專利名稱：一種誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于功能基因組學(xué)研究領(lǐng)域，涉及一種慢病毒表達載體，尤其是一種誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。近幾年來RNAi研究取得了突破性進展。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉目的基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。為了成功地實現(xiàn)RNAi，首先要獲得有效的siRNA。RNAi的核心需要siRNA對相應(yīng)mRNA進行有效的結(jié)合和作用。siRNA的設(shè)計可以通過檢索,優(yōu)先選用經(jīng)過驗證的siRNA或設(shè)計多對siRNA，同時設(shè)置陰性對照(排除非特異沉默現(xiàn)象)和陽性對照(確認整個實驗體系的有效性)。體外化學(xué)合成siRNA最方便的，包括在體外合成相應(yīng)序列的RNA片段，退火形成雙鏈，再轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)?；瘜W(xué)合成方法的主要缺點是價格高，定制周期長。對化學(xué)合成法的改進是體外轉(zhuǎn)錄法。即合成相應(yīng)的DNA鏈，在體外轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的RNA。這樣的成本相對化學(xué)合成法而言比較低，是一種性價比較高的篩選siRNA的方法并且這種方法能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNA。以上兩種方法都是先合成一定量的siRNA產(chǎn)物，在通過轉(zhuǎn)染等方式進入細胞發(fā)揮作用。它們的共同缺點是，隨著進入細胞內(nèi)siRNA的降解，RNA干擾作用很快消失。·為了克服上兩種方法的缺點，研究人員構(gòu)建了 siRNA表達載體，轉(zhuǎn)入細胞或體內(nèi)表達成小發(fā)夾RNA (shRNA)，在Dicer酶的作用下形成siRNA。siRNA表達載體的優(yōu)點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法一帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久，因此這種方法在生物學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。隨著RNAi技術(shù)的發(fā)展，研究人員經(jīng)常需要shRNA能夠可控地在細胞中表達，即誘導(dǎo)型表達。常用的誘導(dǎo)型表達載體為四環(huán)素誘導(dǎo)型表達載體。這類載體采用了一種四環(huán)素操縱子(Tet Operator, TetO)調(diào)控系統(tǒng)。當四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)存在時，它能有效地結(jié)合TetO位點(或稱為四環(huán)素應(yīng)答元件)，從而阻止轉(zhuǎn)錄起始，當加入四環(huán)素(Tc)或其類似物強力霉素Dox (doxycycline)后,它能改變TetR蛋白的構(gòu)像,這種改變導(dǎo)致TetR蛋白從TetO位點被釋放出來，解除了對啟動子的轉(zhuǎn)錄阻遏，使得siRNA得以表達，并且這種表達為四環(huán)素或其類似物劑量依賴的。但是采用這種載體系統(tǒng)，需要TetR表達載體的配合，研究者需要事先用TetR表達載體轉(zhuǎn)染細胞以得到TetR穩(wěn)定表達細胞株。因而對于絕大多數(shù)可誘導(dǎo)性系統(tǒng)，四環(huán)素誘導(dǎo)shRNA細胞株的設(shè)立需要分兩階段:第一，四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)由任何轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，被引入目標細胞株，篩選最高TetR表達的穩(wěn)定細胞克隆；第二，向表達TetR的穩(wěn)定細胞株轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)入四環(huán)素誘導(dǎo)的shRNA載體。使用這樣的系統(tǒng)，通常需要篩選多個克隆細胞，以確定哪些細胞株已經(jīng)取得成功轉(zhuǎn)錄，操作上比較困難。
因而，本領(lǐng)域亟需操作簡單的誘導(dǎo)型shRNA表達載體系統(tǒng)，在引入細胞后，可通過四環(huán)素的存在與否(或劑量)來控制shRNA的表達，從而影響到目的基因的表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體，其引入細胞后，可通過四環(huán)素或其衍生物強力霉素的存在與否來控制shRNA的表達，也可以通過四環(huán)素或其衍生物的劑量來控制shRNA的表達，從而影響到目的基因的表達。在沒有四環(huán)素或其衍生物的情況下，shRNA表達是被持續(xù)性表達的TetR蛋白所抑制，在添加了四環(huán)素或其衍生物時，shRNA表達抑制被解除，導(dǎo)致了目的基因被抑制。這個調(diào)控系統(tǒng)可以大量產(chǎn)生穩(wěn)定的感染細胞群，而無需生成和篩選個體克隆細胞，同樣，只要用含有強力霉素的飲用水喂養(yǎng)動物，就可以在腫瘤異種移植中在體內(nèi)誘導(dǎo)shRNA表達。本發(fā)明的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)異且簡便的功能，可用于誘導(dǎo)性基因沉默，并進行功能性缺失表型研究。本發(fā)明提供的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體，包含:
a)shRNA表達框；所述shRNA表達框包含第一啟動子、能與四環(huán)素阻遏蛋白結(jié)合的四環(huán)素應(yīng)答元件、TATA盒和shRNA編碼序列，其中當四環(huán)素應(yīng)答元件未與四環(huán)素阻遏蛋白(tetR)結(jié)合時，第一啟動子能夠驅(qū)動所述shRNA編碼序列的表達；
b)四環(huán)素阻遏蛋白表達框；所述四環(huán)素阻遏蛋白表達框包含第二啟動子、四環(huán)素阻遏蛋白表達基因、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列和標記基因。如上所述的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體,優(yōu)選的是,所述第一啟動子為RNA聚合酶III啟動子。

更優(yōu)選的是，所述RNA聚合酶III啟動子為Hl啟動子(SEQ ID I)或U6啟動子(SEQ ID 2)。在上述任意方案中，優(yōu)選的是，所述第二啟動子為組成型啟動子；所述組成型啟動子在細胞中可起始四環(huán)素阻遏蛋白TetR編碼序列的轉(zhuǎn)錄，從而在細胞內(nèi)穩(wěn)定生成四環(huán)素阻遏蛋白，并維持一定水平的四環(huán)素阻遏蛋白。在不存在四環(huán)素或其衍生物如強力霉素(Dox)時TetR與shRNA表達框中的TetR結(jié)合元件結(jié)合，阻止了第一啟動子起始shRNA編碼序列的轉(zhuǎn)錄，抑制了 shRNA的生成。因此，這種情況下，細胞內(nèi)該shRNA目的基因的表達不被抑制。當向細胞培養(yǎng)基中加入四環(huán)素或其衍生物如強力霉素(Dox)時，這些脂溶性小分子可進入細胞核中與TetR結(jié)合，改變其構(gòu)象，使其脫離shRNA表達框中的TetR結(jié)合元件，解除了對第一啟動子的抑制作用，使第一啟動子得以起始shRNA編碼序列的轉(zhuǎn)錄，生成shRNA。該shRNA經(jīng)細胞內(nèi)Dicer處理后，形成siRNA，最終抑制了其目的基因的表達。更優(yōu)選的是,所述組成型啟動子為PGK啟動子。在上述任意方案中，優(yōu)選的是，所述標記基因為I3URO (SEQ ID 5)或ΝΕ0.本發(fā)明的另一目的，是提供一種誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建方法；所述誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建方法，步驟如下:
0.通過限制性內(nèi)切酶從慢病毒載體中切除聚合酶III啟動子，切除啟動子后的載體骨架經(jīng)純化回收；
2).化學(xué)合成第一啟動子，以合成的啟動子為模板進行擴增，并引入四環(huán)素應(yīng)答元件TRE序列、TATA盒序列和限制性內(nèi)切酶酶切位點,產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后,進行純化；3).步驟I)中的載體骨架與步驟2)中的純化后的第一啟動子進行連接，得到載體骨架 PKG ；
4).化學(xué)合成TetR融合蛋白的DNA序列(SEQID 3)，擴增引入酶切位點，即產(chǎn)生TetR的二聯(lián)體。5).將步驟4)中所得TetR的三聯(lián)體和步驟3)中所得載體骨架pKG 分別經(jīng)酶切消化，將酶切消化后的TetR的三聯(lián)體緊接PGK啟動子的下游插入到經(jīng)酶切消化后的表達載體骨架pKG 中，即可得到pKG -3xTetR ;其中，克隆的TetR序列由Clal和為al確定正確方向。6).內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列由化學(xué)合成(SEQ ID 4)并由聚合酶鏈反應(yīng)擴增并引入酶切位點；
7).將步驟6)所得內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列和步驟5)中所得pKG -3xTetR分別經(jīng)酶切消化，然后，將酶切消化后的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列插入到經(jīng)酶切消化后的pKG -3xTetR載體中，經(jīng)DNA測序可證實該表達載體的正確序列。8).化學(xué)合成帶有酶切位點的shRNA編碼序列，可根據(jù)不同目的基因設(shè)計不同的shRNA編碼序列，如特異性抑制癌基因PIK3CA的shRNA編碼序列(SEQ ID 6)和特異性抑制癌基因KRAS基因的shRNA編碼序列(SEQ ID 7)。9).將步驟8)中所得shRNA編碼序列和步驟7)中所得表達載體分別經(jīng)酶切消化后，分別進行純化，然后，將純化后的shRNA編碼序列通過鏈接酶與純化后的表達載體進行鏈接，得到本發(fā)明的誘導(dǎo)性shRNA慢病毒表達載體。所有陽性克隆由DNA測序證實shRNA的存在及正確序列。

上述方案中，優(yōu)選的是，步驟I)中所述慢病毒表達載體為通過多步亞克隆改造含有表達載體的基本序列、多克隆位點序列、啟動子序列和選擇標記基因序列的慢病毒表達載體。更優(yōu)選的是，所述多克隆位點包括Xhol酶切位點、Notl酶切位點、BglII酶切位點、Xbal酶切位點、BamHl酶切位點、EcoRl酶切位點、CZa I酶切位點和Zaa I酶切位點。更優(yōu)選的是所述啟動子為PGK啟動子；所述選擇標記基因為Pure或Neo。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟I)中所述限制性內(nèi)切酶為為Xhol和Notl。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟I)中所述純化回收方法為瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠萃取試劑盒(Qiagen)純化回收。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟2)中所述第一啟動子為四環(huán)素(Tet)誘導(dǎo)性聚合酶III啟動子。更優(yōu)選的是，所述聚合酶III啟動子為Hl啟動子(SEQ ID I)或U6啟動子(SEQID 2)。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟2)中所述擴增為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟2)中所述限制性內(nèi)切酶切位點為限制性內(nèi)切酶Xhol和Afoil酶切位點；所述限制性內(nèi)切酶消化為限制性內(nèi)切酶通ol和Afoil酶消化。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟2)中所述純化為瓊脂糖凝膠電泳凝膠純化。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟4)中所述擴增為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟4)中所述酶切位點為BglII和Xbal酶切位點；步驟5)中所述酶切消化是經(jīng)BglII和Xbal酶切消化。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟6)中所述酶切位點為酶切位點，步驟7)中所述酶切消化為BamHl酶切消化。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟8)中所述酶切位點為及和通Ol酶切位點，步驟9)中所述酶切消化為和通ο I酶切消化。上述任意方案中，優(yōu)選的是，步驟8)中所述shRNA編碼序列為抑制癌基因PIK3CA的shRNA編碼序列(SEQ ID 6)和抑制癌基因KRAS的shRNA編碼序列(SEQ ID 7)。本發(fā)明還提供上述誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體在細胞里做基因功能缺失的研究方面的應(yīng)用。pKG系統(tǒng)與傳統(tǒng)的基因敲除方法相比，是一個更簡單，而且具有誘導(dǎo)性的研究功能性缺失表型的方法，可用于誘導(dǎo)性基因沉默，并進行功能性缺失表型研究。本發(fā)明還提供上述誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體在構(gòu)建shRNA文庫方面的應(yīng)用。隨著各種模式生物體基因組計劃的完成，研究人員可以非常方便地從大規(guī)模數(shù)據(jù)庫中獲得全基因組序列，從而找到感興趣基因的序列，據(jù)此設(shè)計出使該基因沉默的dsRNA，這是研究疾病機理和鑒定候選藥靶的關(guān)鍵步驟，也為將來可控地打開或關(guān)閉某一特定疾病相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)，為疾病的治療開辟了新途徑。由于本發(fā)明shRNA慢病毒表達載體簡單高效，本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到的是，利用該表達載體來高通量篩選針對目的基因的功能性shRNA，并進一步構(gòu)建shRNA文庫。本發(fā)明還提供上述誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體在腫瘤基因治療藥物方面的應(yīng)用。在一方面，本發(fā)明的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體可用于shRNA目的基因功能的研究，探尋特定疾病的藥物靶點，另一方面，采用針對特定疾病基因的shRNA，本發(fā)明的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體本身可能作為治療疾病尤其是癌癥的藥物。本發(fā)明的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體在單一載體下，包含了四環(huán)素阻遏蛋白表達序列以及誘導(dǎo)型shRNA表達序列`。與現(xiàn)有的誘導(dǎo)型shRNA表達載體相比，本發(fā)明的表達載體的優(yōu)點包括:1、用單個載體即可迅速地在多種細胞株里建立誘導(dǎo)性shRNA表達來沉默基因；2、不需要細胞的克隆選擇；3、可在細胞的體外培養(yǎng)和體內(nèi)研究中使用。除非另有說明，本文中使用的術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義。用在本文時“ RNAi ”指由RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，更具體地，指由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。長度為21 23nt的小RNA分子是引起RNA干擾現(xiàn)象的直接原因。這種小RNA分子被稱之為小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)。在RNA干擾中一個非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可與雙鏈RNA結(jié)合，并將其剪切成21 23nt及3’端突出的小分子RNA片斷，即siRNA。隨后siRNA與若干個蛋白組成的，RNA引起的稱之為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC)結(jié)合,解旋成單鏈，并由該復(fù)合體主導(dǎo)RNAi效應(yīng)。RISC被活化后，活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合在標靶mRNA上并切斷標靶mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。用在本文時，“shRNA”指小單鏈RNA，其5’段和3’端的RNA序列互補，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(含19 29nt的莖和3 9nt的環(huán))，在細胞內(nèi)經(jīng)Dicer處理也形成21 23nt的siRNA。該siRNA的一條鏈(正義鏈)的序列與待抑制目的基因序列或其mRNA的一部分相同，序列特異地發(fā)揮RNA干擾作用。
用在本文時，“shRNA編碼序列”指編碼該shRNA的DNA序列，在其兩末端一般具有限制性位點，用于插入本發(fā)明的表達載體中。用在本文時，“慢病毒載體(Lentiviral vector) ”主要指在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效將目的基因?qū)雱游锖腿说脑毎蚣毎?。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進入細胞后，在細胞質(zhì)中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA,回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產(chǎn)生RNA干擾。慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達或RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、巨噬細胞等。用在本文時，“shRNA目的基因”指本發(fā)明表達載體shRNA表達后所抑制的基因。一般根據(jù)shRNA目的基因序列或其mRMA來設(shè)計適合的shRNA編碼序列，這在本領(lǐng)域為技術(shù)人員所公知，或者一些公司可為研究人員提供適合的shRNA編碼序列。用在本文時,“表達框(expression cassette) ”指表達載體上一段相對獨立的可表達序列，一般由一個或多個待表達基因和控制其表達的序列構(gòu)成。通常，表達框包括三個部分:啟動子、開放閱讀框和3’端不翻譯區(qū)，在真核細胞中，該3’端不翻譯區(qū)一般為多聚腺苷酸位點。


圖1為按照本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體技術(shù)示意原理圖。圖2為按照本發(fā)·明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體shRNA表達被抑制圖示。圖3為按照本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體shRNA表達恢復(fù)圖示。圖4為按照本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體體外沉默癌基因PIK3CA實驗結(jié)
果O圖5為按照本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體體內(nèi)沉默癌基因PIK3CA實驗結(jié)
果O圖6為按照本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體在體外抑制HCTl 16結(jié)腸癌細胞的生長抑制圖。圖7為按照本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體在體內(nèi)抑制HCT116結(jié)腸癌細胞的生長抑制圖。圖8為按照本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體用于藥物研發(fā)的功能性shRNA沉默效率圖不。圖9為按照本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體用于藥靶基因組shRNA在多組人類癌癥細胞的致死分數(shù)的熱圖顯示。
具體實施例
如圖1所示的本發(fā)明誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體技術(shù)示意原理圖:shRNA表達框包含RNA聚合酶III啟動子H7或U6啟動子、能與四環(huán)素阻遏蛋白結(jié)合的四環(huán)素應(yīng)答元件TRE、TATA盒和shRNA編碼序列；其中當四環(huán)素應(yīng)答元件未與四環(huán)素阻遏蛋白(tetR)結(jié)合時，Hl或U6啟動子能夠驅(qū)動所述shRNA編碼序列的表達。四環(huán)素阻遏蛋白表達框包含組成型PGK啟動子、四環(huán)素阻遏蛋白TetR表達基因、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列和標記基因PURO或Neo。組成型啟動子PGK在細胞中可起始四環(huán)素阻遏蛋白TetR編碼序列的轉(zhuǎn)錄，從而在細胞內(nèi)穩(wěn)定生成四環(huán)素阻遏蛋白，并維持一定水平的四環(huán)素阻遏蛋白。在不存在四環(huán)素或其衍生物如強力霉素(Dox)時TetR與shRNA表達框中的TetR結(jié)合元件結(jié)合，阻止了 RNA聚合酶III啟動子Hl或U6起始shRNA編碼序列的轉(zhuǎn)錄，抑制了 shRNA的生成(如圖2)。因此，這種情況下，細胞內(nèi)該shRNA目的基因的表達不被抑制。當向細胞培養(yǎng)基中加入四環(huán)素或其衍生物如強力霉素(Dox)時，這些脂溶性小分子可進入細胞核中與TetR結(jié)合，改變其構(gòu)象，使其脫離shRNA表達框中的TetR結(jié)合元件，解除了對RNA聚合酶III啟動子Hl或U6的抑制作用，使Hl或U6啟動子得以起始shRNA編碼序列的轉(zhuǎn)錄，生成shRNA (如圖3)。該shRNA經(jīng)細胞內(nèi)Dicer處理后，形成siRNA，最終抑制了其目的基因的表達。為了更好的理解本發(fā)明，以下通過具體實施例進一步闡述本發(fā)明；實施例只是對本發(fā)明作示例性作用，而不具有任何限制性作用，其他任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實施例1
誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體特異性抑制癌基因PIK3CA，其需經(jīng)過以下步驟:
1.誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建: 本發(fā)明提供的shRNA表達載體可通過多步亞克隆改造含有NEO選擇基因的慢病毒載體PLKO (來自Sigma)來獲得。首先，通過限制性內(nèi)切酶通ol和Afoil從慢病毒載體切除組成型U6啟動聚合酶III啟動子。由此產(chǎn)生的載體骨架用瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠萃取試劑盒(Qiagen)純化回收。四環(huán)素(Tet)誘導(dǎo)性聚合酶III啟動子U6/TRE由化學(xué)合成(SEQ ID 2)，以此為模版用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增并引入并引入四環(huán)素應(yīng)答元件TRE序列、TATA盒序列和限制性內(nèi)切酶通ol和Afoi I酶切位點。產(chǎn)物經(jīng)ZAol和Afoi I消化，凝膠純化U6/TRE啟動子，然后與上述純化的載體骨架連接，得到含有U6/TRE啟動子的表達載體骨架。EcoRl/Xhol限制消化通過切下含有U6/TRE啟動子的表達載體骨架352bp片斷，來驗證U6/TRE啟動子與載體骨架連接的正確方向。接下來，TetR融合蛋白的DNA序列(SEQ ID 3)由化學(xué)合成并用PCR擴增引入BglU和油al酶切位點。所得到的產(chǎn)物經(jīng)汝"/II和油al消化，然后緊接PGK啟動子的下游插入到經(jīng)同樣消化的表達載體骨架中，將得到的產(chǎn)物稱為pKG-3xTetR?？寺〉腡etR序列由C/al/ikal確定正確方向。最后，內(nèi)部核糖體進入位點(IRES) DNA序列由化學(xué)合成(SEQ ID
4)并由聚合酶鏈反應(yīng)擴增并引入編碼及麗的酶切位點。然后插入pKG-3xTetR中3xTetR與Puro選擇基因序列之間的相應(yīng)BamHl酶切位點。DNA測序證實了該表達載體的正確序列。最后，將編碼序列引入表達載體?；瘜W(xué)合成的帶有及限制性位點的shRNA編碼序列(SEQ ID 6)。以及和通oIDNA限制酶消化該shRNA編碼序列并純化。同樣以及和通ο IDNA限制酶消化以上得到的表達載體，純化的片段通過連接酶與shRNA編碼序列的純化片段連接，得到本發(fā)明的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體。所有陽性克隆由DNA測序證實了 shRNA的存在及正確序列。所有試劑按廠商建議條件操作。2.生成慢病毒
通過以本發(fā)明提供的shRNA慢病毒表達載體、pVSV-G質(zhì)粒(來自Sigma)和pCMV-VPR-8-7 質(zhì)粒(Sigma)共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞(HIGH GLUCOSE DMEM+10%FBS,Invitrogen)來制備慢病毒；用通過多步亞克隆改造含有NEO標記基因的慢病毒載體pLKO(來自 Sigma)，與 pVSV-G 質(zhì)粒(來自 Sigma)和 pCMV_VPR-8_7 質(zhì)粒(Sigma)共轉(zhuǎn)染 HEK293T細胞(HIGH GLUCOSE DMEM+10%FBS, Invitrogen)作對照試驗。下述實驗過程進行同樣處理。使用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine2000 (Invitrogen),按常規(guī)方法轉(zhuǎn)染。12小時后替換細胞培養(yǎng)液。含有慢病毒的上清液于48小時后收獲。經(jīng)過濾及高速離心后純化并于-80° C保存。所有試劑按廠商建議條件操作。3.感染并建立穩(wěn)定表達的靶細胞株
將慢病毒液與聚凝胺(polybrene終濃度8 μ g/ml)在細胞培養(yǎng)液中混合并培養(yǎng)5分鐘。加入培養(yǎng)中的細胞株后(MOI=I,貼壁或懸浮皆可)，離心感染(spinfection, 2500rpmX60分鐘)靶細胞株，然后替換入新鮮的細胞培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱內(nèi)24小時后，視靶細胞株而定，加入 0.5-1.5 μ g/ml Puromycin 篩選 3-4 天或 0.25-1.5 mg/ml G418 篩選 5-10天。然后培養(yǎng)穩(wěn)定整合了本發(fā)明表達載體的靶細胞株至足夠量，可立刻為實驗用或凍存后供以后實驗用。所有試劑按廠商建議條件操作。采用這種方式，我們已測試了 40多個人類和小鼠細胞系，其中絕大多數(shù)為腫瘤細胞株，實驗結(jié)果證明了我們的載體系統(tǒng)具有建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)型shRNA細胞株的普遍能力。下表為一個成功誘導(dǎo)shRNA表 達細胞株的名單:
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體,包含 a)shRNA表達框；所述shRNA表達框包含第一啟動子、能與四環(huán)素阻遏蛋白結(jié)合的四環(huán)素應(yīng)答元件TRE、TATA盒和shRNA編碼序列； b)四環(huán)素阻遏蛋白表達框，所述四環(huán)素阻遏蛋白表達框包含第二啟動子、四環(huán)素阻遏蛋白表達基因(SEQ ID 3)、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列(SEQ ID 4)和標記基因。
2.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體，其特征在于，所述第一啟動子為RNA聚合酶III啟動子。
3.如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體，其特征在于，所述RNA聚合酶III啟動子為Hl啟動子(SEQ ID I)或U6啟動子(SEQ ID 2)。
4.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體，其特征在于，所述第二啟動子為組成型啟動子。
5.如權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體，其特征在于，所述組成型啟動子為PGK啟動子。
6.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體，其特征在于，所述標記基因為PURO(SEQ ID 5)或 ΝΕ0。
7.一種誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建方法，步驟如下 I).通過限制性內(nèi)切酶從慢病毒載體中切除聚合酶III啟動子，切除啟動子后的載體骨架經(jīng)純化回收； 2).化學(xué)合成第一啟動子，以合成的啟動子為模板進行擴增，并引入限制性內(nèi)切酶酶切位點，產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，進行純化； 3).將步驟I)中的載體骨架與步驟2)中的純化后的第一啟動子進行連接，得到載體骨架PKG ； 4).化學(xué)合成TetR融合蛋白的DNA序列(SEQID 3)，擴增引入酶切位點，即產(chǎn)生TetR的二聯(lián)體； 5).將步驟4)中所得TetR的三聯(lián)體和步驟3)中所得載體骨架pKG 分別經(jīng)酶切消化，將酶切消化后的TetR的三聯(lián)體插入到經(jīng)酶切消化后的表達載體骨架pKG 中，即可得到pKG -3xTetR ； 6).內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列(SEQ ID 4)由化學(xué)合成并由聚合酶鏈反應(yīng)擴增并引入酶切位點； 7).將步驟6)所得內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列和步驟5)中所得pKG -3xTetR分別經(jīng)酶切消化，然后，將酶切消化后的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列插入到經(jīng)酶切消化后的pKG -3xTetR載體中； 8).化學(xué)合成帶有酶切位點的shRNA編碼序列； 9).將步驟8)中所得shRNA編碼序列和步驟7)中所得表達載體分別經(jīng)酶切消化后，分別進行純化，然后，將純化后的shRNA編碼序列通過鏈接酶與純化后的表達載體進行鏈接，得到誘導(dǎo)性shRNA慢病毒表達載體。
8.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體在細胞里做基因功能缺失的研究方面的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體在構(gòu)建shRNA文庫方面的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)型ShRNA慢病毒表達載體在腫瘤基因治療藥物方面的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。所述誘導(dǎo)型shRNA慢病毒表達載體包含shRNA表達框和四環(huán)素阻遏蛋白表達框；shRNA表達框包含第一啟動子、能與四環(huán)素阻遏蛋白結(jié)合的四環(huán)素應(yīng)答元件、TATA盒和shRNA編碼序列；四環(huán)素阻遏蛋白表達框包含第二啟動子、四環(huán)素阻遏蛋白表達基因、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)DNA序列和標記基因。與現(xiàn)有的誘導(dǎo)型shRNA表達載體相比，本發(fā)明的表達載體的優(yōu)點包括用單個載體即可迅速地在多種細胞株里建立誘導(dǎo)性shRNA表達來沉默基因；不需要細胞的克隆選擇；可在細胞的體外培養(yǎng)和體內(nèi)研究中使用。
文檔編號A61P35/00GK103255172SQ20131013140
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者朱平 申請人:傅開屏, 朱平