專利名稱：高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用及構(gòu)建方法
高砸誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用及構(gòu)建方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于糖尿病防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物模型的構(gòu)建是醫(yī)學(xué)研究中的一項(xiàng)很重要的技術(shù)。構(gòu)建與人類發(fā)病相似的疾病模型，可以克服人類本身發(fā)生疾病潛伏期長(zhǎng)、影響因素多、發(fā)生發(fā)展緩慢、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等因素的制約，更好地反應(yīng)疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，并有利于研究不便于在人類本身進(jìn)行研究的疾病。常用的動(dòng)物模型主要包括自發(fā)性動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。自發(fā)性動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型應(yīng)用價(jià)值較高，但其造模成本高、技術(shù)飼養(yǎng)條件要求高等特點(diǎn)限制了這些動(dòng)物模型的普遍應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型操作簡(jiǎn)單、成本低、成模率較高，目前，這類動(dòng)物模型被廣泛使用。
近年來，全球糖尿病患病率快速、大幅上升。1980-2010年間，美國(guó)糖尿病確診人數(shù)從560萬增加到2090萬，其中65歲及以上人群中有將近27%都患有糖尿病。如果按照這樣的趨勢(shì)繼續(xù)發(fā)展，至2050年預(yù)計(jì)美國(guó)將有1/3的成年人患有糖尿病。據(jù)美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)估計(jì)，2007年美國(guó)用于治療糖尿病的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)1740億美元。2010年，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表的一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)進(jìn)行的大規(guī)模人群調(diào)查顯示，20歲或20歲以上的成年人中有9240萬(總?cè)丝诘?.7%)患有糖尿病，此外，1482萬成年人(總?cè)丝诘?5.5%)患有前驅(qū)糖尿病。尤其需要警惕的是，大多數(shù)糖尿病病例(60.7%)未被診斷和治療?？梢?，糖尿病在中國(guó)已經(jīng)達(dá)到了大規(guī)模流行的態(tài)勢(shì)。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，中國(guó)作為一個(gè)人口眾多的發(fā)展中國(guó)家，面臨更大的糖尿病相關(guān)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)負(fù)擔(dān)。
糖尿病成為全球范圍內(nèi)的一個(gè)重大公共衛(wèi)生問題，在群體層面及時(shí)地預(yù)防該病的發(fā)生顯得尤為重要，而更加明確的防治措施需要機(jī)制研究指明預(yù)防和治療的新方向。因此，探明糖尿病發(fā)病機(jī)制并尋找新的防治策略是一項(xiàng)十分緊迫的任務(wù)。
2型糖尿病患者占糖尿病總?cè)藬?shù)的90%以上，胰島素抵抗是2型糖尿病的基本病理生理機(jī)制。胰島素抵抗是指肝、肌肉、脂肪等胰島素作用的靶組織，不能響應(yīng)胰島素導(dǎo)致胰島素的功能減弱甚至缺失的病理狀態(tài)。除2型糖尿病之外，胰島素抵抗還與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，對(duì)胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制及防治研究顯得尤為重要。目前，胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制還不明確。
在正常的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中，胰島素與其受體結(jié)合啟動(dòng)胰島素信號(hào)，激活受體內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致受體細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的酪氨酸磷酸化。激活的受體，又募集并磷酸化一系列底物分子。進(jìn)而激活磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositide-3_kinase,PI3K)/蛋白激酶B (Protein kinase B，Akt)。蛋白激酶B是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)過程中的一種重要的激酶，胰島素刺激條件下其磷酸化水平的高低常被用來作為胰島素信號(hào)傳導(dǎo)是否正常的指標(biāo)。胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平明顯降低。
硒是人體必需的一種微量元素，對(duì)人體健康至關(guān)重要。硒缺乏可以導(dǎo)致多種病癥。因此，全球范圍內(nèi)補(bǔ)硒成為一種熱潮。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為硒缺乏可以導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病。然而，由于硒的治療窗很窄，過高水平的硒對(duì)人體也可能造成負(fù)面效應(yīng)。最近的一系列研究就對(duì)補(bǔ)硒有益健康這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)提出挑戰(zhàn)。尤其是美國(guó)的一項(xiàng)大規(guī)模營(yíng)養(yǎng)干預(yù)研究發(fā)現(xiàn):在12年的時(shí)間內(nèi)，每天服用200 u g硒的人群比服用安慰劑的人群患2型糖尿病的幾率高2倍。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用及構(gòu)建方法，能夠快速、成本低的誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型，克服了沒有相關(guān)動(dòng)物模型對(duì)高硒相關(guān)胰島素抵抗機(jī)制的研究和相關(guān)藥物的開發(fā)的限制。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用，所述的高硒為每天按照IOOiI g/kg 200 V- g/kg的用量給予。
所述高硒誘導(dǎo)血糖水平升高的誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型。
所述高硒誘導(dǎo)蛋白激酶B磷酸化水平降低的誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型。
所述高硒誘導(dǎo)磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸脫氫酶表達(dá)升高的誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型。
一種胰島素抵 抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
I)選用SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重180±20g，動(dòng)物自由攝食飲水；
2)對(duì)選用的SD大鼠每天灌胃IOOii g/kg 200li g/kg的硒,6周后得到胰島素抵抗動(dòng)物模型。
所述每天灌胃相應(yīng)含量的含硒化物。
所述對(duì)選用的SD大鼠每天灌胃219 ii g/kg 438 U g/kg的亞硒酸鈉。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
鑒于目前還沒有高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗的動(dòng)物模型，本發(fā)明提供的高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用及構(gòu)建方法，能夠誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型，克服了沒有相關(guān)動(dòng)物模型對(duì)高硒相關(guān)胰島素抵抗機(jī)制的研究和相關(guān)藥物的開發(fā)的限制；而且其具有造模方法簡(jiǎn)單、成模率高、造模周期短。成本低以及重現(xiàn)性好的優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明方法的特點(diǎn)為使用高硒誘導(dǎo)糖脂代謝紊亂，通過高硒誘導(dǎo)糖脂代謝紊亂，進(jìn)而誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。應(yīng)用本方法構(gòu)建的胰島素抵抗動(dòng)物模型具有與人類高硒胰島素抵抗相似的特征表現(xiàn)，是研究胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)病機(jī)制以及進(jìn)行防治藥物篩選的理想模型。
本發(fā)明提供的高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用及構(gòu)建方法，所誘導(dǎo)的動(dòng)物模型與對(duì)照相比，模型組動(dòng)物糖耐量和胰島素耐量與正常對(duì)照組動(dòng)物有顯著差異，模型組動(dòng)物胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平顯著降低，模型組糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)顯著升高，表明模型組動(dòng)物已經(jīng)發(fā)生明顯的胰島素抵抗，而且有利于以這些作為篩選依據(jù)進(jìn)行相關(guān)藥物的篩選。


圖1為腹腔注射葡萄糖耐量測(cè)試中血糖水平檢測(cè)結(jié)果圖2為胰島素耐量試驗(yàn)中各時(shí)間點(diǎn)血糖水平檢測(cè)結(jié)果圖3為胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平檢測(cè)結(jié)果圖4為模型組磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸脫氫酶檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
本發(fā)明每天按照IOOii g/kg 200li g/kg的用量給予,從而進(jìn)行誘導(dǎo)；通過高硒誘導(dǎo)糖脂代謝紊亂，進(jìn)而誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。應(yīng)用本方法構(gòu)建的胰島素抵抗動(dòng)物模型具有與人類高硒胰島素抵抗相似的特征表現(xiàn)。
所構(gòu)建的胰島素抵抗動(dòng)物模型的測(cè)定結(jié)果表明:模型組動(dòng)物糖耐量和胰島素耐量與正常對(duì)照組動(dòng)物有顯著差異，模型組動(dòng)物胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平顯著降低，模型組糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)顯著升高，表明模型組動(dòng)物已經(jīng)發(fā)生明顯的胰島素抵抗。
下面給出具體的構(gòu)建過程及檢測(cè)結(jié)果。
1、實(shí)驗(yàn)儀器
血糖測(cè)定儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)、精密電子天平、灌胃針等。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料
2.1構(gòu)建動(dòng)物
SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重180±20g，分別標(biāo)記；由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2.2構(gòu)建材料
亞硒酸鈉、生理鹽水、苦味酸、血糖試紙、胰島素、葡萄糖。
3、構(gòu)建方法
45只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和低劑量亞硒酸鈉和高劑量亞硒酸鈉組，各15只。分別以219 g/kg、438 g/kg的劑量灌胃亞硒酸鈉(生理鹽水溶解)，對(duì)照組灌胃等量飲用水。連續(xù)6周后，得到動(dòng)物模型。
正常對(duì)照組和模型組各取8只動(dòng)物，進(jìn)行包括測(cè)定腹腔注射糖耐量、胰島素耐量水平以及胰島素刺激的蛋白激酶B的磷酸化水平和糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)水平的驗(yàn)證實(shí)現(xiàn)。
血糖水平采用常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定。
腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(Intraperitonealglucose tolerance test, IPGTT)的試驗(yàn)方法為:分別將正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物禁食6小時(shí)，測(cè)定空腹血糖值，以100mg/ml葡萄糖溶液腹腔注射，葡萄糖用量為lg/kg體重，分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做糖耐量曲線，對(duì)模型組和正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
胰島素耐量試驗(yàn)(Insulin tolerance test, ITT)的試驗(yàn)方法為:分別將正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物禁食4小時(shí)，測(cè)定空腹血糖值，腹腔注射胰島素，注射劑量為0.75U/kg體重，分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做胰島素耐量曲線， 對(duì)模型組和正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平和糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)水平由Western blot進(jìn)行測(cè)定。正常對(duì)照組和模型組各取5只動(dòng)物，以10U/kg的劑量腹腔注射胰島素，45分鐘后，處死動(dòng)物，取肝臟進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，檢測(cè)蛋白激酶B的磷酸化水平。正常對(duì)照組和模型組各取3只動(dòng)物，處死，取肝臟進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，檢測(cè)糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)水平。
上述檢測(cè)結(jié)果如下:
如圖1所示，腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)中，模型組與正常組相比，血糖水平差異顯著升高。
如圖2所示，胰島素耐量試驗(yàn)中，模型組與正常組相比，各時(shí)間點(diǎn)血糖水平差異顯著升高。
如圖3所示，與正常對(duì)照相比，模型組胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平明顯降低。
如圖4所示，與正常對(duì)照相比，模型組磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸脫氫酶表達(dá)顯著升高。
可見，利用灌胃高水平亞硒酸鈉誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型是可行的，該模型可作為高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗以及2 型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)理研究模型。
權(quán)利要求
1.高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用，所述的高硒為每天按照IOOiIg/kg 200 V- g/kg的用量給予。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，糖脂代謝紊亂，進(jìn)而誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，高硒誘導(dǎo)血糖水平升高的誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，高硒誘導(dǎo)蛋白激酶B磷酸化水平降低的誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，高硒誘導(dǎo)磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸脫氫酶表達(dá)升高的誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型。
6.一種胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)選用SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重180±20g，動(dòng)物自由攝食飲水； 2)對(duì)選用的SD大鼠每天灌胃100u g/kg 200 u g/kg的硒，6周后得到胰島素抵抗動(dòng)物模型。
7.如權(quán)利要求5所述的胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，每天灌胃相應(yīng)含量的含硒化物。
8.如權(quán)利要求5所述的胰島素抵抗動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，對(duì)選用的SD大鼠每天灌胃219 u g/kg 438 u g/kg的亞硒酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開了高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗動(dòng)物模型的應(yīng)用及構(gòu)建方法，利用SD大鼠，每天灌胃100μg/kg～200μg/kg的硒，6周后得到胰島素抵抗動(dòng)物模型。對(duì)糖耐量和胰島素耐量的統(tǒng)計(jì)分析、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和糖異生關(guān)鍵酶的測(cè)定表明利用亞硒酸鈉構(gòu)建的胰島素抵抗大鼠模型是可行的，可作為高硒誘導(dǎo)胰島素抵抗以及2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)理的研究模型。本發(fā)明構(gòu)建的胰島素抵抗大鼠模型具有造模方法簡(jiǎn)單、成模率高、成本低、周期短、及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K33/04GK103211834SQ20131012607
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者王欣, 海春旭 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)