專利名稱：一種靶向微泡造影劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種靶向微泡造影劑及其制備方法。
背景技術：
微泡造影劑作為基因治療中的一種安全載體，在超聲輻照下能夠有效地進行靶向性基因轉(zhuǎn)染，成為當前腫瘤基因治療領域的研究熱點。將載有目的基因的微泡造影劑經(jīng)靜脈注射后，在靶組織給予一定條件的超聲照射，可使血管內(nèi)的微泡破裂并釋放基因，同時產(chǎn)生“空化效應”和“聲孔效應”可使毛細血管穿透性及細胞膜通透性增加，從而促進釋放基因大量進入靶細胞，具有安全、無創(chuàng)，并可作用于深部組織和器官的特點，是一種新型的基因靶向傳輸技術，具有廣闊的發(fā)展空間。
然而普通微泡載基因微泡造影劑本身并無主動靶向性，與組織沒有特異性結合位點，經(jīng)血管注射后，微泡在體內(nèi)將隨機分布，只有超聲輻照處的微泡才能定向破裂釋放基因，大量的微泡流經(jīng)超聲輻照以外的部位，自由分解消化，從而造成微泡及基因的大量流失破壞。因此在微泡上連接腫瘤特異性靶向配體或抗體，導致更多的“配體-受體對”形式，使微泡和靶器官之間結合的更緊密。盡管如此，在體內(nèi)環(huán)境下，由于血液具有流動性，靶向微泡與受體接觸時間短暫，靶向微泡配體-受體對形成數(shù)量不足，而且血流沖刷作用又會將一部分結合的靶向微泡沖刷掉，導致有效的靶向微泡配體-受體數(shù)量有限，基因轉(zhuǎn)染率仍達不到理想水平。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效增加靶向微泡配體-受體對形成數(shù)量，進一步提高載基因微泡基因轉(zhuǎn)染率的靶向微泡造影劑及其制備方法。
本發(fā)明提供的靶向超聲微泡造影劑，為平均粒徑為1-4微米的微泡混懸液，球壁材料包括DSPE和DPPA和聚乙二醇和泊洛沙姆，包裹氣體為氟碳類組織相容性惰性氣體，溶液為去離子雙蒸餾水，球壁材料中還含有結合多肽配體C(RGDyK)的PEG連接臂，其結構為DSPE-PEG-c(RGDyK)。
所述DSPE的重量百分含量為造影劑的0.2%-0.8%, DPPA的重量百分含量為造影劑的 0.02%-0.2%o
所述球壁材料中聚乙二醇分子量為4000-6000，其重量百分含量為造影劑的0.05%-0.4%O
所述泊洛沙姆的重量百分含量為造影劑的0.01%-0.1%。
所述氟碳類組織相容性惰性氣體為全氟丙烷。
所述PEG連接臂中PEG分子量為800-2000，DSPE-PEG-c (RGDyK)的重量百分含量為造影劑的0.1%-0.2%。
上述的靶向超聲微泡造影劑的制備方法，包括以下步驟:
(I)將C(RGDyK)和DSPE-PEG和DIEA (N，N-二異丙基乙胺)加入到乙腈中，加入HBTU,室溫下反應得到 DSPE-PEG-c (RGDyK)；
(2)將DSPE、DPPA和泊洛沙姆，40_60°C充分混懸于雙蒸水中，制成混懸液A，將DSPE-PEG-c (RGDyK)溶于無水乙醇中，溶解完全，制成溶液B ；
(3)混懸液A于探頭超聲儀中進行超聲處理，在超聲過程中逐滴加入溶液B，得到澄清液C ；
(4)將聚乙二醇加入澄清液C中，溶解完全；再將氟碳類組織相容性惰性氣體通入溶液C中，充分飽和的同時，應用高速機械剪切設備處理，形成平均粒徑為1-4微米的微泡混懸液。
本發(fā)明的微泡造影劑采用的靶向配體為環(huán)狀五肽C(RGDyK)，即cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys),其分子片段小,且易進行共價偶聯(lián)。該配體既可與微泡采用共價方法穩(wěn)定連接，又可與整合素靶向性結合；而整合素由于僅在腫瘤毛細血管及腫瘤細胞有高表達，而在正常細胞不表達或表達甚微，所以C(RGDyK)是較理想的配體，具有腫瘤新生血管靶向和腫瘤細胞特異性靶向功能。
PEG為親水性高聚合度的柔性連接臂。運用其作為連接臂的靶向微泡水溶性好，在體內(nèi)具有較長的半衰期。可使微泡在體內(nèi)有較長的時間與靶器官更加緊密的結合。
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，具有性質(zhì)穩(wěn)定，抗氧化性強，成品穩(wěn)定等特點，是首選的輔料。
本發(fā)明的靶向微泡造影劑，以腫瘤組織中的整合素為靶點，采用共價偶聯(lián)法，通過PEG衍生物連接臂(PEG-DSPE)將c (RGDyK)以共價結合法連于自制脂質(zhì)微泡上制備出帶連接臂的靶向微泡造影劑，使PEG連接臂一端連著含有RGD結構的與之結合力強的環(huán)狀五肽c (RGDyK)配體，另一端與二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)相連。
本發(fā)明插入柔軟的連接臂作為一種鏈繩結構，其系著配體的游離端活動度大，在靶區(qū)能提供配體與受體結合所需的相對較長的接觸時間與更多的接觸機會；再者，有了連接臂后配體能充分暴露在造影劑表面，而直接連接時部分配體可能掩埋在造影劑外殼材料之中，造成配體的浪費。運用PEG及其衍生物作為連接臂的靶向微泡水溶性好，在體內(nèi)具有較長的半衰期，此外PEG長鏈還具有很好的柔韌性，且可產(chǎn)生較好的空間位阻作用，綜合作用的結果是使血液中調(diào)理蛋白對納米粒的粘附性下降，從而降低了 MPS吞噬細胞對微泡的識別和吞噬作用。該種連接臂上面都含有可供共價修飾的官能團，如氨基，羧基，羥基等，這為它們與配體和微泡之間的共價偶聯(lián)提供了物質(zhì)基礎。所以連接臂的加入十分有助于增強配體與受體之間的粘附，會有更多的靶向微泡配體一受體對形成，微泡與靶器官之間的結合便更加緊密，不易被循環(huán)血液帶走，靶向結合力便會大大提高，從而獲得更好的基因轉(zhuǎn)染率和腫瘤治療效果。
本發(fā)明微泡造影劑的制備工藝采用超聲勻化、高速剪切機剪切生成微泡的方法，具有制備原料少，制備工藝簡單、方便，制備的超聲微泡大小適宜、粒徑分布均一、靶向探針結合率高等特點。


圖1為不帶連 接臂的靶向微泡造影劑示意圖。
圖2為本發(fā)明的帶連接臂的靶向微泡造影劑示意圖。
圖3為本發(fā)明的靶向微泡造影劑的光學顯微鏡圖(X400)。
圖4為本發(fā)明的靶向微泡造影劑的熒光顯微鏡圖片(X400)。
圖5為實施例5組I熒光顯微鏡觀察腫瘤組織的EGFP顯影強度(100X)。
圖6為實施例5組II熒光顯微鏡觀察腫瘤組織的EGFP顯影強度(100X)。
圖7為實施例5組III熒光顯微鏡觀察腫瘤組織的EGFP顯影強度(100X)。
具體實施方式
實施例1:合成本發(fā)明的DSPE-PEG-c (RGDyK)靶向微泡造影劑
本發(fā)明的DSPE-PEG-c (RGDyK)靶向微泡造影劑如圖2所示，通過下述步驟制備:
(I)合成 DSPE-PEG-c (RGDyK):將 10 毫摩爾 c (RGDyK)和 10 毫摩爾 DSPE-PEG2000，30毫摩爾的DIEA (N，N- 二異丙基乙胺)加入到15mL乙腈中，隨后加入20毫摩爾的HBTU，室溫反應30分鐘，環(huán)狀五肽c (RGDyK)的-NH2基與DSPE-PEG的-OH基通過共價偶聯(lián)得產(chǎn)物DSPE-PEG-c (RGDyK)，減壓蒸干溶劑，柱色譜層析，經(jīng)高效液相色譜分析，純度>95%，質(zhì)譜鑒定分子結構正確；
(2)將40mgDSPE、4mgDPPA、5mg泊洛沙姆，40_60°C充分混懸于5ml雙蒸水中，制成混懸液A ;將8mg DSPE-PEG2000-C (RGDyK)溶于150-250微升無水乙醇中，于40°C條件下溶解完全，制成溶液B ;
(3)混懸液A于探頭超聲儀中進行超聲處理(工作3秒，暫停3秒，功率30%，3分鐘，頻率20kHz)，超聲次數(shù)為一次或兩次，在超聲過程中逐滴加入溶液B，觀察所制得的溶液均澄清，得到澄清液C ;
(4)將20mg PEG4000加入澄清液C中，溶解完全；再將全氟丙烷氣體通入溶液C中，充分飽和的同時，應用高速機械剪切設備處理(lX104r/min)2min，形成平均粒徑為1_4微米的微泡混懸液。
表征方法如下:將微泡分散于生理鹽水中，顯微鏡下觀察制備的超聲微泡大小均勻適宜、粒徑分布均一、分散良好(見圖3);測定微泡濃度為1.5X109/mL，平均粒徑為(1.5±0.5) ii m,粒徑均一,97%微泡直徑小于5 ii m。新型革巴向超聲造影劑突光顯微鏡圖片(X400):可見密集分布的表面呈綠色光環(huán)的微泡，其濃度密集，大小均一，形態(tài)規(guī)整。證實有靶向環(huán)狀多肽配體連于微泡表面(見圖4)。
得到的靶向微泡造影劑，球壁材料各組成成分的重量百分比為:
DSPE-PEG2000·-C(RGDyK)，0.16%
PEG4000 (微泡膜材料)，0.4%
磷脂:DSPE(0.8%), DPPA (0.08%)
泊洛沙姆,0.1%
包裹氣體為全氟丙烷，溶液為去離子雙蒸餾水。
按實施例1的方法制備實施例2、3的DSPE-PEG-c (RGDyK)靶向微泡造影劑，所不同的是加入的原料質(zhì)量，見表1，得到的微泡造影劑其球壁材料各組成成分的重量百分比也列在表I中。
表I
權利要求
1.一種靶向超聲微泡造影劑，為平均粒徑為1-4微米的微泡混懸液，球壁材料包括DSPE和DPPA和聚乙二醇和泊洛沙姆，包裹氣體為氟碳類組織相容性惰性氣體，溶液為去離子雙蒸餾水，其特征在于球壁材料中含有結合多肽配體c (RGDyK)的PEG連接臂，其結構為DSPE-PEG-c(RGDyK)。
2.根據(jù)權利要求1所述的靶向超聲微泡造影劑，其特征在于所述DSPE的重量百分含量為造影劑的0.2%-0.8%，DPPA的重量百分含量為造影劑的0.02%-0.2%。
3.根據(jù)權利要求1所述的靶向超聲微泡造影劑，其特征在于所述球壁材料中聚乙二醇分子量為4000-6000，其重量百分含量為造影劑的0.05%-0.4%。
4.根據(jù)權利要求1所述的靶向超聲微泡造影劑，其特征在于所述泊洛沙姆的重量百分含量為造影劑的0.01%-0.1%。
5.根據(jù)權利要求1所述的靶向超聲微泡造影劑，其特征在于所述氟碳類組織相容性惰性氣體為全氟丙烷。
6.根據(jù)權利要求1所述的靶向超聲微泡造影劑，其特征在于所述PEG連接臂中PEG分子量為800-2000，DSPE-PEG-c (RGDyK)的重量百分含量為造影劑的0.1%-0.2%。
7.—種權利要求1-6之一所述的靶向超聲微泡造影劑的制備方法，包括以下步驟: (IMfc(RGDyK)和DSPE-PEG和DIEA (N’N-二異丙基乙胺)加入到乙腈中，加入HBTU，室溫下反應得到DSPE-PEG-c (RGDyK)； (2 )將DSPE、DPPA和泊洛沙姆，40-60°C充分混懸于雙蒸水中，制成混懸液A，將DSPE-PEG-c (RGDyK)溶于無水乙醇中，溶解完全，制成溶液B ； (3)混懸液A于探頭超聲儀中進行超聲處理，在超聲過程中逐滴加入溶液B，得到澄清液C ; (4)將聚乙二醇加入澄清液C中，溶解完全；再將氟碳類組織相容性惰性氣體通入溶液C中，充分飽和的同時，應用高速 機械剪切設備處理，形成平均粒徑為1-4微米的微泡混懸液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向微泡造影劑，將環(huán)狀多肽配體c(RGDyK)與DSPE-PEG通過共價鍵偶聯(lián)合成DSPE-PEG-c(RGDyK)，使配體與微泡之間插入PEG衍生物(PEG-DSPE)連接臂，采用超聲振蕩勻化、高速剪切法制備有連接臂的靶向微泡造影劑。配體與微泡之間插入PEG衍生物連接臂制備的靶向微泡造影劑，有助于增強配體與受體之間的粘附，能夠有效增加靶向微泡配體-受體對形成數(shù)量，使微泡與靶器官之間的結合更加緊密，進一步提高載基因微泡基因轉(zhuǎn)染率。
文檔編號A61K49/22GK103230605SQ20131015141
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月27日 優(yōu)先權日2013年4月27日
發(fā)明者周平, 李家樂, 高峰 申請人:中南大學湘雅三醫(yī)院, 周平