專利名稱：一種治療b細胞淋巴瘤的組合藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物，具體地說，是關(guān)于治療B細胞淋巴瘤的組合藥物。
背景技術(shù)：
淋巴瘤是原發(fā)于淋巴結(jié)或淋巴組織的惡性腫瘤。臨床以無痛性，進行性淋巴結(jié)腫大為主要表現(xiàn)。本病可發(fā)生于任何年齡，但發(fā)病年齡高峰在3廣40歲，其中非霍奇金淋巴瘤高峰略往前移。男女之比為:2 3:1。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種治療B細胞淋巴瘤的組合藥物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:治療B細胞淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由西藥和中藥藥物組成，所述的西藥是SAHA，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥制成:苦參5-15份、玄參5-10份、丹皮10-20份。所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥制成:苦參8-12份、玄參6-9份、丹皮12-18 份。所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥制成:苦參10份、玄參7份、丹皮15份。所述的SAHA和中藥藥 物比例為1-1OmM:l-30mg/ml。所述的SAHA和中藥藥物比例為2.5mM:20mg/mL.
本發(fā)明優(yōu)點在于:通過使用本發(fā)明的組合藥物，發(fā)揮組合藥物的協(xié)同作用，可以協(xié)同抑制B淋巴瘤細胞生長增殖，協(xié)同誘導(dǎo)B淋巴瘤細胞凋亡。藥物組合在提高療效的同時下可大幅降低費用，降低副作用。使用本發(fā)明的組合藥物可以克服現(xiàn)有技術(shù)中單獨使用一種藥物引起耐藥的缺點。


圖1顯示流式細胞儀檢測SU-DHL-4凋亡對照組的效果圖。圖2顯示單用西藥SU-DHL-4凋亡的效果圖。圖3顯示單用中藥藥物SU-DHL-4凋亡的效果圖。圖4顯示合用藥物SU-DHL-4凋亡的效果圖。圖5顯示流式細胞儀檢測Daudi凋亡對照組的效果圖。圖6顯示單用西藥Daudi凋亡的效果圖。圖7顯示單用中藥藥物Daudi凋亡的效果圖。圖8顯示合用藥物Daudi凋亡的效果圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。
實施例1
中藥藥物制備(一)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(2次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(2次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材5mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例2 中藥藥物制備(二)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(I次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(2次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材lmg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例3 中藥藥物制備(三)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(2次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(3次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材10mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例4 中藥藥 物制備(四)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材20mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例5 中藥藥物制備(五)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(2次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(2次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材30mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例6 中藥藥物制備(六)
取中藥苦參50g、玄參100g、丹皮IOOg置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材20mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例7 中藥藥物制備(七)
取中藥苦參150g、玄參50g、丹皮200g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材20mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例8 中藥藥物制備(八)
取中藥苦參80g、玄參60g、丹皮180g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材20mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。
實施例9 中藥藥物制備(九) 取中藥苦參120g、玄參60g、丹皮120g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材20mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。
實施例10 中藥藥物制備(十) 取中藥苦參150g、玄參100g、丹皮200g置煎煮容器內(nèi)，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材20mg/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。
實施例11 藥效實驗 (一)試劑 環(huán)庚基酰基苯胺異羥肟酸(SAHA)是異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿鄥?、玄參、丹皮， (二)細胞培養(yǎng) 本研究應(yīng)用了以下兩種細胞株:采用⑶20陽性B淋巴瘤細胞系SU-DHL-4和Daudi細胞，細胞在5%C02-95%空氣，飽和濕度以及37° C的條件下，培養(yǎng)于RPM1-1640培養(yǎng)液中(Gibco/BRL)，并加入10%胎牛血清。在每次實驗中，細胞接種密度為3X IO5/ml。細胞的存活率采用臺盼蘭拒染實驗檢測。細胞形態(tài)學(xué)觀察采用瑞氏染色法。
(三)MTT實驗 在96孔板中，用SAHA終濃度選用0、1、2.5、5、7.5和10mM，中藥藥物(苦參、玄參和丹皮)組終濃度選用O、1、5、10、20和30mg/ml處理細胞。O劑量組用1640培養(yǎng)液代替。72小時后，向每孔中加入0.1 mg MTT，在37°C下孵育4小時后，在分光光度計570nm處測量標(biāo)本吸光度值。
(四)流式細胞儀檢測annexin-V和線粒體跨膜電位: 細胞凋亡用ApoAlert Anne xin V-FITC Apoptosis kit(BD)進行分析。在檢測線粒體跨膜電位中，細胞用PBS洗后，在37°C下與10 mg/ml Rhl23孵育30分鐘，然后再用50 mg/ml PI染色。熒光強度用流式細胞儀進行測量。
(五)免疫印跡分析:用 200 ml Laemmli 裂解緩沖液(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8，2mM EDTA, 10% glycerol,2% SDS and 5% b-mercaptoethanol)裂解 5xl06 細胞。蛋白裂解物(20 mg)用于 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜在溶于TBS/0.05% Tween 20的5%脫脂牛奶中封閉，之后與一抗在室溫孵育2小時，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育I小時。免疫復(fù)合物用辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測。
(六)核蛋白分離: 每1父107細胞與裂解緩沖液(10 1111!^^5，10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT,pH 7.9)洗后，重懸于提取緩沖液(20 mM HEPES, pH 7.9，420 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.2mM EDTA and 25%甘油)中，冰上孵育20分鐘。12000Xg離心10分鐘后，上清即為核蛋白。(七)統(tǒng)計分析:
實驗結(jié)果用三次獨立實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗來比較差異。P值小于0.05則認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。所有的統(tǒng)計采用SAS8.2軟件。(A)結(jié)果:
采用SU-DHL-4，Daudi細胞進行培養(yǎng)，通過分析觀察SAHA、中藥藥物組單獨及聯(lián)合應(yīng)用對細胞生長增殖的影響。SAHA (2.5mM)聯(lián)合中藥藥物(20mg/ml)應(yīng)用48小時可顯著抑制SU-DHL-4, Daudi細胞的增殖。用流式細胞儀檢測 單用及合用藥后細胞的凋亡(Annexin V和PI雙染法)。SU-DHL-4 (細胞株 I)經(jīng) SAHA (2.5mM)、中藥藥物(20mg/ml)及 SAHA (2.5mM)聯(lián)合中藥藥物(20mg/ml)處理的48小時后，Annexin V陽性細胞分別為:對照組3.4% (見圖
1);SAHA組26.3% (見圖2);中藥藥物組7.3% (見圖3) ;SAHA與中藥藥物合用組49.7%(見圖4)。在Daudi (細胞株2):對照組3.0% (見圖5);SAHA組24.2% (見圖6);中藥藥物組6.4% (見圖7) ;SAHA與中藥藥物合用組48.7% (見圖8)。同時我們應(yīng)用Berenbaum建立的等效應(yīng)線圖法分析SAHA與中藥藥物的聯(lián)合應(yīng)用是協(xié)同、相加或拮抗。
權(quán)利要求
1.一種治療B細胞淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由西藥和中藥藥物組成，其特征在于，所述的西藥是SAHA，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥制成:苦參5-15份、玄參5-10份、丹皮10-20份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合藥物，其特征在于，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥制成:苦參8-12份、玄參6-9份、丹皮12-18份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合藥物，其特征在于，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥制成:苦參10份、玄參7份、丹皮15份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合藥物，其特征在于，所述的SAHA和中藥藥物比例為1-10 μ M: 1-30 μ g/ml 0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合藥物，其特征在于，所述的SAHA和中藥藥物比例為·2.5 μ M:20 μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療B細胞淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由西藥和中藥藥物組成，所述的西藥是SAHA，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥制成苦參5-15份、玄參5-10份、丹皮10-20份。本發(fā)明優(yōu)點在于通過使用本發(fā)明的組合藥物，發(fā)揮組合藥物的協(xié)同作用，可以協(xié)同抑制B淋巴瘤細胞生長增殖，協(xié)同誘導(dǎo)B淋巴瘤細胞凋亡。藥物組合在提高療效的同時下可大幅降低費用，降低副作用。使用本發(fā)明的組合藥物可以克服現(xiàn)有技術(shù)中單獨使用一種藥物引起耐藥的缺點。
文檔編號A61K36/808GK103156951SQ201310124220
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者夏飛 申請人:太倉市勝舟生物技術(shù)有限公司