量體積比濃度為5~10g/L ；
[0026]步驟(3)所述蛭弧菌來(lái)源于淡水環(huán)境時(shí)，不加氯化鈉；
[0027]步驟(3)所述滅菌的條件優(yōu)選為121°C滅菌20min ；
[0028]步驟(3)所述蛭弧菌制劑的濃度為IO8~1012pfu/mL ；
[0029]步驟(3)所述DNB液體培養(yǎng)基是將營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.6。
[0030]一種蛭弧菌制劑，由所述的蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法制備得到；
[0031]所述蛭弧菌制劑可以通過(guò)裂解其它致病菌或潛在致病菌而達(dá)到防治病菌害的目的。所述的蛭弧菌制劑不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體制劑、蛭質(zhì)體制劑以及它們的按比例混合的制劑。
[0032]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0033](I)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法中采用的宿主菌均為有益的或?qū)Νh(huán)境無(wú)害的革蘭氏陽(yáng)性菌。這樣，一方面，可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革蘭氏陰性菌的能力，而且實(shí)驗(yàn)證明，用該方法制得的蛭弧菌制劑對(duì)致病菌的裂解能力有了一定的提高；另一方面，所制得的蛭弧菌制劑可以直接使用，無(wú)需經(jīng)過(guò)更多的發(fā)酵后處理；再者，因?yàn)樗拗鞫际怯幸婢蚴菍?duì)環(huán)境無(wú)害的菌株，該制劑的使用范圍也大大的增加。
[0034](2)本發(fā)明在得到高濃度蛭弧菌菌液的同時(shí)，相對(duì)也縮短了發(fā)酵周期，這樣有效的解決了發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致的能源消耗過(guò)大，生產(chǎn)成本過(guò)高的問(wèn)題，得到的蛭弧菌制劑不僅成本低，而且活性高。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1是以?xún)煞N不同宿主(枯草芽孢桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0036]圖2是以?xún)煞N不同宿主(納豆芽孢桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)單核增生李斯特菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0037]圖3是以?xún)煞N不同宿主(兩歧雙歧桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)豬鏈球菌II型和乳房鏈球菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0038]圖4是以?xún)煞N不同宿主(糞腸球菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)表皮葡萄球菌和大腸桿菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0039]圖5是以?xún)煞N不同宿主(保加利亞乳桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)類(lèi)馬鏈球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0040]圖6是以?xún)煞N不同宿主(乳酸片球菌和嗜水氣單胞菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)乳房鏈球菌和大腸桿菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0041]圖7是以?xún)煞N不同宿主(乳酸鏈球菌和豬鏈球II型)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和表皮葡萄球菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0042]圖8是以?xún)煞N不同宿主(屎腸球菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和單核增生李斯特菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0043]圖9是以?xún)煞N不同宿主(地衣芽孢桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)嗜水氣單胞菌和類(lèi)馬鏈球菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0044]圖10是以?xún)煞N不同宿主(嗜酸乳桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0045]圖11是以?xún)煞N不同宿主(干酪乳桿菌和嗜水氣單胞菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)類(lèi)馬鏈球菌和大腸桿菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0046]圖12是以?xún)煞N不同宿主(乳酸乳桿菌和豬鏈球II型)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)表皮葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0047]圖13是以?xún)煞N不同宿主(植物乳桿菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)無(wú)乳鏈球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的裂解能力一時(shí)間圖。
[0048]圖14是以?xún)煞N不同宿主(戊糖片球菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對(duì)乳房鏈球菌和鏈球菌II型的裂解能力一時(shí)間圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0050]實(shí)施例1
[0051]分別以枯草芽孢桿菌(菌種編號(hào):GIM1.136，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和大腸桿菌(Escherichia coli，菌種編號(hào):GM1.137，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)為宿主菌制備蛭弧菌制劑A`和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:[0052](I)枯草芽孢桿菌懸液的制備
[0053]將枯草芽孢桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中(蛋白胨IOg,牛肉膏粉3g,氯化鈉5g，pH7.4±0.2)，置于33°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，5000rpm離心25min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鈉鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L, pH7.6)，得到濃度為1019cfu/mL的枯草芽孢桿菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0054]同上方法，制備濃度為1019cfu/mL的大腸桿菌懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0055](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0056]在磷酸鈉鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.6)中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度 為1012cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水1000mL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自海水的蛭弧菌BDJ02(于2008年I月14日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208012)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)48h，再在4°C，5000rpm離心35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C, 13000rpm離心30min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.6的磷酸鈉鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，置于2°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0057](3)蛭弧菌制劑的制備
[0058]在DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的
2.5%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟
(1)制備的枯草芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的枯草芽孢桿菌的起始濃度為1012cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在28°C ;加入枯草芽孢桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.6 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在28% ;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次枯草芽孢桿菌懸浮液，每次加入枯草芽孢桿菌懸浮液的間隔時(shí)間15h，每次加入枯草芽孢桿菌懸浮液的量以新加入的枯草芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1012cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為I X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0059]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟
(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，制得濃度為IX 109pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0060]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌均有很好的裂解效果。分別以對(duì)革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium，菌株編號(hào):GM1.237，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,菌株編號(hào):GIM1.142,來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液，分別加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的菌體沉淀，每種菌各有兩瓶。調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(10ncfu/mL)。在兩瓶含有鼠傷寒沙門(mén)氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ;同樣，在兩瓶含有金黃色葡萄球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811這九個(gè)時(shí)刻分別取樣，按1(^~1(^1的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，與用大腸桿菌發(fā)酵得到的蛭弧菌制劑B相比，用枯草芽孢桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門(mén)氏菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B好。另外，由枯草芽孢桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0061]實(shí)施例2
[0062]以納豆芽孢桿菌(菌種編號(hào):CGMCC1.1086，來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0063]( I)納豆芽孢桿菌懸液的制備
[0064]將納豆芽孢桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于35°C搖床中培養(yǎng)15h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，6000rpm離心25min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.1mol/L，pH7.4)，得到濃度為1018cfu/mL的納豆芽孢桿菌懸浮液，然后置于2°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0065]同上方法，制備濃度為1018cfu/mL的大腸桿菌懸液，置于2°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0066]( 2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0067]在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.lmol/L，pH7.4)中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1013cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水1000mL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自淡水的蛭弧菌BDR)2(于2008年I月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208009)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)45h，再在4°C，6000rpm離心25min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，14000rpm離心28min，保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡海恋頌轵位【斡倔w，在沉淀中加入0.lmol/L、pH7.4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0068](3)蛭弧菌制劑的制備
[0069]將DNB液體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的納豆芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的納豆芽孢桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在29°C;加入納豆芽孢桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的pH值控制在7.4 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在28% ;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次納豆芽孢桿菌懸浮液，每次加入納豆芽孢桿菌懸浮液的間隔時(shí)間16h，每次加入納豆芽孢桿菌懸浮液的量為以新加入的納豆芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1013cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)45h即制成濃度為I X lO'fu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0070]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，制得濃度為I X 1010pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0071]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、單核增生李斯特菌等致病菌都有很好的裂解效果。分別以對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的單核增生李斯特菌(Listeriamonocytohenes,菌株編號(hào):GIM1.228,來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)的裂解和對(duì)革蘭氏為陰性的豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica，菌株編號(hào):GM1.244，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到單核增生李斯特菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌的菌體沉淀，每種菌各兩瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(101(lCfu/mL)。在兩瓶含有單核增生李斯特菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ；同樣，在兩瓶含有豬霍亂沙門(mén)氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑Blm，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在Oh、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個(gè)時(shí)刻分別取樣，按KT1~10,的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，與用大腸桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用納豆芽孢桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的豬霍亂沙門(mén)氏菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的單核增生李斯特菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由納豆芽孢桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0072]實(shí)施例3
[0073]分別以?xún)善珉p歧桿菌(菌種編號(hào):GM1.169，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0074]( 1)兩歧雙歧桿菌懸液的制備
[0075]將兩歧雙歧桿菌接種于PTYG培養(yǎng)基中，置于37°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在8°C條件下,7000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.3mol/L, pH7.5)，得到濃度為1022cfu/mL的兩歧雙歧桿菌懸浮液，然后置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0076]同上方法，用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制備濃度為1022cfu/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌懸液，置于8 C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0077]( 2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0078]在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.3mol/L, pH7.5)中加入步驟(1)制備的鼠傷寒沙門(mén)氏菌懸浮液，調(diào)整鼠傷寒沙門(mén)氏菌的濃度為101(lCfU/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水1000mL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自土壤的蛭弧菌BDS02(于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M209170)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)50h，再在8 °C，7000rpm離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在8°C, 16000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.3mol/L、pH7.5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，置于15°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0079](3)蛭弧菌制劑的制備
[0080]在DNB液體培養(yǎng)基加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的0.7%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的兩歧雙歧桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的兩歧雙歧桿菌的起始濃度為1015cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C ;加入兩歧雙歧桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.2 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在22% ；培養(yǎng)過(guò)程中加一次兩歧雙歧桿菌懸浮液，每次加入兩歧雙歧桿菌懸浮液的間隔時(shí)間12h，每次加入兩歧雙歧桿菌懸浮液的量以新加入的兩歧雙歧桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1015cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)36h即制成濃度為5 X 10npfu/mL的蛭弧菌制劑A。 [0081]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的鼠傷寒沙門(mén)氏菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，制得濃度為5X 10npfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0082]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)乳房鏈球菌、沙門(mén)氏菌、豬鏈球菌等致病菌均有裂解效果。分別以對(duì)革蘭氏為陰性的豬鏈球菌II型(Streptococcus suis,菌株編號(hào):CVCC3306，來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心)和對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的乳房鏈球菌(Streptococcus uberis,菌株編號(hào):700407,來(lái)源于上海三踏科技有限公司)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到豬鏈球菌II型和乳房鏈球菌的菌體沉淀，每種菌各兩瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(10ncfu/mL)o在兩瓶含有豬鏈球菌II型的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ；同樣，在兩瓶含有乳房鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于 30°C，200rpm 的搖床上培養(yǎng)。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 這九個(gè)時(shí)刻分別取樣，按ΙΟ—1~10_η的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，與用鼠傷寒沙門(mén)氏菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用兩歧雙歧桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的豬鏈球菌II型有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的乳房鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由兩歧雙歧桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0083]實(shí)施例4
[0084]分別以幾腸球菌(Enterococcus faecalis,菌種編號(hào):CGMCC1.131,來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)和豬霍亂沙門(mén)氏菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:[0085](1)糞腸球菌懸液的制備
[0086]將糞腸球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于30°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，6000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH 7.4)，得到濃度為102°cfu/mL的糞腸球菌懸浮液，然后置于2~4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0087]同上方法，制備濃度為102°cfu/mL的豬霍亂沙門(mén)氏菌懸液，置于2~4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0088]( 2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0089]在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L, pH7.4)中加入步驟(1)制備的豬霍亂沙門(mén)氏菌懸浮液，調(diào)整豬霍亂沙門(mén)氏菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“ 一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉
3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.lg，蒸餾水1000mL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自土壤的蛭弧菌BDFM05(于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M209172)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)38h，再在4°C，6000rpm離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，15000rpm離心22min，保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?，沉淀為蛭弧菌游泳體,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDFM05游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0090](3)蛭弧菌制劑的制備
[0091]在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.6)，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的糞腸球菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDFM05游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的糞腸球菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C;加入糞腸球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.2 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在30% ;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次糞腸球菌懸浮液，每次加入糞腸球菌懸浮液的間隔時(shí)間18h，每次加入糞腸球菌懸浮液的量以新加入的糞腸球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1014cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為5 X 101Qpfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0092]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的豬霍亂沙門(mén)氏菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDFM05游泳體濃縮液，制得濃度為5X lO'fu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0093]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均有裂解效果。分別以對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,菌株編號(hào):GIM1.143，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和對(duì)革蘭氏為陰性的大腸桿菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到表皮葡萄球菌和大腸桿菌的菌體沉淀，每種菌兩瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(IO12Cfu/mL)。在兩瓶含有表皮葡萄球菌的緩沖體系中，分別加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL;同樣，在兩瓶含有大腸桿菌的緩沖體系中，分別加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于 30°C，200rpm 的搖床上培養(yǎng)。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 這九個(gè)時(shí)刻分別取樣，按ΙΟ—1~10_12的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅OO μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，與用豬霍亂沙門(mén)氏菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用糞腸球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的大腸桿菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由糞腸球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0094]實(shí)施例5
[0095]分別以保加利亞乳桿菌(菌種編號(hào):GM1.80，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0096]( I)保加利亞乳桿菌懸液的制備
[0097]將保加利亞乳桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于37°C搖床中培養(yǎng)20h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在10°C條件下，6000rpm離心25min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.3mol/L，pH7.3)，得到濃度為1017cfu/mL的保加利亞乳桿菌懸浮液，然后置于2~4°C冰箱中保存?zhèn)溆?
[0098]同上的方法，制備濃度為1017cfu/mL的大腸桿菌懸液，置于2~4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0099]( 2)蛭弧菌游 泳體濃縮液的制備:
[0100]在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.3mol/L，pH7.3)中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1013cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.Sg,酪氨酸酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g,蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自海水的蛭弧菌BDJ02 (于2008年I月14日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208012)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)40h，再在10°C，6000rpm離心25min,保留上清液棄去沉淀,然后將上清液在15°C, 15000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.3mol/L、pH7.3的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，置于2°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0101](3)蛭弧菌制劑的制備
[0102]在蒸餾水中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為蒸餾水體積的2.8%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的保加利亞乳桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的保加利亞乳桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為10pfU/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在28°C ;加入保加利亞乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的pH值控制在7.6 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在21% ;培養(yǎng)過(guò)程中加2次保加利亞乳桿菌懸浮液，每次加入保加利亞乳桿菌懸浮液的間隔時(shí)間18h，每次加入保加利亞乳桿菌懸浮液的量以新加入的保加利亞乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1013cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)40h即制成濃度為I X 10npfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0103]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟
(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，制得濃度為I X 10npfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0104]本制劑對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、類(lèi)馬鏈球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分別以對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的類(lèi)馬鏈球菌(Streptococcus equinus,菌株編號(hào):cvccl925,來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心)和對(duì)革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到類(lèi)馬鏈球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌體沉淀，每種菌兩瓶，調(diào)節(jié)兩瓶緩沖液的菌體濃度一致(10ncfu/mL)。在兩瓶含有類(lèi)馬鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ;同樣，在兩瓶含有鼠傷寒沙門(mén)氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL菌，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個(gè)時(shí)刻分別取樣，按KT1~10,的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，與用大腸桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用保加利亞乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門(mén)氏菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的類(lèi)馬鏈球菌類(lèi)馬鏈球菌裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由保加利亞乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0105]實(shí)施例6
[0106]分別以乳酸片球菌(菌種編號(hào):GIM1.263，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,菌種編號(hào):GIM1.172,來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和`蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0107](I)乳酸片球菌懸液的制備
[0108]將乳酸片球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于30°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在5°C條件下，7000rpm離心15min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.1mol/L，pH7.4)，得到濃度為1022cfu/mL的乳酸片球菌懸浮液，然后置于15°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0109]同上方法，制備濃度為1022cfu/mL的嗜水氣單胞菌懸液，置于15°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0110](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0111]在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.lmol/L, pH7.4)中加入步驟(1)制備的嗜水氣單胞菌懸浮液，調(diào)整嗜水氣單胞菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自淡水的蛭弧菌BDR)3(于2008年I月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208010 )斑，然后將此培養(yǎng)液在30 °C培養(yǎng)54h，再在5 °C，7000rpm離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在5°C，15000rpm離心25min，保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡海恋頌轵位【斡倔w，在沉淀中加入0.lmol/L、pH7.4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDF03游泳體濃縮液，置于10°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0112](3)蛭弧菌制劑的制備
[0113]將蒸餾水裝入發(fā)酵罐,121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的乳酸片球菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDF03游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳酸片球菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為10pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C ;加入乳酸片球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.4 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在24% ;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次乳酸片球菌懸浮液，每次加入乳酸片球菌懸浮液的間隔時(shí)間15h，每次加入乳酸片球菌懸浮液的量以新加入的乳酸片球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1014cfu/mL,發(fā)酵培養(yǎng)45h即制成濃度為5 X IO8的蛭弧菌制劑A。
[0114]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的嗜水氣單胞菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDF03游泳體濃縮液，制得濃度為5X IO8的蛭弧菌制劑B。
[0115]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、乳房鏈球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分別以對(duì)乳房鏈球菌和大腸桿菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到乳房鏈球菌和大腸桿菌的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(101(lCfu/mL)。在兩瓶含有乳房鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL;同樣，在兩瓶含有大腸桿菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811這九個(gè)時(shí)刻分別取樣，按1(^ ~10,的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。從圖6可知，與用嗜水氣單胞菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用乳酸片球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的大腸桿菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的乳房鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由乳酸片球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0116]實(shí)施例7
[0117]分別以乳酸鏈球菌(菌種編號(hào):GIM1.156，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和豬鏈球菌II型為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0118](I)乳酸鏈球菌懸液的制備
[0119]將乳酸鏈球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨IOg,牛肉膏粉3g,氯化鈉5g,pH7.4±0.2)中，置于37°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，6000rpm離心27min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.5)，得到濃度為102°cfu/mL的乳酸鏈球菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0120]同上方法，制備濃度為102°cfu/mL的豬鏈球菌II型懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0121](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0122]在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L, pH7.5)中加入步驟(1)制備的豬鏈球菌II型懸浮液，調(diào)整豬鏈球菌II型的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水1000mL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離土壤的蛭弧菌BDSM08(于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M209171)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)60h，再在4°C，6000rpm離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C, 16000rpm離心25min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDSM08游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0123](3)蛭弧菌制劑的制備
[0124]在pH值為7.2的DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的1.5%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的乳酸鏈球菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDSM08游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳酸鏈球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C ;加入乳酸鏈球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.5 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在27% ;培養(yǎng)過(guò)程中加2次乳酸鏈球菌懸浮液，每次加入乳酸鏈球菌懸浮液的間隔時(shí)間14h，每次加入乳酸鏈球菌懸浮液的量以新加入的乳酸鏈球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1013cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)42h即制成濃度為5X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0125]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的豬鏈球菌II型懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDSM08游泳體濃縮液，制得濃度為5X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0126]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均有裂解效果。分別以對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和表皮葡萄球菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到豬霍亂沙門(mén)氏菌和表皮葡萄球菌的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(101(lcfu/mL)。在兩瓶含有豬霍亂沙門(mén)氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ;同樣，在兩瓶含有表皮葡萄球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h這九個(gè)時(shí)刻分別取樣，按IO-1~10,的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。從圖7可知，與用豬鏈球菌II型發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用乳酸鏈球`菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的豬霍亂沙門(mén)氏菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由乳酸鏈球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0127]實(shí)施例8
[0128]分別以屎腸球菌(菌種編號(hào):CGMCC1.2136，來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0129](I)屎腸球菌懸液的制備
[0130]將屎腸球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨IOg,牛肉膏粉3g,氯化鈉5g,pH7.4±0.2)中，置于32°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，5000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.5)，得到濃度為1018cfu/mL的屎腸球菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0131]同上方法，制備濃度為1018cfu/mL的大腸桿菌懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0132](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0133]在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L, pH7.5)中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水1000mL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自海水的蛭弧菌BDJ02(于2008年I月14日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208012)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)60h，再在4°C，6000rpm離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C, 16000rpm離心25min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為106pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0134](3)蛭弧菌制劑的制備
[0135]在pH值為7.2的DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的2.7%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的屎腸球菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的屎腸球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C ;加入屎腸球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.3 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在26% ;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次屎腸球菌懸浮液，每次加入屎腸球菌懸浮液的間隔時(shí)間14h，每次加入屎腸球菌懸浮液的量以新加入的屎腸球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1013cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)42h即制成濃度為I X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0136]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，制得濃度為I X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0137]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、單核增生李斯特菌等致病菌均有裂解效果。分別以對(duì)單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(10ncfu/mL)。在兩瓶含有單核增生李斯特菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ；同樣，在兩瓶含有鼠傷寒沙門(mén)氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑 BlmL,于 30°C,200rpm 的搖床上培養(yǎng)。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h 這八個(gè)時(shí)刻分別取樣，按ΙΟ—1~10_η的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅OO μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。從圖8可知，與用大腸桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用屎腸球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門(mén)氏菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的單核增生李斯特菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由屎腸球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0138]實(shí)施例9[0139]分別以地衣芽孢桿菌(菌種編號(hào):GM1.182，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0140]( I)地衣芽孢桿菌懸液的制備
[0141]將地衣芽孢桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)，置于33°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，5000rpm離心25min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鈉鉀鹽緩沖液(濃度為
0.2mol/L, pH7.6)，得到濃度為1019cfu/mL的地衣芽孢桿菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0142]同上方法，制備濃度為1019cfu/mL的大腸桿菌懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0143](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0144]在磷酸鈉鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.6)中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水1000mL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自海水的蛭弧菌BDMOl(于2008年4月28日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208066)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)48h，再在4°C，5000rpm離心30min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C, 13000rpm離心30min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.6的磷酸鈉鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDMOl游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0145](3)蛭弧菌制劑的制備
[0146]在DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的
3.0%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟
(I)制備的地衣芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDMOl游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的地衣芽孢桿菌的起始濃度為1012cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C ;加入地衣芽孢桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.2 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在28% ;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次地衣芽孢桿菌懸浮液，每次加入地衣芽孢桿菌懸浮液的間隔時(shí)間15h，每次加入地衣芽孢桿菌懸浮液的量以新加入的地衣芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1012cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為I X 1012pfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0147]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDMOl游泳體濃縮液，制得濃度為I X 1012pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0148]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌均有很好的裂解效果。分別以對(duì)革蘭氏為陰性的嗜水氣單胞菌和對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的類(lèi)馬鏈球菌(Streptococcus equinus,菌株編號(hào):cvccl925,來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液，分別加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到嗜水氣單胞菌和類(lèi)馬鏈球菌的菌體沉淀，每種菌各有兩瓶。調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(1010cfu/mL)o在兩瓶含有嗜水氣單胞菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ；同樣，在兩瓶含有類(lèi)馬鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑 BlmL，于 30°C，200rpm 的搖床上培養(yǎng)。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h這九個(gè)時(shí)刻分別取樣，按KT1~10,的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。從圖9可知，與用大腸桿菌發(fā)酵得到的蛭弧菌制劑B相比，用地衣芽孢桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的嗜水氣單胞菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的類(lèi)馬鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B好。另外，由地衣芽孢桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0149]實(shí)施例10
[0150]分別以嗜酸乳桿菌(菌種編號(hào):GM1.208，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0151](I)嗜酸乳桿菌的制備
[0152]將嗜酸乳桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于32°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，5000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.5)，得到濃度為1017cfu/mL的嗜酸乳桿菌懸浮液，然后置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0153]同上方法，制備濃度為1017cfu/mL的大腸桿菌懸液，置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0154](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0155]在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L, pH7.5)中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.Sg，酪氨酸酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g,蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)曬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自土壤的蛭弧菌BDS02 (于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M209170)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)60h，再在4°C，6000rpm離心20min,保留上清液棄去沉淀,然后將上清液在15°C, 13000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，置于6°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0156](3)蛭弧菌制劑的制備
[0157]將pH值為7.2的DNB液體培養(yǎng)基中裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的嗜酸乳桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌K)S02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的嗜酸乳桿菌的起始濃度為101(lCfu/mL，蛭弧菌起始濃度為10pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C ;加入嗜酸乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.5 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在20% ;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次嗜酸乳桿菌懸浮液，每次加入嗜酸乳桿菌懸浮液的間隔時(shí)間14h，每次加入嗜酸乳桿菌懸浮液的量以新加入的嗜酸乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1013cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)42h即制成濃度為I X 108pfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0158]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟
(2)制備的蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，制得濃度為I X 108pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0159]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌均有裂解效果。分別以對(duì)金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(10ncfu/mL)。在兩瓶含有金黃色葡萄球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ;同樣，在兩瓶含有豬霍亂沙門(mén)氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個(gè)時(shí)刻分別取樣，按KT1~10_n的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。從圖10可知，與用大腸桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用嗜酸乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的豬霍亂沙門(mén)氏菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由嗜酸乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0160]實(shí)施例11
[0161]分別以干酪乳桿菌(菌種編號(hào):GM1.159，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和嗜水氣單胞菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0162](I)干酪乳桿菌的制備
[0163]將干酪乳桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于30°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在5°C條件下，8000rpm離心15min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.1mol/L，pH7.4)，得到濃度為1022cfu/mL的干酪乳桿菌懸浮液，然后置于15°C冰箱中保存?zhèn)溆?；[0164]同上方法，制備濃度為1022cfu/mL的嗜水氣單胞菌懸液，置于15°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0165](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0166]在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.lmol/L, pH7.4)中加入步驟(1)制備的嗜水氣單胞菌懸浮液，調(diào)整嗜水氣單胞菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自淡水的蛭弧菌BDR)2(于2008年I月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208009)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)54h，再在5°C，7000rpm離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在5°C，20000rpm離心15min，保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.lmol/L、pH7.4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，置于2°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0167](3)蛭弧菌制劑的制備
[0168]將蒸餾水裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的干酪乳桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的干酪乳桿菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在29°C ;加入干酪乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.2 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在30%;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次干酪乳桿菌懸浮液，每次加入干酪乳桿菌懸浮液的間隔時(shí)間15h，每次加入干酪乳桿菌懸浮液的量以新加入的干酪乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1014cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)45h即制成`濃度為I X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0169]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的嗜水氣單胞菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，制得濃度為I X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0170]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、類(lèi)馬鏈球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分別以對(duì)類(lèi)馬鏈球菌和大腸桿菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到類(lèi)馬鏈球菌和大腸桿菌的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(1012cfu/mL)o在兩瓶含有類(lèi)馬鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ；同樣，在兩瓶含有大腸桿菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這八個(gè)時(shí)刻分別取樣，按KT1~10-12的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示。從圖11可知，與用嗜水氣單胞菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用干酪乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的大腸桿菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的類(lèi)馬鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由干酪乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑,也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0171]實(shí)施例12
[0172]分別以乳酸乳桿菌(菌種編號(hào):ATCC12315,來(lái)源于American Type CultureCollection)和豬鏈球菌II型為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0173](I)乳酸乳桿菌懸液的制備
[0174]將乳酸乳桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于37°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，6000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.5)，得到濃度為102°cfu/mL的乳酸乳桿菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0175]同上方法，制備濃度為102°cfu/mL的豬鏈球菌II型懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0176](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0177]在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L, pH7.5)中加入步驟(1)制備的豬鏈球菌II型懸浮液，調(diào)整豬鏈球菌II型的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑。)培養(yǎng)出來(lái)的分離土壤的蛭弧菌BDSOI(于2009年8月7日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M209169)斑，然后將 此培養(yǎng)液在40°C培養(yǎng)20h，再在4°C，6000rpm離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，12000rpm離心40min，保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDS01游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0178](3)蛭弧菌制劑的制備
[0179]在pH值為7.2的DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的0.5%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的乳酸乳桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDS01游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳酸乳桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C ;加入乳酸乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.2~7.6 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在23% ;培養(yǎng)過(guò)程中加I次乳酸乳桿菌懸浮液，每次加入乳酸乳桿菌懸浮液的間隔時(shí)間18h，每次加入乳酸乳桿菌懸浮液的量以新加入的乳酸乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1013cfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)42h即制成濃度為5X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0180]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的豬鏈球菌II型懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDS01游泳體濃縮液，制得濃度為5X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0181]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均有裂解效果。分別以對(duì)嗜水氣單胞菌和表皮葡萄球菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到嗜水氣單胞菌和表皮葡萄球菌的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(10ncfu/mL)。在兩瓶含有嗜水氣單胞菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ；同樣，在兩瓶含有表皮葡萄球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811這九個(gè)時(shí)刻分別取樣，按KT1~10_n的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示。從圖12可知，與用豬鏈球菌II型發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用乳酸乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的嗜水氣單胞菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由乳酸乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0182]實(shí)施例13[0183]分別以植物乳桿菌(菌種編號(hào):GIM1.140，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)和豬霍亂沙門(mén)氏菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0184](I)植物乳桿菌的制備
[0185]將植物乳桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于30°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在8°C條件下，6000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.4)，得到濃度為102°cfu/mL的植物乳桿菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0186]同上方法，制備的濃度為102°cfu/mL豬霍亂沙門(mén)氏菌懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0187](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0188]在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L, pH7.4)中加入步驟(1)制備的豬霍亂沙門(mén)氏菌懸浮液，調(diào)整豬霍亂沙門(mén)氏菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50° C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自淡水的蛭弧菌BDR)1(于2008年I月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208008)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)20h，再在2°C，8000rpm離心15min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，15000rpm離心22min，保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為106pfu/mL，得到蛭弧菌BDR)1游泳體濃縮液，置于15°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0189](3)蛭弧菌制劑的制備
[0190]在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.6)，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的植物乳桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDFOl游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的植物乳桿菌的起始濃度為101(lCfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C;加入植物乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.4 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在30% ;培養(yǎng)過(guò)程中加兩次植物乳桿菌懸浮液，每次加入植物乳桿菌懸浮液的間隔時(shí)間18h，每次加入植物乳桿菌懸浮液的量以新加入的植物乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為101QCfu/mL為準(zhǔn)，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為5X 101Qpfu/mL的蛭弧菌制劑A。
[0191]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的豬霍亂沙門(mén)氏菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌 BDFOl游泳體濃縮液，制得濃度為5X lO'fu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0192]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、無(wú)乳鏈球菌等致病菌均有裂解效果。分別以對(duì)無(wú)乳鏈球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到無(wú)乳鏈球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌體沉淀，每種菌兩瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(1010cfu/mL)o在兩瓶含有無(wú)乳鏈球菌的緩沖體系中，分別加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ;同樣，在兩瓶含有鼠傷寒沙門(mén)氏菌的緩沖體系中，分別加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL,于30°C, 200rpm的搖床上培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這九八個(gè)時(shí)刻分別取樣，按1(^~10,的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示。從圖13可知，與用豬霍亂沙門(mén)氏菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用植物乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門(mén)氏菌有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的無(wú)乳鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由植物乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0193]實(shí)施例14
[0194]分別以戊糖片球菌(菌種編號(hào):CGMCC1.2695，來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過(guò)程如下:
[0195](I)戊糖片球菌的制備
[0196]將戊糖片球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH7.4±0.2)中，置于32°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液在4°C條件下，5000rpm離心20min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH7.5)，得到濃度為1018cfu/mL的戊糖片球菌懸浮液，然后置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0197]同上方法，制備濃度為1018cfu/mL的大腸桿菌懸液，置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> [0198](2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備:
[0199]在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L, pH7.5)中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00910042274.6，名稱(chēng)為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)，具體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法:取0.5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0.5mL大腸桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3.5mL50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7.2，瓊脂粉3.5g)混合均勻,傾注于DNB下層平板(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母精提物0.lg，蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來(lái)的分離自海水的蛭弧菌BDJOl(Bdellovibrio sp.BDJOl)(于2008年I月13日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208011)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)60h，再在8°C, 5000rpm離心30min,保留上清液棄去沉淀,然后將上清液在4°C, 16000 rpm離心25min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?沉淀為蛭弧菌游泳體,在沉淀中加入0.2mol/L、pH7.5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDJOl游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0200](3)蛭弧菌制劑的制備
[0201]在pH值為7.2的DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的2.5%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的戊糖片球菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDJOl游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的戊糖片球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下:溫度控制在30°C ;加入戊糖片球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的PH值控制在7.6 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在25% ;培養(yǎng)過(guò)程中加3次戊糖片球菌懸浮液，每次加入戊糖片球菌懸浮液的間隔時(shí)間12h，每次加入戊糖片球菌懸浮液的量以新加入的戊糖片球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為IO13Cfu/mL為準(zhǔn),發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為I X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑A。 [0202]同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟
(2)制備的蛭弧菌BDJOl游泳體濃縮液，制得濃度為I X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑B。
[0203]本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對(duì)乳房鏈球菌、沙門(mén)氏菌、豬鏈球菌II型等致病菌均有裂解效果。分別以對(duì)乳房鏈球菌和豬鏈球菌II型的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到乳房鏈球菌和豬鏈球菌II型的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(101(lCfu/mL)。在兩瓶含有乳房鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL ;同樣，在兩瓶含有豬鏈球菌II型的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑AlmL和蛭弧菌制劑BlmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這八個(gè)時(shí)刻分別取樣，按1(^~10,的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)俑魅?00 μ L的稀釋液分別進(jìn)行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計(jì)算菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示。從圖14可知，與用大腸桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用戊糖片球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對(duì)革蘭氏為陰性的豬鏈球菌II型有更強(qiáng)的裂解效果，而且對(duì)革蘭氏為陽(yáng)性的乳房鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由戊糖片球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過(guò)進(jìn)一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。
[0204]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于包括以下步驟: (1)宿主菌懸液的制備: 將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度，得到濃度為IO17~1022cfu/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2~15°C中保存?zhèn)溆茫凰鏊拗骶鸀槲焯瞧蚓?Pediococcus pentasaceus) CGMCC1.2695 ； (2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備: 在磷酸鹽緩沖液中加入步驟(1)制備的宿主菌懸浮液，調(diào)整宿主菌的濃度為101°~1015cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后將此培養(yǎng)液在20~40°C培養(yǎng)20~60h，再在2~15°C，5000~8000rpm離心15~35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在2~15 °C，12000~20000rpm離心15~40min,保留沉淀?xiàng)壢ド锨逡?沉淀為蛭弧菌游泳體,在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為IO6~109pfu/mL，得到蛭弧菌游泳體濃縮液，置于2~15°C保存?zhèn)溆?；所述蛭弧菌為BDJ01，BDJOl于2008年I月14日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M208011 ； (3)蛭弧菌制劑的制備: 將溶劑滅菌，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的宿主菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌游泳體濃縮液，使宿主菌起始濃度為101°~1015cfu/mL，蛭弧菌游泳體起始濃度為IO1~103pfu/mL，進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵溫度控制在28~30°C，pH值控制在7.2~7.6 ;設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，使溶氧水平控制在20%~30% ;發(fā)酵過(guò)程中加I~3次宿主菌懸浮液，每次加入宿主菌懸浮液的間隔時(shí)間12~18h，每次加入宿主菌懸浮液的量以新加入的宿主菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為101°~1015cfu/mL為準(zhǔn)；發(fā)酵培養(yǎng)36~48h即制成蛭弧菌制劑；所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基、蒸餾水或磷酸鹽緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一`種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于:步驟(1)所述收集菌體的方式為通過(guò)離心分離得到，離心條件為2~15°C, 5000~8000rpm離心15~35min ；所述宿主菌懸浮液的濃度為IO17~1022cfu/mL ;步驟(1)~(3)任一項(xiàng)所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.1~0.3mol/L, pH為7.2~7.6 ;步驟(2)所述蛭弧菌游泳體濃縮液的濃度為IO8 ~1012pfu/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于:步驟(3)所述滅菌的條件為121°C滅菌20min ;所述蛭弧菌制劑的濃度為IO8~1012pfu/mL ;所述DNB液體培養(yǎng)基是將營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.6。
4.一種蛭弧菌制劑，由權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述方法制備得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛭弧菌制劑在制備防治乳房鏈球菌和豬鏈球菌II型藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K35/74GK103725625SQ201310103725
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2010年8月31日
【發(fā)明者】蔡俊鵬, 陳小紅 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)