PPARγ:RXRα異源二聚體激動劑在緩解拉坦前列腺素在臨床上的副作用中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了PPARγ:RXRα異源二聚體激動劑在制備用于預防或治療拉坦前列腺素的施用所引起副作用的藥物中的用途，即PPARγ:RXRα異源二聚體激動劑用于緩解拉坦前列腺素對脂肪細胞分化的抑制作用的用途。因此，PPARγ:RXRα異源二聚體激動劑（例如，羅格列酮、吡格列酮、曲格列酮等）可以用于緩解拉坦前列腺素在臨床上應用的副作用。
【專利說明】PPARy :RXRa異源二聚體激動劑在緩解拉坦前列腺素在 臨床上的副作用中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物治療學領域，具體地，涉及PPARY :RXRa異源二聚體激動劑在制 備用于預防或治療拉坦前列腺素的施用所引起副作用的藥物中的用途。

【背景技術】
[0002] 拉坦前列腺素（Latanoprost)是一種新型苯基替代的丙基酯前列腺素 F2 a，屬 于前列腺素的衍生物。拉坦前列腺素作為選擇性前列腺素 F受體（FP)激動劑，目前在臨 床上主要用于開角型青光眼和高眼壓癥的治療。然而，拉坦前列腺素長期用藥會導致一系 列副作用，包括眼周皮膚和虹膜黑變，睫毛生長增加和眼結膜充血等[Hollo G. The side effects of the prostaglandin analogues. Expert Opin Drug Saf. 2007;6:45 - 52]。除 此之外，長期使用拉坦前列腺素的病人還會出現(xiàn)上眼瞼加深的副作用（deepening of the upper eyelid sulcus(DUES))，進一步的研究發(fā)現(xiàn)這主要是由于眼眶脂肪細胞萎縮所致， 但具體的機制并不清楚[Park J，Cho HK, Moon JI. Changes to upper eyelid orbital fat from use of topical bimatoprost, travoprost, and latanoprost. Jpn J Ophthalmol. 20 1ljan;55(1):22-7]。
[0003] 維甲酸X受體（RXR)作為核受體蛋白超家族的一員，可以自身形成同源二聚體， 還能夠與其他核受體形成異源二聚體行使功能，參與細胞生長分化、代謝調節(jié)、形態(tài)發(fā)生 和胚胎發(fā)育等許多重要的生理過程。其中RXR和PPARy所形成的異源二聚體是脂肪細 胞分化的重要調節(jié)因子，在脂肪細胞分化的過程中起到非常關鍵的作用。而該二聚體的 拮抗劑可以抑制脂肪細胞分化，并降低白色脂肪細胞中甘油三酯的含量[J Clin Invest 108:1001-1013, 2001]〇
[0004] 本發(fā)明人經隨機篩選發(fā)現(xiàn)拉坦前列腺素是維甲酸X受體a (retinoid X receptor α，RXR α )的拮抗劑，可以拮抗PPARy : RXR α異源二聚體的轉錄活性[拉坦前列腺素在治 療糖尿病和/或高甘油三酯血癥及其并發(fā)癥中的應用，申請?zhí)柺?01210075028. 2的中國發(fā) 明專利申請]。


【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述和其他問題，本發(fā)明人進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，拉坦前列腺素是 PPARY :RXRa異源二聚體的特異性拮抗劑，可以濃度依賴性地抑制脂肪細胞的分化， 而PPARY:RXRa異源二聚體激動劑可以緩解拉坦前列腺素的這種抑制作用。因此， PPARY :RXRa異源二聚體激動劑(例如，羅格列酮、吡格列酮、曲格列酮等)可以用于緩解拉 坦前列腺素在臨床上應用的副作用。
[0006] 因此，本發(fā)明的一個目的是提供PPARY :RXRa異源二聚體激動劑在制備用于預 防或治療拉坦前列腺素的施用所引起的副作用的藥物中的用途。
[0007] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括：施用拉坦前列 腺素時造成的眼瞼部脂肪細胞萎縮。更優(yōu)選地，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用 包括：施用拉坦前列腺素治療開角型青光眼或高眼壓癥時造成的眼瞼部脂肪細胞萎縮。
[0008] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述PPARY :RXRa異源二聚體激動劑可以是目前文獻中已報 道的激動劑，例如：羅格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0009] 本發(fā)明中，更優(yōu)選地，所述PPARy :RXRa異源二聚體激動劑為選自羅格列酮、批 格列酮和曲格列酮等中的一種或多種。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種藥物組合物，其包含：治療有效量的拉坦前列腺 素；和治療有效量的PPARY :RXRa異源二聚體激動劑。
[0011] 本發(fā)明中，PPARy :RXR a異源二聚體激動劑能夠預防或治療拉坦前列腺素的施用 所引起副作用，也就是，PPARY :RXRa異源二聚體激動劑能夠緩解拉坦前列腺素對脂肪細 胞分化的抑制作用。
[0012] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述PPARy :RXR a異源二聚體激動劑可以是目前文獻中已報 道的激動劑，例如：羅格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0013] 本發(fā)明中，更優(yōu)選地，所述PPARY :RXRa異源二聚體激動劑為選自羅格列酮、批 格列酮和曲格列酮等中的一種或多種。
[0014] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述藥物組合物進一步包含藥學上可接受的載體。
[0015] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種預防或治療拉坦前列腺素的施用所引起的副作 用的方法，其包括向需要的對象施用治療有效量的PPARY :RXRa異源二聚體激動劑。
[0016] 本發(fā)明中，更優(yōu)選地，所述PPARy :RXR a異源二聚體激動劑可以是目前文獻中已 報道的激動劑，例如：羅格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0017] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述PPARY :RXRa異源二聚體激動劑為選自羅格列酮、吡格 列酮和曲格列酮等中的一種或多種。
[0018] 本發(fā)明中，術語"有效量"可指為實現(xiàn)預期的效果所需的劑量和時段的有效的量。 此有效量可能因某些因子而產生不同的變化，如疾病的種類或治療時疾病的病癥、被施用 的特定標的器官的構造、病人個體大小、或疾病或癥狀的嚴重性。本領域具有通常知識者不 需要過度實驗即可憑經驗決定特定化合物的有效量。
[0019] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 PPARY :RXRa異源二聚體激動劑可以緩解拉坦前列腺素對脂肪 細胞分化的抑制作用。該發(fā)現(xiàn)對開發(fā)緩解開角型青光眼和高眼壓癥治療的一線臨床藥物拉 坦前列腺素的副作用藥物有指導意義。本發(fā)明人還進一步發(fā)現(xiàn)了 PPARY:RXRa異源二聚 體激動劑的新應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1示出了拉坦前列腺素對RXRa :NR的轉錄激活作用的影響。###. P〈0. 001， ##.P〈0.01，與第一道陰性對照（DMS0組）比較。單因素方差分析（One-way AN0VA)。
[0021] 圖2示出了拉坦前列腺素可以顯著地抑制脂肪細胞的分化。
[0022] 圖3示出了羅格列酮可以逆轉拉坦前列腺素的抑制細胞分化作用。
[0023] 圖4示出了拉坦前列腺素可以顯著性抑制脂肪酸合成酶（FAS)的mRNA水平。***. P〈0. 001，與第一道陰性對照（DMS0組）比較。單因素方差分析（One-way AN0VA)。
[0024] 圖5示出了羅格列酮可以逆轉拉坦前列腺素的抑制脂肪酸合成酶（FAS)mRNA的作 用。P〈0. 001，與第一道溶劑組比較。###. P〈0. 001，與第二道拉坦前列腺素組比較。單 因素方差分析（One-way ANOVA)。

【具體實施方式】
[0025] 在下文中，將通過示例性提出的實施例來更加詳細地描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明的 范圍并不限于實施例。
[0026] 實施例1 :拉坦前列腺素是PPARy :RXRa異源二聚體的特異性拮抗劑
[0027] 在先前的研究中，本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)拉坦前列腺素是維甲酸X受體a (retinoid X rec印tora，RXRa )的拮抗劑，可以拮抗PPARy :RXRa異源二聚體的轉錄活性[申請?zhí)?是201210075028. 2的中國發(fā)明專利申請]。
[0028] 進一步地，本發(fā)明在細胞水平上通過核受體RXRa :NR (其中，NR表示：FXR、 PPAR a、PPAR δ、LXR a、LXR β 或 RXR a )順式反應元件（NRE (NRE 表示：FXRE、PPRE、LXRE 或RXRE))調控的熒光素酶報告基因測定的方法測試了拉坦前列腺素對除RXRa :PPARy異 源二聚體以外的RXRa其他同源或異源二聚體的反式激活活性的影響。研究結果表明，拉 坦前列腺素對除RXRa :PPARY異源二聚體以外的RXRa其他的同源或異源二聚體均沒有 激動或拮抗作用，因此，拉坦前列腺素是PPARY :RXRa異源二聚體的特異性拮抗劑。
[0029] 1、實驗原理：
[0030] 在細胞質中，RXRa與其他核受體或自身形成異源或同源二聚體并招募共激 活因子，然后入核，在其他相關轉錄因子的協(xié)助下作用于靶基因的順式反應元件上從而 啟動該基因的轉錄。將順式反應元件（NRE)克隆到pGL3-啟動子載體中構建重組載體 pGL3-NRE-Luc，在該重組載體中，螢火蟲熒光素酶基因的轉錄只受到反應元件NRE的控 制。因此，螢火蟲熒光素酶的活性就相當于RXRa :NR的反式激活活性。將p⑶NA3. 1-NR， p⑶NA3. 1-RXRa，PGL3-NRE-Luc及內參質粒pRL-SV40共轉染到細胞中，通過分別測定螢火 蟲熒光素酶及內參熒光素酶活性，二者的比值即表征RXRa :NR的反式激活活性。
[0031] 2、實驗材料與方法
[0032] 1)細胞培養(yǎng)：HEK-293細胞(來源：ATCC)在DMEM (Gibco公司）培養(yǎng)基（10%FBS (Gibco公司））中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為37° C，5%C02)。
[0033] 2)瞬時轉染及NR順式反應元件調控的熒光素酶報告基因測定：脂質體轉染法 參照Invitrogen公司Lipo2000試劑說明書進行。HEK-293細胞接種在24孔板上，當細 胞生長至50?70%密度時，利用脂質體（Invitrogen公司）瞬時共轉染pGL3-NRE-Luc、 pCDNA3. 1-NR、pCDNA3. Ι-RXRa及內參質粒pRL-SV40,轉染12小時后將培養(yǎng)基換成DMEM (10%FBS)，同時加化合物（陽性激動劑(劑量見下面說明)，或拉坦前列腺素（20 μ M)，或陽性 激動劑和拉坦前列腺素(劑量同前))或DMS0 (作為陰性對照)孵育18小時，吸去培養(yǎng)基，PBS 洗一次，用Luciferase試劑盒（Promega公司)裂解細胞并測定螢火蟲熒光素酶和內參熒光 素酶的活性（Luciferase測定方法參照Promega公司Luciferase試劑盒說明書進行)。本 實驗以維 A 酸（retinoic acid(RA，200nM)) (RXR 配體)、T0901317 (LXRa/β 配體，5μΜ)、 6評501516(--八1^配體，1(^]\〇、非諾貝特^611〇打13四七6(--41^配體，1(^]\〇)和0?^ (FXR配體，10 μ Μ)為陽性激動劑（陽性對照)。
[0034] 3)上述所列陽性激動劑和拉坦前列腺素全部購自Sigma公司。
[0035] 4) Luciferase信號檢測所用儀器是：TECAN公司的GENios酶標儀。
[0036] 3、實驗結果
[0037] 結果如圖1所示，與陰性對照DMS0 (溶齊[J)組相比，陽性激動劑可以激動RXR a : NR 的轉錄活性，而拉坦前列腺素既不能激動RXRa :NR的轉錄活性，也不能拮抗陽性激動劑對 RXRa :NR的激動作用。
[0038] 實施例2 :羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素對3T3-L1脂肪細胞分化的抑制作用
[0039] 本發(fā)明在細胞水平測試了拉坦前列腺素對前脂肪細胞分化的影響以及 PPARY:RXRa異源二聚體激動劑羅格列酮對拉坦前列腺素這種作用的影響。實驗表明，拉 坦前列腺素能濃度依賴性地抑制脂肪細胞分化，而羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素的這種 抑制作用。
[0040] 1、實驗材料和方法
[0041] 1) 3T3-L1前脂肪細胞：購自ATCC。
[0042] 2)羅格列酮及分化誘導試劑（IBMX (3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 (3-Isobutyl-l-methylxanthine) )、Dex (地塞米松（Dexamethasone))、膜島素（insulin)): 購自Sigma公司。
[0043] 3)拉坦前列腺素：購自Sigma公司。
[0044] 4)脂肪細胞分化測定實驗方法：將3T3-L1前脂肪細胞鋪于細胞培養(yǎng)板，置于 37°C、5%C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合2天后，加含0. 5mM IBMX (3-異丁基-1-甲基黃嘌 呤（3-Isobutyl-l-methylxanthine) )、1 μ M Dex(地塞米松（Dexamethasone) )、1 μ g/mL 膜 島素（insulin)的10%FBS的DMEM培養(yǎng)48小時，換以含1 μ g/mL胰島素的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 小時，隨后以加10%FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，2天換培養(yǎng)液一次。在3T3-L1前脂肪細胞誘導分 化的第1天即加入不同濃度的拉坦前列腺素（1、10、20 μ M)及羅格列酮（10 μ M)，直至實驗 結束。然后用油紅〇染色法檢測細胞分化效率：移去誘導分化7天細胞的培養(yǎng)液，用PBS洗 3次，用10%甲醛固定液固定細胞10分鐘，PBS洗3次，然后以油紅0染色細胞，倒置顯微鏡 下觀察結果，拍攝照片。
[0045] 2、實驗結果：
[0046] 結果如圖2和3所示，拉坦前列腺素可以顯著地抑制脂肪細胞的分化，而羅格列酮 可以緩解拉坦前列腺素的抑制細胞分化作用。
[0047] 實施例3 :羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素對成熟脂肪細胞中脂肪酸合成酶mRNA 水平的抑制作用
[0048] 本發(fā)明在細胞水平測試了拉坦前列腺素對分化后脂肪細胞中脂肪酸合成酶（FAS) 的影響以及PPARy :RXRa異源二聚體激動劑羅格列酮對拉坦前列腺素這種作用的影響。 實驗表明，拉坦前列腺素能濃度依賴性地抑制分化后脂肪細胞中脂肪酸合成酶（FAS)的 mRNA水平，而羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素的這種抑制作用。
[0049] 1、實驗材料和方法
[0050] 1) 3T3-L1前脂肪細胞分化：同實施例2。
[0051] 2)羅格列酮：購自Sigma公司。
[0052] 3)拉坦前列腺素：購自Sigma公司。
[0053] 4)脂肪酸合成酶mRNA水平測定實驗方法：分化后的3T3-L1脂肪細胞，孵育化合 物(拉坦前列腺素（1、10、20 μ Μ)及羅格列酮（10 μ Μ)) 24小時后，抽提細胞的RNA。方法如 下：處理過的細胞用預冷的PBS洗三遍，加入lmL TRIZOL (Promega公司）裂解細胞5分 鐘。加入200yL三氯甲烷并劇烈搖晃15秒后靜置3分鐘，于4° C以13000rpm轉速離 心18分鐘，取500 μ L上清。隨后加入500 μ L異丙醇上下顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。其 后4° C以13000rpm轉速離心18分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇清洗一次，再4° C低溫以 13000rpm轉速離心5分鐘，最后棄上清并待沉淀完全干燥。干燥后的沉淀用DEPC水溶解并 測定抽提的總mRNA量。使用反轉錄試劑盒將1 μ g總mRNA反轉錄為cDNA (反轉錄程序為 37° C15分鐘；85° C5秒終止反應)。樣品cDNA采用SYRB熒光探針試劑盒（TaKaRa公司） 在0pticon2system (MJ公司）上進行實時定量PCR擴增。引物序列如下：
[0054] GAPDH: 5 ' -ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3 ' (sense)，
[0055] 5, -TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3，(antisense);
[0056] FAS: 5 ' -GGCTCTATGGATTACCCAAGC-3 '（sense)，
[0057] 5' -CCAGTGTTCGTTCCTCGGA-3' （antisense)。
[0058] 2、實驗結果：
[0059] 結果如圖4和5所示，拉坦前列腺素能濃度依賴性地抑制分化后脂肪細胞中脂肪 酸合成酶（FAS)的mRNA水平，而羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素的這種抑制作用。
[0001] <11〇>屮Η科學院丄海藥物研究所 <120〉PPARr:RXRa異源二聚體激動劑在緩解拉圯前列腺?在臨Λ上的副作ffl屮的應ffl <130> DI13-038oE-XC37 <160> 4 <170> PatentIn version 3. 3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> GAH)H 引物 <400> 1 acagcaacag ggtggtggac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人丨:序列 <220> <223> GAPDH 引物 <400> 2 tttgagggtg cagcgauctt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213>人丄序列 <220> <523> FAS 引物 <400> 3 ggctctatgg attacccaag c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213>人I :序列 <220> <223> FAS 引物 ；400> 4 (OHgtgttcg ttcctcgga 19
【權利要求】
1. PPARY :RXRa異源二聚體激動劑在制備用于預防或治療拉坦前列腺素的施用所引 起的副作用的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括 施用拉坦前列腺素時造成的眼瞼部脂肪細胞萎縮。
3. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括 施用拉坦前列腺素治療開角型青光眼或高眼壓癥時造成的眼瞼部脂肪細胞萎縮。
4. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中，所述PPARY:RXRa異源二聚體激動劑為選自羅 格列酮、吡格列酮和曲格列酮中的一種或多種。
5. -種藥物組合物，其包含：治療有效量的拉坦前列腺素；和治療有效量的 PPARY:RXRa異源二聚體激動劑。
6. 根據(jù)權利要求5所述的藥物組合物，其中，所述PPAR γ : RXR a異源二聚體激動劑為 選自羅格列酮、吡格列酮和曲格列酮中的一種或多種。
7. 根據(jù)權利要求5所述的藥物組合物，其進一步包含藥學上可接受的載體。
【文檔編號】A61K45/00GK104096232SQ201310111552
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月1日 優(yōu)先權日:2013年4月1日
【發(fā)明者】沈旭, 陳靜, 陳莉莉 申請人:中國科學院上海藥物研究所