專利名稱：一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物及制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于治療肝纖維化的植物藥組分組合物及其制備方法，特別涉及一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物及其制備方法。
背景技術：
我國是世界上慢性乙型病毒性肝炎等肝臟疾病的高發(fā)地區(qū)，長期以來慢性肝病對我國人民的健康造成重大危害。但是，到目前肝纖維化治療還是慢性肝病治療中的一大難點。自上世紀80年代起，上海中醫(yī)藥大學成功創(chuàng)制抗肝纖維化國家中藥新藥“扶正化瘀膠囊”(國藥準字20020073)，該藥由丹參、蟲草菌絲、桃仁、絞股藍、松花粉、五味子組成，功效為活血祛瘀、益精補虛。多年研究證實扶正化瘀膠囊可有效改善慢性乙型肝炎肝纖維化，肝組織纖維化分期的逆轉率(較治療前下降I期或I期以上)達52%，通過為期2年的臨床觀察，顯示該藥可降低肝硬化門脈高壓患者的上消化道出血率。但是目前扶正化·瘀膠囊的制劑比較落后，一次服藥5顆膠囊，引起部分患者胃腸道反應，雖然已經(jīng)開發(fā)的片劑可以減少胃部不適，但仍然有進一步提高治療肝纖維化臨床療效的需求?！端幚韺W》記載，桃仁中的苦杏仁苷經(jīng)腸道消化酶分解后可產(chǎn)生大量的氫氰酸，出現(xiàn)氫氰酸中毒。雖然在臨床上從未發(fā)生過患者因服用扶正化瘀復方出現(xiàn)中毒的事件，但是如何防止?jié)撛诘膰乐囟靖弊饔梅浅１匾?。因此，進一步二次開發(fā)扶正化瘀中藥復方，在現(xiàn)有逆轉肝纖維化52%的基礎上再提高療效，減少毒副作用是仍然需要努力的方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物及其制備方法，可明顯提高療效，減少副作用，具有良好的臨床應用前景。本發(fā)明的一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物，原料由蟲草菌絲、丹參和絞股藍組成。所述5組分原液的配伍劑量，按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖180_350mg、蟲草脂溶性組分0.06 0.82ml、丹參酚酸100-190mg、絞股藍皂苷2_68mg、絞股藍多糖3_12mg0優(yōu)選的按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖230 250mg、蟲草脂溶性組分0.1
0.2ml、丹參酚酸120 140mg、絞股藍皂苷10 30mg、絞股藍多糖7 8mg。進一步優(yōu)選的按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖240mg、蟲草脂溶性組分
0.1ml、丹參酚酸130mg、絞股藍皂苷20mg、絞股藍多糖7.3mg。本發(fā)明中的一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物的制備方法，包括:(I)提取所述的5組分:蟲草粗多糖、蟲草脂溶性組分、丹參酚酸、絞股藍皂苷和絞股藍多糖；①蟲草脂溶性組分:取蟲草菌絲體粉，以20%乙醇水溶液制粒后放入超臨界萃取儀的萃取釜中，萃取條件:溫度為45°C，壓力為30MPa，時間為2h，流量為35kg/h。分離條件為:第一級分離壓力為lOMPa，溫度為50°C，第二級分離壓力為6MPa，溫度為40°C。收集分離解析出來的油狀物，得到蟲草脂溶性組分。②蟲草粗多糖:將經(jīng)超臨界萃取后的蟲草菌絲體渣在pH=8的10倍NaOH水溶液中煮沸3小時，共2次，合并后，離心去渣，上清液濃縮，加乙醇至終濃度為75%，冰箱放置，析出多糖，過濾，洗凈干燥③丹參酚酸:取丹參藥材1kg，加入10倍量去離子水，煮沸l(wèi)h，將藥液傾出。藥渣中再加入10倍量去離子水，煮沸l(wèi)h，將藥液傾出。合并兩次提取液，靜置，過濾。濃縮至1.5L，藥液比為1:1.5 (比重為1.11)，加入4.2L95%乙醇至乙醇濃度約為70%，醇沉過夜。離心，將上溶液減壓濃縮至無醇味，約1.5L。取預處理好的HZ-816樹脂2L，濕法裝柱，用去離子水沖洗至無醇味，以1/2床層體積/小時(BV/h)的流速將上述提取濃縮液上柱后，再以2.5BV40%的乙醇洗脫丹酚酸，流速為lBV/h。收集40%乙醇洗脫液，減壓干燥，得黃色固體粉末。經(jīng)測定，丹參酚酸類組分的得率約為8%，其中丹酚酸B等酚酸的含量約為25%。④絞股藍皂苷:稱取絞股藍藥材1kg，加入20倍量的60%乙醇，回流提取2h，過濾。濾液減壓濃縮至浸膏狀。加30%乙醇至料液比1:3，超聲溶解15min，離心，上清液過大孔吸附樹脂。取預處理好的HZ-816樹脂2L，濕法裝柱，用去離子水沖洗至無醇味。將絞股藍提取液以l/4BV/h流速上柱，以l/2BV/h流速用2BV水沖洗，棄去淋洗液。再在相同流速下，以2BV30%乙醇沖洗，棄去淋洗液。最后以3BV95%乙醇洗脫絞股藍皂苷，收集95%乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，得淡黃色固體粉末。經(jīng)測定，絞股藍皂苷類組分的得率約為1%，其中絞股藍總皂苷含量約為40%。⑤絞股藍多糖:將④提取工藝中絞股藍藥渣自然晾干。稱取藥渣500g，以15倍量去離子水回流提取lh，過濾。濾液減壓濃縮至料液比1:1。加95%的乙醇900ml，至含醇量約70%，醇沉過夜。過濾，濾餅用95%乙醇兩次，烘干，粉碎。得黃色絞股藍多糖粉末。經(jīng)測定，絞股藍皂多糖組分的得率約為4%，其中絞股藍多糖含量約為15%。(2)按配伍劑量,制成組分原液。所述組分原液應用于腸道的特定部位緩釋的制劑，用量根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度等調整，可以一次或多次施用。所述植物藥組合物可制成固體制劑，如片劑或膠囊。所述植物藥組合物可制成微膠囊。經(jīng)過多年的實驗和臨床研究，扶正化瘀膠囊抗肝纖維化的作用機制和物質基礎已經(jīng)比較明確。研究發(fā)現(xiàn)蟲草菌絲中的蟲草多糖等組分、桃仁中的苦杏仁苷和丹參中的丹參酚酸A、B有顯著抗肝纖維化作用。如蟲草多糖能促進1、111型膠原降解，明顯降低免疫性肝纖維化大鼠肝臟組織TGF- β I及其TBRI的含量；桃仁中的苦杏仁苷可顯著抑制HSC的增殖與膠原基質成分的合成代謝，促進其分解代謝；丹參酚酸B有顯著的抗四氯化碳(CCl4)以及二甲基亞硝胺(DMN)誘導的大鼠肝纖維化作用，抑制傳代肝星狀細胞(HSC)增殖及膠原生成，抑制TGF- β I的HSC胞內信號轉導，從而減少傳代HSC分泌TGF-Bl的總量并抑制其活化。而丹參酚酸A可通過顯著的抗脂質過氧化損傷作用抑制膠原合成。曾用扶正化瘀方治療0:14誘導的已成型的大鼠肝纖維化，發(fā)現(xiàn) 扶正化瘀方中的各味藥物主要有以下特點:I)桃仁是方中抗肝纖維化、促進肝內膠原纖維降解的主藥；2)丹參對改善肝功能，促白蛋白合成及降低血清膽紅素含量起主要作用；3)冬蟲夏草菌絲是降低血清總膽紅素含量的影響因子；4)絞股藍是該方保護肝細胞、降低血清ALT活性的主藥。因桃仁中的苦杏仁苷有潛在的嚴重毒副作用，而扶正化瘀原方中的松花粉和五味子并非起主要作用的藥物，所以本發(fā)明挑選了扶正化瘀方中具有“扶正”功效的蟲草，具有“活血化瘀”功效的丹參以及具有“清熱解毒”作用的絞股藍等3味中藥。從中提取并純化了 5種有效組分:丹參酚酸(丹參)，絞股藍皂苷、絞股藍多糖(絞股藍)，蟲草粗多糖、蟲草菌絲體CO2超臨界提取物(蟲草菌絲體)。采用均勻設計的方法，對這5種提取組分進行篩選，并用NONMEN法進行分析，篩選出扶正化瘀方的有效組分群最優(yōu)配伍劑量為:蟲草粗多糖(240mg.kg—1)、蟲草脂溶性組分(0.1ml.kg—1)、絞股藍多糖(7.3mg.kg—1)、絞股藍阜苷(20mg.kg4)、丹參酌.酸(130mg.kg-1)。有益.效果本發(fā)明植物藥5組分組合物原料由蟲草菌絲、丹參和絞股藍組成。其作用與蟲草菌絲、桃仁和絞股藍組成的相同，經(jīng)動物實驗具有抗肝纖維化和其他臟器的抗纖維化治療作用，療效較原植物藥復方有增效的趨勢，有利于臨床藥代動力學和藥理學的研究，具有良好的應用前景。


以下附圖中A組為扶正化瘀原方浸膏組；D組為本發(fā)明；圖1為正常組、模型組、A組和D組大鼠肝臟HE染色圖(X 200);圖2為正常組、模型組、A組和D組大鼠肝臟天狼猩紅染色圖(X 100)；圖3為正常組、模型組、A組和D組大鼠肝臟膠原沉積面積變化；圖4為正常組、模型組、A組和D組大鼠肝組織Hyp的含量變化；圖5為正常組、模型組、A組和D組大鼠血清ALT活性；圖6為正常組、模型組、A組和D組大鼠血清AST活性；圖7為正常組、模型組、A組和D組大鼠血清Alb含量；圖8為正常組、模型組、A組和D組大鼠血清TBiL含量。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1扶正化瘀復方有效組分復方的抗肝纖維化療效:1.1 動物:Wistar雄性大鼠59只，SPF級，體重150±10g，中科院上海實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(滬):2007-0005。所有大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF實驗室，普通飲食，自由飲水。1.2主要試劑:
二甲基亞硝胺(dimethy lnitrosamine, DMN),購自東京化成工業(yè)株式會社，批號:MAL05 ;檸檬酸，分析純，批號:F20080916 ;無水乙酸鈉，分析純，批號:F20080714 ；朽1檬酸三鈉(Tr1-sodium citrate),分析純，批號:F20070110 ;對二甲基氨基苯甲醒(4-Dimethylamino benzaldehyde),批號:F20090516 ；氯氨-T (chloramines-T)，分析純，批號:T20061130 ;無水乙醇，分析純，批號:20090716 ;二甲苯，分析純，批號20100123 ；甲醒(Formal dehyde solution),批號:20071019 ;異丙醇(Iso-propanol),分析純，批號:T20070815 ;濃鹽酸，分析純，批號:Τ20090312，以上均購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司。中性樹膠，批號:60090715，購自上海懿洋儀器有限公司。0.9%氯化鈉注射液(Sodium Chloride Injection),批號:090903,購自安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司。戍巴比妥鈉(Pentobarbital Sodium, Lot.N0.WS20090920,德國分裝。輕腦氨酸(hydroxyproline,Hyp)標準品，分析純，Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany 產(chǎn)品。高氯酸(Perchloricacid)，分析純，批號:20070807購自上海桃浦化工廠。血清肝功能試劑盒，包括谷丙轉氨酶(alanine aminotransamine, ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、白蛋白(albumin, Alb)、總膽紅素(total bilirubin, T.Bil),均購自南京建成生物工程研究所。1.3 藥物:蟲草粗多糖、蟲草脂溶性組分、丹參酚酸、絞股藍皂苷、絞股藍多糖同第一部分。扶正化瘀復方的浸膏干粉由上海現(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司提供，批號:100306，主要質控指標(HPLC測定):丹參素鈉10.48mg/g ;腺苷2.5mg/g ;丹參酚酸B12.4mg/g ;水份:6.9%。應用時稀釋為94.5mg/ml的溶液灌胃液。1.4主要儀器:FIM20制冰機，荷蘭菲利浦公司產(chǎn)品。上菱生化專用冰箱，購自上海上菱公司。低溫冰箱(-70°C )，F(xiàn)orma scientific 公司產(chǎn)品。臺式離心機(microfuge lite), Beckman 公司產(chǎn)品。AA-200分析天平，倒置 顯微鏡(37XB)美國Denver儀器公司產(chǎn)品。純水系統(tǒng)(HPLC/UP) ,Labconco公司產(chǎn)品。CQX25-12超聲波清洗器，上海必能超聲有限公司產(chǎn)品。輪轉切片機(RM2035)、HI1220 烤片機、HI1210 恒溫水浴鍋，LEICA ASP300 自動脫水機、LEICA EGl 160石臘包埋機，均購自德國Leica公司。一次成像照相機,Polariod公司產(chǎn)品。XW-80A型旋潤混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。ML-902定時恒溫磁力攪拌器，上海浦江分析儀器廠生產(chǎn)。pH計((p50pHmeter)，Beckmanwc 公司產(chǎn)品。1000 μ 1,200 μ 1、20 μ I 加樣器，法國Gilson公司制造。Μ5多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司生產(chǎn)。Precellys24均質器，法國Bertin公司生產(chǎn)。2.1模型制備Wistar雄性大鼠59只，適應環(huán)境3天后，用隨機數(shù)字表的方法隨機分為正常組(10只)和造模組(49只)。造模組用0.5% DMN按2ml.kg—1體重腹腔注射，首次注射全劑量的2/3，每天I次，連續(xù)注射3d后休息4d，共3周，第4周的前3天分別注射0.5 % DMN全量、2/3量和1/2量。正常組大鼠予相同的時間和部位腹腔注射等量的氯化鈉注射液。2.2 給藥造模第4周，隨機取3只大鼠處死觀察肝臟病變情況，證實有肝纖維化改變后將剩余的46只大鼠用隨機數(shù)字表的方法分為I個模型組(18只)和2個治療組(A、D)，A為扶正化瘀原方浸膏組；D為本發(fā)明，每組14只。D治療組分別用對應的各組組分水溶液按照表I配制劑量，以5ml -kg-1體重灌胃。蟲草脂溶性組分由于不能很好溶于水中，且每IOOg大鼠體重需用量很小，所以用食用油稀釋后按0.5ml.kg—1體重另外灌胃。A組給藥扶正化瘀浸膏，給藥劑量5ml -kg-1體重，正常組和模型組用等劑量的飲用水和食用油灌胃，每天I次共4周。表I中藥組分組灌胃組分提取物配伍劑量
權利要求
1.一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物，按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖180-350mg、蟲草脂溶性組分0.06 0.82ml、丹參酚酸100_190mg、絞股藍皂苷2_68mg、絞股藍多糖3_12mg。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物，其特征在于:按每公斤體重計，所述分別為蟲草粗多糖230 250mg、蟲草脂溶性組分0.1 0.2ml、丹參酚酸120 140mg、絞股藍阜苷10 30mg、絞股藍多糖7 8mg。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物，其特征在于:按每公斤體重計，所述分別為蟲草粗多糖240mg、蟲草脂溶性組分0.1ml、丹參酚酸130mg、絞股藍皂苷20mg、絞股藍多糖7.3mg。
4.一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物的制備方法，包括: (1)提取所述5組分:蟲草粗多糖、蟲草脂溶性組分、丹參酚酸、絞股藍皂苷和絞股藍多糖；①蟲草脂溶性組分:取蟲草菌絲體粉，以20%乙醇水溶液制粒后放入超臨界萃取儀的萃取釜中，萃取條件:溫度為45°C，壓力為30MPa，時間為2h，流量為35kg/h ;分離條件為:第一級分離壓力為lOMPa，溫度為50°C，第二級分離壓力為6MPa，溫度為40°C，收集分離解析出來的油狀物，得到蟲草脂溶性組分； ②蟲草粗多糖:將經(jīng)超臨界萃取后的蟲草菌絲體渣在pH=8的10倍NaOH水溶液中煮沸3小時，共2次，合并后，離心去渣，上清液濃縮，加乙醇至終濃度為75%，冰箱放置，析出多糖，過濾，洗凈干燥； ③丹參酚酸:取丹參藥材1kg，加入10倍量去離子水，煮沸l(wèi)h，將藥液傾出，藥渣中再加入10倍量去離子水，煮沸l(wèi)h，將藥液傾出，合并兩次提取液，靜置，過濾，濃縮至1.5L，藥液比為1: 1.5，加入4.2L95%乙醇至乙醇濃度為70%，醇沉過夜，離心，將上溶液減壓濃縮至無醇味，取預處理好的HZ-816樹脂2L，濕 法裝柱，用去離子水沖洗至無醇味，以1/2床層體積/小時的流速將上述提取濃縮液上柱后，再以2.5BV40%的乙醇洗脫丹酚酸，收集40%乙醇洗脫液，減壓干燥，得黃色固體粉末，其中丹酚酸B等酚酸的含量為25% ； ④絞股藍皂苷:稱取絞股藍藥材1kg，加入20倍量的60%乙醇，回流提取2h，濾液減壓濃縮至浸膏狀，加30%乙醇至料液比1:3，超聲溶解15min，離心，上清液過大孔吸附樹脂，取預處理好的HZ-816樹脂，濕法裝柱，用去離子水沖洗至無醇味，將絞股藍提取液以l/4BV/h流速上柱，以l/2BV/h流速用2BV水沖洗，棄去淋洗液；再在相同流速下，以2BV30%乙醇沖洗，棄去淋洗液，最后以3BV95%乙醇洗脫絞股藍皂苷，收集95%乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，得淡黃色固體粉末，絞股藍皂苷類組分的得率為1%，其中絞股藍總皂苷含量為40% ； ⑤絞股藍多糖:將④絞股藍藥渣自然晾干，稱取藥渣500g，以15倍量去離子水回流提取lh，過濾，濾液減壓濃縮至料液比1: 1，加95%的乙醇900ml，至含醇量約70%，醇沉過夜，過濾，濾餅用95%乙醇兩次，烘干，粉碎，得黃色絞股藍多糖粉末，其中絞股藍多糖含量為15% ； (2)按配伍劑量,制成組分原液。
5.根據(jù)權利要求1所述5組分植物藥組合物，其特征在于:制成應用于腸道的特定部位的制劑，用量根據(jù)患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度調整，一次或多次施用。
6.根據(jù)權利要求5所述的5組分植物藥組合物，其特征在于:所述制劑為片劑或膠囊。
7.根據(jù)權利 要求6所 述的5組分植物藥組合物，其特征在于:所述膠囊制成微膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療肝纖維化的5組分植物藥組合物及制備方法，按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖180-350mg、蟲草脂溶性組分0.06～0.82ml、丹參酚酸100-190mg、絞股藍皂苷2-68mg、絞股藍多糖3-12mg。制備包括(1)提取蟲草粗多糖、蟲草脂溶性組分、丹參酚酸、絞股藍皂苷和絞股藍多糖；(2)按配伍劑量，制成組分原液和各種臨床所用制劑。本發(fā)明作用與蟲草菌絲、桃仁和絞股藍組成的相同,可明顯提高療效，減少副作用，具有良好的臨床應用前景。
文檔編號A61K36/537GK103191189SQ201310111279
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權日2013年4月1日
發(fā)明者徐列明, 馮怡, 胡坪, 李醫(yī)明, 沈嵐, 劉崇敏, 李光偉, 涂馭斌, 潘一峰 申請人:上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司