丹參新酮在制備保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及丹參新酮在制備保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的用途，以及在制備抗氧化藥物中的用途。所述含丹參新酮的藥物用于治療心血管疾病，特別是用于治療預(yù)防或治療冠心病、高血壓、腦出血、腦血栓。丹參新酮能使ox-LDL刺激EA.hy926細(xì)胞中的SOD酶活性與模型組相比明顯升高，其激活Nrf2-ARE的活性比陽性藥tBHQ還高，其保護內(nèi)皮細(xì)胞的作用可能是通過激活Nrf2-ARE通路后誘導(dǎo)表達多種抗氧化酶而產(chǎn)生的。
【專利說明】丹參新酮在制備保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種化合物在制備保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物 中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根 莖，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。丹參在臨床上廣泛用于治療心血管系統(tǒng)疾 病，具有擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量、防治心肌缺血和心 肌梗塞等作用。
[0003] 丹參含有多種化學(xué)成分，其藥理活性各有側(cè)重，其中最主要的活性成分是水溶性 的丹參酚酸類成分和脂溶性的丹參酮類成分。丹參的水溶性和脂溶性成分均具有抗心肌缺 血、抗氧化、抗凝、抗血栓及調(diào)節(jié)血脂、增加冠脈流量、改善心臟功能、抗炎等作用。其中丹 參酮的共同特點是具有鄰醌或?qū)︴Y(jié)構(gòu)，以丹參酮IIA含量相對較高，丹參新酮是其中的 一種成分，對它的單獨藥理活性研究較少。王維蓉等（王維蓉，林蓉，彭寧，等.丹參酮IIA 對過氧化氫損傷人血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用[J].中藥材，2006,29(1) :49-51.)研究發(fā)現(xiàn) 丹參酮IIA可以減輕過氧化氫損傷，保護血管內(nèi)皮細(xì)胞。另有文獻報道，丹參脂溶性成分 具有血管內(nèi)皮保護作用（馬敏，丹參對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用，碩士論文，2001)，但是由 于丹參酮類成分結(jié)構(gòu)相似，并不清楚其中究竟是何成分能起到保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接作 用，而有效成分結(jié)構(gòu)不清，對后繼的藥品的質(zhì)量控制、藥理實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性都帶 來了不確定因素。因此，要從眾多的丹參酮類成分中篩選出抗保護血管內(nèi)皮細(xì)胞作用強，并 且毒性低的單體化合物并不容易，是目前仍未解決的問題。
[0004] 血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular Endothelial Cell，VEC)為襯貼于血管內(nèi)腔面的單層扁 平細(xì)胞，其表面積可達l〇〇〇m2以上。VEC分泌多種調(diào)節(jié)血管功能的活性物質(zhì)，具有多種生理 功能，參與機體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和生物活性物質(zhì)釋放等生命活動。血管內(nèi)皮損傷是 某些心血管疾病的病理基礎(chǔ)。最近已有研究試圖通過干預(yù)治療以恢復(fù)某些心血管疾病患者 的內(nèi)皮功能，改善預(yù)后，這是心血管疾病治療方法中新的探索（血管內(nèi)皮細(xì)胞與心血管疾 病的關(guān)系及其研究進展，劉群峰，馬虹，心臟雜志，2000,12 (2)，126-128)。
[0005] Nrf2-ARE通路是目前最為重要的一條抗氧化應(yīng)激通路，Nrf2是內(nèi)源性的抗氧化 應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，生理狀態(tài)下存在于細(xì)胞漿，結(jié)合在胞質(zhì)接頭蛋白Keap-Ι上，當(dāng)受到親電子 試劑或氧化應(yīng)激時，迅速從復(fù)合物中解離出來，活化轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件 (antioxidant response ele-ment，ARE)結(jié)合后調(diào)控其祀基因的表達，從而對抗活性氧簇 引發(fā)的氧化應(yīng)激。研究證實氧化應(yīng)激與缺血性心肌損傷的發(fā)生密切相關(guān)（Scolletta S， Biagioli B.Energetic myocardial metab-olism and oxidative stress ：Let/ s make them our friends in the fight against heart failure[J]. Biomed Pharmacother, 2010,64 (3) :203-207)，因此，調(diào)控Nrf2-ARE通路可能是預(yù)防和治療氧化應(yīng)激所致疾病的 重要手段和方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 丹參新酮是從丹參中分離純化得到的化合物，對其活性報道較少，目前沒有該化 合物與血管內(nèi)皮細(xì)胞保護之間直接關(guān)系的報道。 申請人:通過大量的試驗篩選，意外發(fā)現(xiàn)，該 化合物具有良好的保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，并且毒性低的特點，可作為理想的心血管藥 物的母核。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] a)丹參新酮（miltrone)在制備保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的用途。
[0009] b)優(yōu)選地，上述保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物是用于治療心血管疾病的，所述心血管 疾病是冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓、腦出血、腦血栓。
[0010] c)丹參新酮在制備抗氧化的藥物中的用途，尤其是保護血管內(nèi)皮細(xì)胞氧應(yīng)激時受 到損傷中的用途。
[0011] d)所述保護血管內(nèi)皮細(xì)胞氧應(yīng)激時受到損傷是通過調(diào)節(jié)Nrf2-ARE通路進行的。
[0012] e)優(yōu)選地，存在于藥物中丹參新酮是以藥學(xué)上可接受的鹽的形式，所述藥物通過 添加藥學(xué)上可接受的載體制備成各種劑型。
[0013] f)優(yōu)選地，丹參新酮制備的藥物的劑型可以是片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆 粒劑、口服液、懸浮液、乳劑或注射劑、栓劑、貼劑。
[0014] 本發(fā)明對丹參新酮進行了血管內(nèi)皮保護作用的活性評價試驗：丹參新酮對 ox-LDL刺激EA. hy926細(xì)胞造成氧化應(yīng)激引起的損傷存在明顯的保護作用，能明顯減少 ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞LDH的釋放，明顯減少ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞R0S的增加，并呈現(xiàn) 濃度依賴性。丹參新酮的預(yù)處理還能使〇x-LDL刺激EA. hy926細(xì)胞中的S0D酶活性與模型 組相比明顯升高。將丹參新酮1〇μΜ濃度加入到轉(zhuǎn)染過質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，熒光素酶活性 與tBHQ(20 μ Μ)的活性相當(dāng)，說明丹參新酮激活Nrf2-ARE的活性比陽性藥tBHQ還高，極有 可能被開發(fā)為新的抗氧化劑。丹參新酮能直接誘導(dǎo)表達EA. hy926細(xì)胞中的Nrf2表達，與對 照組相比呈顯著性差異，并且丹參新酮處理后的細(xì)胞內(nèi)，標(biāo)記有紅色熒光的Nrf2入核明顯 增加，說明丹參新酮能誘導(dǎo)Nrf2蛋白解離并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，同樣說明丹參新酮能激活Nrf2-ARE 通路而起到抗氧化的作用。丹參新酮能明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞中H0-1、NQ01、GCLC、GCLM基因 的表達，說明丹參新酮在激活Nrf2-ARE通路后，成功誘導(dǎo)了下游基因中二相解毒酶的基因 轉(zhuǎn)錄及表達。推測丹參新酮保護內(nèi)皮細(xì)胞的作用是通過激活Nrf2-ARE通路后誘導(dǎo)表達多 種抗氧化酶而產(chǎn)生的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為丹參新酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的表型指標(biāo)檢測（MTT檢測存活率）圖，橫坐 標(biāo)為丹參新酮濃度（μM)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力。
[0016] 圖2為丹參新酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的表型指標(biāo)檢測（LDH檢測存活率）圖，橫坐 標(biāo)為丹參新酮濃度（μ Μ)，縱坐標(biāo)為LDH指標(biāo)。
[0017] 圖3為丹參新酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的表型指標(biāo)檢測（R0S檢測存活率）圖，橫坐 標(biāo)為丹參新酮濃度（μ Μ)，縱坐標(biāo)為R0S指標(biāo)。
[0018] 圖4為丹參新酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的酶功能水平檢測（S0D)圖，橫坐標(biāo)為丹參 新酮濃度（μ Μ)，縱坐標(biāo)為SOD指標(biāo)。
[0019] 圖5為丹參新酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的酶功能水平檢測（GST)圖，橫坐標(biāo)為丹參 新酮濃度（μ M)，縱坐標(biāo)為GST指標(biāo)。
[0020] 圖6為丹參新酮對激活A(yù)RE-相關(guān)熒光素酶活性檢測，橫坐標(biāo)為丹參新酮濃度 (μ M),縱坐標(biāo)為熒光素酶倍數(shù)值。
[0021] 圖7為丹參新酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的免疫熒光檢測Nrf2蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)圖。 Nrf2的二抗帶紅色熒光蛋白，在胞質(zhì)中普遍表達，圖片中核內(nèi)的紅色熒光變亮，說明加藥物 之后，能誘導(dǎo)Nrf2轉(zhuǎn)入核內(nèi)。
[0022] 圖8為丹參新酮對Nrf2的mRNA水平的影響，橫坐標(biāo)為丹參新酮濃度（μ M)，縱坐 標(biāo)為目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的比值。
[0023] 圖9為丹參新酮對Η0-1的mRNA水平的影響，橫坐標(biāo)為丹參新酮濃度（μ Μ)，縱坐 標(biāo)為目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的比值。
[0024] 圖10為丹參新酮對NQ01的mRNA水平的影響，橫坐標(biāo)為丹參新酮濃度（μ Μ)，縱坐 標(biāo)為目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的比值。
[0025] 圖11為丹參新酮對GCLC的mRNA水平的影響，橫坐標(biāo)為丹參新酮濃度（μ M)，縱坐 標(biāo)為目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的比值。
[0026] 圖12為丹參新酮對GCLM的mRNA水平的影響，橫坐標(biāo)為丹參新酮濃度（μΜ)，縱坐 標(biāo)為目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的比值。

【具體實施方式】：
[0027] 實施例1 :丹參新酮化合物的制備
[0028] 1材料與儀器
[0029] 柱層析硅膠（100?200目，200?300目）、薄層層析硅膠Η購自青島海洋化工有 限公司（化學(xué)純）。提取分離用試劑石油醚（無錫亞盛）、乙酸乙酯（南京化學(xué)試劑）、氯 仿（上海凌峰）、甲醇（江蘇漢邦）、丙酮（南京化學(xué)試劑）均為分析純，鑒定用試劑甲醇 (江蘇漢邦）、乙腈（默克）為色譜純。丹參酮提取物：購買于山東華信制藥有限公司，丹參 總酮含量約8%。
[0030] AgilentllOO液相色譜-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)（Agilent公司）；中壓制備系統(tǒng)（瑞 士BiiCHI 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀BiiCHIRotavapor R-200(瑞士BtiCHI公司）。
[0031] 2 方法
[0032] 2. 1提取與分離
[0033] 取丹參酮粗提物500g，用適量的乙酸乙酯溶解，加500g200?300目硅膠拌勻，水 浴上將乙酸乙酯揮干，過60目篩。采用干法裝硅膠柱，裝入約860g拌勻物，約含430g粗提 物。粗分后用中壓制備柱反復(fù)進行細(xì)分純化，最后細(xì)分得到各化合物單體。分離過程中， 根據(jù)待分離化合物性質(zhì)的不同選用了不同的洗脫系統(tǒng)，包括：石油醚-乙酸乙酯，三氯甲 烷-甲醇，環(huán)己烷-丙酮。
[0034] 2. 2儀器分析條件
[0035] T0F/MS條件：電噴霧離子源參數(shù)：干燥氣流速（N2Drying gas flow-rate): 10. 0L/min;干燥氣溫度（Drying gas temperature) :33CTC ;霧化氣壓力（Nebulizer): 241kPa(35psig);毛細(xì)管電壓（Capillary voltage) :3000V;裂解電壓（Fragmentor): 120 ?420V ；skimmer voltage,60V ；octapole DC1,37V ；octapole radio frequency, 250V。數(shù)據(jù)米集和分析分別由Agilent MassHunter Acquisition軟件（Agilent,美國）和 Applied Biosystems/MDS-Sciex Analyst QS 軟件（Frankfurt,德國）完成。
[0036] 3 結(jié)果
[0037] 丹參新酮為紅色方晶，mp281 ?284°C。T0F-MS 顯示[M+H]+為 m/z283. 1691， [M+Na]+ 為 m/z305. 1510, [2M+Na]+ 為 m/z587. 3128,可鑒定該化合物分子式為：C19H22 02。 ?-ΝΜΙ^δΟΟΜΗζ，CDC13) δ :3. 20 (2Ht，J = 6. 5Hz，H-l)，1. 81 (2H，m，H-2)，1. 67 (2H，m，H-3)， 7.60(lH，d，J = 8.0Hz，H-6)，7. 11 (lH，d，J = 8.0Hz，H-7) ,7.09 (lH，s，H-14) ,3.05 (lH，m， H-15)，1. 18 (6H，d，J = 6. 5Hz，Me-16and Me-17)，1. 32 (6H，s，Me-18and Me-19)，以上數(shù)據(jù) 與文獻報道的丹參新酮（Miltirone)數(shù)據(jù)一致[1]，化合物DS-7鑒定為丹參新酮。丹參新酮 結(jié)構(gòu)式如下式：

【權(quán)利要求】
1. 丹參新酮（miltrone)在制備保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物用于治療 心血管疾病。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述心血管疾病是冠心病、動脈粥樣硬 化、高血壓、腦出血或腦血栓。
4. 丹參新酮在制備抗氧化藥物中的用途，尤其是保護血管內(nèi)皮細(xì)胞氧應(yīng)激時受到損傷 中的用途。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于：所述保護血管內(nèi)皮細(xì)胞氧應(yīng)激時受到損 傷是通過調(diào)節(jié)Nrf2-ARE通路進行的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的用途，其特征在于：所述丹參新酮是以藥學(xué)上 可接受的鹽存在于藥物中的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的用途，其特征在于：所述藥物通過添加藥學(xué)上 可接受的載體制備成各種劑型。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的用途，其特征在于：所述劑型為片劑、錠劑、丸 齊U、膠囊劑、散劑、顆粒劑、口服液、懸浮液、乳劑、注射劑、栓劑或貼劑。
【文檔編號】A61P9/00GK104095836SQ201310128667
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月15日
【發(fā)明者】陳君, 李萍, 羅麗平, 張慧, 宋慧鵬, 周萍, 劉鄂湖 申請人:中國藥科大學(xué)