專利名稱：一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法及其應(yīng)用的制作方法
一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
:
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法及其應(yīng)用。二、背景技術(shù):
在現(xiàn)代社會(huì)，糖尿病是一種發(fā)病率高、并發(fā)癥多且難以根治的慢性疾病。在世界范圍內(nèi)，糖尿病發(fā)病率都在上升。這種疾病是導(dǎo)致失明、腎衰竭、截肢、心臟病和中風(fēng)的主要原因。每年因它之而喪命的患者人數(shù)與因艾滋病病毒/艾滋病(HIV/AIDS)而導(dǎo)致的死亡人數(shù)不相上下。目前，我國(guó)可能已成為糖尿病患病人數(shù)最多的國(guó)家，我國(guó)糖尿病成人患者總數(shù)達(dá)9240萬(wàn)，其中農(nóng)村4310萬(wàn)，城市4930萬(wàn)左右，發(fā)病率超過(guò)了 10%，糖尿病用藥市場(chǎng)已過(guò)百億元。胰島素類藥物是控制和治療糖尿病的不二選擇。按來(lái)源分類，有動(dòng)物胰島素、半合成人胰島素和生物合成人胰島素(現(xiàn)階段臨床最常使用的胰島素)；按藥效時(shí)間長(zhǎng)短又可分為超短效、短效、中效、長(zhǎng)效、預(yù)混胰島素。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，胰島素市場(chǎng)容量也近60億元，同時(shí)每年增速超過(guò)20%。2010年，中國(guó)已經(jīng)成為全球糖尿病患病率增長(zhǎng)最快的國(guó)家之一，增速驚人。僅諾和諾德一家，2009年在中國(guó)市場(chǎng)的胰島素銷量就已經(jīng)超過(guò)了 40億元，這個(gè)市場(chǎng)不可限量。但國(guó)內(nèi)企業(yè)從這個(gè)大蛋糕中只分食到5%的份額。據(jù)統(tǒng)計(jì)，外資企業(yè)占據(jù)了中國(guó)胰島素市場(chǎng)95%的份額， 而在重組人胰島素方面，只有通化東寶和甘李藥業(yè)兩家涉足，其主要瓶頸在于胰島素及其衍生物生產(chǎn)工藝的高難度。胰島素及其衍生物分子量6063，由兩條氨基酸肽鏈組成。A鏈有21個(gè)氨基酸，B鏈有32個(gè)氨基酸。A-B鏈之間有兩處二硫鍵相連，A鏈自身有一對(duì)二硫鍵相連。雖然胰島素及其衍生物已投入生產(chǎn)，但是其純化步驟繁瑣、產(chǎn)量較低的問(wèn)題一直成為影響胰島素及其衍生物成本的關(guān)鍵難題。在經(jīng)典的原核表達(dá)體系中，胰島素及其衍生物由于兩對(duì)二硫鍵的存在，常以不溶性的包涵體形式存在。由于大腸桿菌硫氧還蛋白(Trx)具有在大腸桿菌中表達(dá)水平高、可溶性能好等特點(diǎn)，已經(jīng)被美國(guó)Novagen公司開(kāi)發(fā)成為一個(gè)常用的融合表達(dá)標(biāo)簽(pET32系列表達(dá)載體)，用于提高目標(biāo)蛋白的可溶性，并且取得了較廣泛的成功應(yīng)用。已經(jīng)有科學(xué)家嘗試將人胰島素與硫氧還蛋白(Trx)融合表達(dá)(張守濤等人，生物技術(shù)，2010，20(2):14-16 ;董文甫等人，草食家畜，2006,4:4-6)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:硫氧還蛋白(Trx)融合表達(dá)的胰島素可溶性依然較差。例如，重慶理工大學(xué)范開(kāi)等人2006年發(fā)明的可溶性胰島素生產(chǎn)工藝將Trx置于胰島素的N端，在胰島素A、B鏈之間放置了 C肽，因此，在產(chǎn)物后加工工藝環(huán)節(jié)，既需要切除N端的Trx蛋白，又需要切除胰島素A、B鏈之間的C肽，由于使用了具有分子伴侶性質(zhì)的Trx蛋白質(zhì)，胰島素的表達(dá)水平為20%，可溶性的胰島素占細(xì)菌總蛋白的15%。大部分表達(dá)的重組胰島素仍然以包涵體形式存在。因此，對(duì)于重組胰島素及其衍生物的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，由于去除C肽的后加工環(huán)節(jié)已經(jīng)成熟，包涵體復(fù)性的效率及其成本已經(jīng)成為重組胰島素及其衍生物生產(chǎn)的關(guān)鍵和瓶頸環(huán)節(jié)。有效避免重組胰島素及其衍生物蛋白質(zhì)在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)包涵體的形成，這是國(guó)際重組胰島素及其衍生物行業(yè)至今缺乏重大進(jìn)展的難題。三、發(fā)明內(nèi)容:
為了有效避免克服重組胰島素及其衍生物生產(chǎn)過(guò)程中存在的包涵體復(fù)性效率及其成本的難題，本發(fā)明的目的在于提供一種全新的重組胰島素及其衍生物在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的新的表達(dá)方法，用于制備重組胰島素及其衍生物。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是用Trx代替C肽，將Trx作為胰島素及其衍生物A、B鏈之間的連接肽使用的一種重組胰島素及其衍生物在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)方法。

進(jìn)一步地，上述用Trx代替C肽，將Trx作為胰島素及其衍生物A、B鏈之間的連接肽使用的一種重組胰島素及其衍生物在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)方法，使Trx兼具胰島素C肽和可溶性融合標(biāo)簽的雙重功能，從而能夠改善重組胰島素及其衍生物表達(dá)產(chǎn)物的可溶性表達(dá)。進(jìn)一步地，上述重組胰島素及其衍生物與多分子伴侶共表達(dá)的表達(dá)方法，從而顯著提高重組胰島素及其衍生物表達(dá)產(chǎn)物的可溶性表達(dá)產(chǎn)量。進(jìn)一步地，一種在低溫下(10-35°c)表達(dá)上述重組胰島素及其衍生物的方法。進(jìn)一步地，一種利用鋅離子金屬親和層析純化上述重組胰島素及其衍生物的方法，但是并不局限利用鋅離子金屬親和層析純化上述重組胰島素及其衍生物的純化方法。進(jìn)一步地，一種利用Trx代替C肽，將Trx作為胰島素及其衍生物A、B鏈之間的連接肽使用的重組胰島素及其衍生物在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)的方法在制備重組胰島素及其衍生物藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，一種利用鋅離子金屬親和層析純化上述重組胰島素及其衍生物的方法所制備可溶性重組胰島素及其衍生物在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。與已有的重組胰島素及其衍生物可溶性表達(dá)技術(shù)相比，本發(fā)明的特色和創(chuàng)新之處在于:
(1)本技術(shù)將Trx放在胰島素及其衍生物A、B鏈之間，既保留了Trx蛋白質(zhì)的分子伴侶特點(diǎn)，同時(shí)又省卻了 C肽，從而只需要一步切割工藝；
(2)本技術(shù)在選用了Trx的基礎(chǔ)上，采用了低溫發(fā)酵及多分子伴侶共表達(dá)技術(shù)，使得可溶性的胰島素及其衍生物占細(xì)菌總蛋白的28%，78%的表達(dá)產(chǎn)物為可溶性產(chǎn)物，顯著提高了可溶性的重組胰島素及其衍生物的表達(dá)產(chǎn)量。因此在可溶性表達(dá)水平和生產(chǎn)工藝上都有顯著的進(jìn)步和改善。四

圖1.Trx作為連接肽的甘精胰島素表達(dá)的SDS-PAGE分析。1:空載質(zhì)粒pET28a誘導(dǎo)表達(dá)的上清；2:空載質(zhì)粒pET28a誘導(dǎo)表達(dá)的沉淀；3:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；4:pET-1NG誘導(dǎo)表達(dá)的上清；5:pET-1NG誘導(dǎo)表達(dá)的沉淀。圖2.Trx作為連接肽的甘精胰島素與多分子伴侶共表達(dá)的SDS-PAGE分析。1:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；2:先誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG I小時(shí)，再誘導(dǎo)表達(dá)pGTF2的表達(dá)上清；3:先誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG I小時(shí)，再誘導(dǎo)表達(dá)pGTF2的表達(dá)沉淀；4:共轉(zhuǎn)染ρΕΤ-1NG和pGTF2、但只用IPTG誘導(dǎo)pET-1NG表達(dá)的表達(dá)上清；5:共轉(zhuǎn)染pET-1NG和pGTF2、但只用IPTG誘導(dǎo)pET-1NG表達(dá)的表達(dá)沉淀；6:共轉(zhuǎn)染pET-1NG和pGTF2、但只用四環(huán)素誘導(dǎo)pGTF2表達(dá)的表達(dá)上清；7:共轉(zhuǎn)染pET-1NG和pGTF2、但只用四環(huán)素誘導(dǎo)pGTF2表達(dá)的表達(dá)沉淀；8:pGTF2誘導(dǎo)表達(dá)的上清；9:pGTF2誘導(dǎo)表達(dá)的沉淀；10:同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG和pGTF2的表達(dá)上清；11:同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG和pGTF2的表達(dá)沉淀；12:先誘導(dǎo)pGTF2表達(dá)I小時(shí)，再誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG表達(dá)的表達(dá)上清；13:先誘導(dǎo)pGTF2表達(dá)I小時(shí)，再誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG表達(dá)的表達(dá)沉淀。圖3目的蛋白中可溶性的Trx作為連接肽的甘精胰島素的產(chǎn)量。1:誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG ;:2:先誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG I小時(shí)，再誘導(dǎo)表達(dá)pGTF2 ;3:pET-1NG和pGTF2共轉(zhuǎn)染、但只用IPTG誘導(dǎo)pET-1NG ；4:同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG和pGTF2 ；5:先誘導(dǎo)表達(dá)pGTF2 I小時(shí)，再誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG。五具體實(shí)施方式
實(shí)施例:
1、甘精胰島素表達(dá)載體的構(gòu)建
克隆有甘精胰島素的A鏈(pUC57-A)和B鏈(PUC57-B)的質(zhì)粒由金斯瑞公司合成和構(gòu)建。在甘精胰島素A鏈的N端和B鏈的C端分別添加有腸激酶的酶切位點(diǎn)。從質(zhì)粒pET32a中經(jīng)PCR擴(kuò)增出Trx基因，上游引物為:5’ -CTT GCG GGA TCC ATGAGC GAT AM ATT ATT CAC C-3’，下游引物為:5’_GTT ATA ATA CCC AAG CTT GGC CAG GTTAGC G-3’。分別在上、下游引物的5’端引入限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III的識(shí)別序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，再用BamH I和Hind III雙酶切，與經(jīng)過(guò)相同雙酶切的載體PUC57-B連接。得到pB-Trx質(zhì)粒，用EcoR I和Hind III酶切pB-Trx質(zhì)粒，回收獲得包含甘精胰島素的B鏈和Trx的融合基因的B-Trx片段。用Xho I和Hind III酶切pUC57_A載體，回收甘精胰島素的A鏈基因片段待用。將經(jīng)Xho I和Hind III酶切的pET28a載體與上述酶切過(guò)的A鏈基因片段用T4連接酶連接，獲得pET28a-A質(zhì)粒。用EcoR I和Hind III酶切pET28a_A質(zhì)粒，與經(jīng)過(guò)相同酶切的B-Trx片段連接，最終獲得pET28a-B-Trx-A (即pET-1NG)質(zhì)粒載體。2、甘精胰島素表達(dá)質(zhì)粒pET-1NG的誘導(dǎo)表達(dá)
將表達(dá)質(zhì)粒pET-1NG轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)大腸桿菌，再將單克隆接種到3毫升含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜菌按1:1000的比例轉(zhuǎn)接到3毫升含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C搖菌培養(yǎng)。當(dāng)A600 nm達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為0.3 mM IPTG，20°C誘導(dǎo)17小時(shí)。離心收集菌體，將菌體重新懸浮于300微升的PBS中，超聲破碎，12，000 rpm 4°C離心10分鐘，取菌體裂解液上清及沉淀進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。3、甘精胰島素與多分子伴侶共表達(dá) 用pET-1NG和多分子伴侶表達(dá)質(zhì)粒pGTF2 (表達(dá)分子伴侶GroEL、GroES、TF)共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，根據(jù)卡那霉素和氯霉素的抗性挑選克隆。將單克隆接種到3毫升含卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜菌按1:1000的比例轉(zhuǎn)接到3毫升LB液體培養(yǎng)基中37°C搖菌培養(yǎng)。當(dāng)A600 nm達(dá)到0.6時(shí)，在20°C條件下，用0.3 mM IPTG和20 ng/ml四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)17小時(shí)，按照先誘導(dǎo)pET-1NG或先誘導(dǎo)pGTF2或者兩者同時(shí)誘導(dǎo)的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而探索最優(yōu)誘導(dǎo)條件，將誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。pET-1NG表達(dá)質(zhì)粒:抗生素篩選標(biāo)記:卡那霉素，誘導(dǎo)物:IPTG ；pGTF2表達(dá)質(zhì)粒:抗生素篩選標(biāo)記:氯霉素，誘導(dǎo)物:四環(huán)素。
4、甘精胰島素目的蛋白的初步純化
甘精胰島素表達(dá)質(zhì)粒pET-1NG轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)大腸桿菌后，挑選單克隆接種到I升LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為0.3 mM IPTG, 20°C誘導(dǎo)17小時(shí)。pET-1NG和pGTF2共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，挑選單克隆接種到I升LB培養(yǎng)基中，同時(shí)加入0.3 mM IPTG和20 ng/ml四環(huán)素,20°C誘導(dǎo)表達(dá)17小時(shí),7，000 rpm 4°C離心收集兩種菌體，分別重懸于裂解緩沖液(50 mM NaH2P04,300 mM NaCL, 10 mM咪唑，pH 8.0)中，冰浴超聲(2秒開(kāi)，2秒關(guān)，20分鐘)破菌后4。。，12，000 rpm，10分鐘收集上清過(guò)Zn2+ Sepharose 6FF柱,500mM咪唑洗脫得到目的蛋白，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算目的蛋白的產(chǎn)量。在實(shí)施例1中，我們構(gòu)建的甘精胰島素表達(dá)質(zhì)粒pET-1NG的目標(biāo)蛋白為甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈。含表達(dá)質(zhì)粒pET-1NG的BL21 (DE3)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在相對(duì)分子質(zhì)量為25 kD處有一明顯的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，與重組目標(biāo)蛋白甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈的相對(duì)分子質(zhì)量一致(圖1)。在20°C低溫表達(dá)時(shí)，有超過(guò)60%的目的蛋白以不可溶的包涵體形式存在于沉淀中。當(dāng)同時(shí)誘導(dǎo)多分子伴侶和甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈共表達(dá)，目的蛋白中可溶性甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈的含量最高，目標(biāo)蛋白的78%以上的蛋白為可溶性，可溶性的目的蛋白表達(dá)占細(xì)菌上清總蛋白的比例為28%，約為只誘導(dǎo)表達(dá)pET-1NG時(shí)的兩倍，說(shuō)明多分子伴侶能夠有效地提高目的蛋白的可溶性(圖2)。當(dāng)表達(dá)質(zhì)粒pET-1NG單獨(dú)表達(dá)時(shí),經(jīng)Zn2+ Sepharose 6FF親和層析純化,得到目的蛋白1.5 mg，純度為72% ;當(dāng)表達(dá)質(zhì)粒pET-1NG和多分子伴侶表達(dá)質(zhì)粒pGTF2共同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，經(jīng)Zn2+ Sepharose 6FF親和層析純化，得到目的蛋白4.5 mg，純度為65%，是pET-1NG單獨(dú)表達(dá)時(shí)產(chǎn)量的3倍，從而說(shuō)明甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈與多分子伴侶共表達(dá)可以顯著提高可溶性ING-Trx的產(chǎn)量。硫氧還蛋白(Trx)可以促進(jìn)二硫鍵的正確折疊，有利于提高目標(biāo)蛋白的可溶性，但是與Trx融合表達(dá)的胰島素可溶性依然較低，并且融合Trx后使得目的蛋白表達(dá)后需要進(jìn)行Trx和胰島素C肽的兩 步切割，造成了生產(chǎn)工藝的繁瑣。本發(fā)明采用Trx代替C肽，使Trx同時(shí)兼具連接肽和可溶性融合標(biāo)簽的雙重功能，使得目的蛋白表達(dá)后只需進(jìn)行Trx一步切割，有效地簡(jiǎn)化了純化步驟。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用Trx代替C肽并沒(méi)有顯著有效地改善目的蛋白甘精胰島素的可溶性。分子伴侶可以減少蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，同時(shí)在蛋白質(zhì)折疊完畢后與之分離，不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。但是以往的研究往往只是用個(gè)別分子伴侶，例如分子伴侶GroEL、GroES，但是效果并不明顯。本實(shí)驗(yàn)采用多分子伴侶(GroEL、GroES, TF)與甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈共表達(dá)，并試驗(yàn)了不同的誘導(dǎo)方案(圖3)。多分子伴侶共表達(dá)后，再加上培養(yǎng)溫度的調(diào)節(jié)，甘精胰島素的可溶性表達(dá)得到了顯著提高。其中多分子伴侶與甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈同時(shí)誘導(dǎo)時(shí)，可溶性甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈的含量最聞，占目標(biāo)蛋白的78%,是只表達(dá)甘精膜島素A鏈-Trx-甘精膜島素B鏈的2倍。同時(shí)，我們也可以看到，先誘導(dǎo)多分子伴侶并不能有效提高目的蛋白的可溶性。多分子伴侶與甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈共表達(dá)時(shí)目標(biāo)蛋白經(jīng)初步純化，得到目的蛋白的產(chǎn)量是只表達(dá)甘精胰島素A鏈-Trx-甘精胰島素B鏈時(shí)的3倍。由于胰島素及其衍生物的C肽去除工藝及方法是在目前胰島素類多肽藥物生產(chǎn)中已經(jīng)是常規(guī)的、成熟的技術(shù)，因此，本發(fā)明未對(duì)C肽去除工藝再進(jìn)行深入的研究和探索。因此，本發(fā)明成功證明了采用Trx代替C肽的可行性，以及使用多分子伴侶、加上表達(dá)溫度的調(diào)控，可以顯著提高目的蛋白的可溶性表達(dá)，為胰島素及其衍生物的基因工程生產(chǎn)提供了新方法和新思路 。
權(quán)利要求
1.一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法，其特征是通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)一種以Trx替代重組胰島素及其衍生物A、B鏈之間的C肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法，其特征是合成或者克隆含有Trx替代C肽的重組胰島素及其衍生物基因、構(gòu)建該種重組胰島素及其衍生物的表達(dá)質(zhì)粒，在常見(jiàn)的微生物表達(dá)體系中進(jìn)行基因工程表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法，其特征是將該種重組胰島素及其衍生物表達(dá)菌株在10-35°C的低溫下表達(dá)該種重組胰島素及其衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法，其特征是將該種重組胰島素及其衍生物與多種分子伴侶共表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法，其特征是在10-35°C的低溫下進(jìn)行該種重組胰島素及其衍生物與多種分子伴侶的共表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法所表達(dá)的可溶性重組胰島素及其衍生物的純化方法，其特征是利用鋅離子金屬親和層析純化、制備可溶性重組胰島素及其衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法在制備重組胰島素及其衍生物藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所制備的可溶性重組胰島素及其衍生物在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用 。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達(dá)方法及其應(yīng)用。該表達(dá)方法利用重組DNA技術(shù)以Trx替代重組胰島素及其衍生物A、B鏈之間的C肽、從而有效改善可溶性重組胰島素及其衍生物的基因工程表達(dá)產(chǎn)量。該表達(dá)方法與低溫表達(dá)、多分子伴侶共表達(dá)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能夠顯著提高可溶性重組胰島素及其衍生物的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供了一種可溶性重組胰島素及其衍生物的純化制備方法及其在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/28GK103194478SQ201310133270
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者華子春, 甘子儀 申請(qǐng)人:南京大學(xué)