專利名稱：蛋白質(zhì)aggf1及其fha多肽在制備抗炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種蛋白質(zhì)AGGFl及其FHA多肽在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炎癥是指具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)，炎癥對(duì)機(jī)體損傷的局部組織所呈現(xiàn)的反應(yīng)稱為炎癥反應(yīng)。血管炎癥反應(yīng)是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致多種人類疾病的發(fā)生,如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、腫瘤以及衰老等。而在炎癥疾病的發(fā)展過程中，血管炎癥反應(yīng)是炎癥反應(yīng)的必然反應(yīng)。而血管炎癥會(huì)導(dǎo)致心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化與急性冠脈綜合癥等疾病的發(fā)生，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，甚至給患者帶來生命危險(xiǎn)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活是驅(qū)動(dòng)血管炎癥反應(yīng)的重要步驟之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞之間的黏附增加；黏附因子如E-Selectin、ICAM，趨化因子IL-8等表達(dá)增加。因此抑制內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞之間的黏附反應(yīng)，減少黏附因子如E-Selectin, ICAM，趨化因子IL-8等表達(dá)，從而抑制血管內(nèi)皮的激活，可以有效地抑制血管炎癥的發(fā)生，有效地預(yù)防和/或治療炎癥相關(guān)疾病。已有研究表明，通過抑制炎癥相關(guān)因子，如E-Selectin、ICAM-U IL-8等的表達(dá)，或是抑制NF-KB活性來實(shí)現(xiàn)抵抗炎癥的作用，同時(shí)，抑制E-Selectin、ICAM-1、IL-8或其相關(guān)的受體，或是NF-KB信號(hào)通路也可以抑制炎癥疾病的發(fā)生。以Selectin為例，現(xiàn)在已有多種抑制E-Selectin的化合物并用作藥物試驗(yàn)的研究(如表I所示)，以期達(dá)到抑制炎癥相關(guān)疾病的作用。但是由于炎癥疾病的異質(zhì)性，現(xiàn)有的抗炎藥物只能特異性的治療炎癥疾病，嚴(yán)重的限制了抗炎藥物的應(yīng)用和炎癥疾病的治療。
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L se!ectlnLD20lrlWyethNeXStarPreclinicalHldce etal 1996蛋白質(zhì)AGGF1，又名VG5Q，在物種間高度保守，含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，即Coiled-coil，OCRE, FHA, G-patch。AGGFl表達(dá)較廣泛，在血管內(nèi)皮、平滑肌以及腫瘤細(xì)胞中具有較高的表達(dá)。AGGFl具有強(qiáng)烈的促進(jìn)血管新生的功能，這在體外的matrigel成管模型與體內(nèi)小鼠后肢缺血模型中都得到了很好的驗(yàn)證。AGGFl基因敲除的小鼠在胚胎ES.5天死亡。但是AGGFl與血管炎癥的關(guān)系目前尚無報(bào)道。FHA由65-100個(gè)氨基酸構(gòu)成，是一個(gè)物種間保守的結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。盡管FHA的核心氨基酸在不同的物種中高度保守，但其他氨基酸序列卻高度異質(zhì)。FHA結(jié)構(gòu)域存在于多種蛋白中，如激酶，磷酸化酶，轉(zhuǎn)錄因子，代謝酶等，參與DNA損傷、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白降解等細(xì)胞內(nèi)重要生理過程。另外，F(xiàn)HA能夠識(shí)別磷酸化的蘇氨酸殘基而與該磷酸化蛋白結(jié)合。而關(guān)于FHA與血管炎癥之間的關(guān)系目前尚無報(bào)道。AGGFl核苷酸序列可用pcDNA3.1-AGGFl質(zhì)粒為模板，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得。AGGFl核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有抗炎藥物只能特異性治療炎癥疾病的問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種蛋白質(zhì)AGGFl及其FHA多肽的新用途，具體是在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。所述技術(shù)方案如下:本發(fā)明的第一方面提供了一種多肽，其氨基酸序列含有或由如序列表中SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示序列組成。具體的，如本發(fā)明實(shí)施例中所述，一種FHA多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，由74個(gè)氨基酸構(gòu)成；如本發(fā)明實(shí)施例所述，一種AGGFl蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明的第二方面提供了與本發(fā)明第一方面提供的多肽氨基酸序列有80%、81%、82%、83%、84%、85%、8 6、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性的多肽。本發(fā)明的第三方面提供了如本發(fā)明第一方面提供的多肽在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。具體的，在本發(fā)明實(shí)施例中，提供了如序列表中SEQ ID NO:1所示的FHA多肽和如序列表中SEQ ID N0:2所示的AGGFl蛋白質(zhì)在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。如本發(fā)明實(shí)施例中所述，發(fā)明人比較了含有空病毒載體(GFP)的血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、攜帶AGGFl序列病毒載體(AGGFl)的血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、攜帶FHA結(jié)構(gòu)域缺失的AGGFl核苷酸序列的病毒載體(d FHA-AGGFI)的血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC與單核白細(xì)胞U937的粘附作用，發(fā)現(xiàn)與GFP組相比，AGGFl蛋白可以明顯抑制HUVEC與U937細(xì)胞之間的粘附，AGGFl的FHA結(jié)構(gòu)域缺失之后，AGGFl的抑制作用減弱，說明FHA結(jié)構(gòu)域參與了抑制內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC與單核細(xì)胞U937細(xì)胞粘附的過程，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC與單核細(xì)胞U937細(xì)胞粘附的作用。同時(shí)，本發(fā)明實(shí)施例中，用空病毒載體(GFP)、攜帶AGGFl序列病毒載體(AGGFl)、攜帶FHA結(jié)構(gòu)域缺失的AGGFl核苷酸序列的病毒載體(d FHA-AGGF1)檢測(cè)所述FHA多肽、所述蛋白質(zhì)AGGFl對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中黏附因子E-Selectin、ICAM、IL-8表達(dá)的作用，發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)AGGFl可以明顯減少內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中黏附因子E-Selectin、ICAM和趨化因子IL-8的表達(dá)，AGGFl缺失FHA結(jié)構(gòu)域之后，對(duì)炎癥分子的抑制作用明顯減弱。說明FHA結(jié)構(gòu)域參與了抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的過程，從而抑制血管內(nèi)皮的激活，可以有效地抑制血管炎癥的發(fā)生。另外，本發(fā)明實(shí)施例中，用空病毒載體(GFP)、攜帶AGGFl序列病毒載體(AGGFl)、攜帶FHA結(jié)構(gòu)域缺失的AGGFl核苷酸序列的病毒載體(d FHA-AGGF1)檢測(cè)所述FHA多肽、所述蛋白質(zhì)AGGFl對(duì)NF- K B啟動(dòng)子活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)，與GFP組相比，所述蛋白質(zhì)AGGFl可以顯著減弱NF-k B啟動(dòng)子的活性，從而抑制血管內(nèi)皮的激活，可有效的抑制血管炎癥的發(fā)生，而缺失FHA結(jié)構(gòu)域之后，AGGFl對(duì)NF-κ B啟動(dòng)子活性的抑制作用明顯減弱。綜上所述，本發(fā)明的如SEQ ID NO:1所示的FHA多肽和如SEQ ID Ν0:2所示的蛋白質(zhì)AGGFl可以明顯抑制HUVEC與U937細(xì)胞之間的粘附、減少內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中黏附因子E-Selectin、ICAM和趨化因子IL-8表達(dá)、抑制NF-κ B啟動(dòng)子活性，從而抑制血管內(nèi)皮的激活，因此，如SEQ ID NO:1所示的FHA多肽和如SEQ ID NO: 2所示的蛋白質(zhì)AGGFl可有效用于制備抗炎藥物，氨基酸序列含有或由如序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列組成的多肽可有效用于制備抗炎藥物。本發(fā)明第四方面提供了編碼本發(fā)明第一方面提供的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的第五方面提供了含有編碼本發(fā)明第一方面提供的多肽的多核苷酸的載體。在本發(fā)明實(shí)施例中，具體為含有編碼FHA多肽的多核苷酸的質(zhì)粒載體p-shuttle-FHA ；以及含有編碼所述蛋白質(zhì)AGGFl的多核苷酸的質(zhì)粒載體p-shuttle-AGGFl。如本發(fā)明實(shí)施例中所述，分別將AGGFl、FHA的多核苷酸插入p-shuttle-1RES-GFP質(zhì)粒載體，獲取含有AGGFl多核苷酸的質(zhì)粒載體p-shuttle-AGGFl以及含有FHA的多核苷酸的質(zhì)粒載體p-shuttIe-FHAο本發(fā)明的第六方面提供了含有所述質(zhì)粒載體p-shuttle-FHA的宿主細(xì)胞或腺病毒載體，以及含有所述質(zhì)粒載體P-shuttle-AGGFl的宿主細(xì)胞或腺病毒載體。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的，所述宿主細(xì)胞為微生物。具體的，在本發(fā)明實(shí)施例中，將所述質(zhì)粒載體p-shuttIe-FHA轉(zhuǎn)入到腺病毒中，構(gòu)建含有上述質(zhì)粒載體的腺病毒載體Adv-FHA，將所述腺病毒載體Adv-FHA感染人胚胎腎細(xì)胞，對(duì)所述腺病毒載體進(jìn)行擴(kuò)增；將所述質(zhì)粒載體p-shuttle-AGGFl轉(zhuǎn)入到腺病毒中，構(gòu)建含有上述質(zhì)粒載體的腺病毒·載體Adv-AGGFl，將所述腺病毒載體Adv-FHA感染人胚胎腎細(xì)胞，對(duì)所述腺病毒載體進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明的第七方面提供了含有所述腺病毒載體Adv-FHA的血管內(nèi)皮細(xì)胞；含有所述腺病毒載體Adv-AGGFl的血管內(nèi)皮細(xì)胞。如本發(fā)明實(shí)施例中所述，將構(gòu)建的含有目的基因的腺病毒載體Adv-FHA轉(zhuǎn)入到血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中，使多肽FHA在血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中進(jìn)行表達(dá)；將構(gòu)建的含有目的基因的腺病毒載體Adv-AGGFl轉(zhuǎn)入到血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中，使目的蛋白AGGFl在血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的第八方面提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有本發(fā)明第一方面和第二發(fā)明提供的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:通過克隆、表達(dá)如SEQ ID NO:1所示的FHA多肽和如SEQ ID N0:2所示的蛋白質(zhì)AGGFl，并檢驗(yàn)所述FHA多肽在內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC與單核細(xì)胞U937細(xì)胞粘附過程中的作用以及檢測(cè)所述FHA多肽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中E-Selectin、ICAM、IL-8的表達(dá)的抑制作用以及對(duì)NF-κ B啟動(dòng)子活性的抑制作用，檢驗(yàn)所述蛋白質(zhì)AGGFl在內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC與單核細(xì)胞U937細(xì)胞粘附過程中的作用以及檢測(cè)所述蛋白質(zhì)AGGFl對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中黏附因子E-Selectin、ICAM和趨化因子IL-8表達(dá)的抑制作用以及對(duì)NF-K B啟動(dòng)子活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)所述FHA多肽、所述蛋白質(zhì)AGGFl具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC與單核細(xì)胞U937細(xì)胞粘附的作用、減少內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中黏附因子E-Selectin、ICAM和趨化因子IL-8表達(dá)的作用以及抑制NF-κ B啟動(dòng)子活性的作用，從而抑制血管內(nèi)皮的激活，可以有效地抑制血管炎癥的發(fā)生。因此，本發(fā)明提供的如SEQ ID NO:1所示的FHA多肽和如SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)AGGFl可有效用于制備抗炎藥物，氨基酸序列含有或由如序列表中SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示序列組成的多肽可有效用于制備抗炎藥物，為制備廣譜抗炎藥物、為預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ)。。


為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明實(shí)施例 提供的FHA結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)示意圖；圖2A是本發(fā)明實(shí)施例提供的western blot檢測(cè)結(jié)果=AGGFl與d FHA-AGGFI的表達(dá)結(jié)果示意圖；圖2B是本發(fā)明實(shí)施例提供的western blot檢測(cè)結(jié)果:FHA的表達(dá)結(jié)果示意圖；圖3A是本發(fā)明實(shí)施例提供的血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核白細(xì)胞粘附結(jié)果顯微鏡照片示意圖；圖3B是本發(fā)明實(shí)施例提供的單核白細(xì)胞粘附數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果直方圖；圖4A是本發(fā)明實(shí)施例提供的粘附因子E-Selectin表達(dá)結(jié)果示意圖；圖4B是本發(fā)明實(shí)施例提供的粘附因子ICAM表達(dá)結(jié)果示意圖；圖4C是本發(fā)明實(shí)施例提供的趨化因子IL-8表達(dá)結(jié)果示意圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的NF- K B啟動(dòng)子活性雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。實(shí)施例1:獲取AGGFl、d FHA-AGGF1、FHA的核苷酸序列。方法:用pcDNA3.1^66 1質(zhì)粒為模板，采用？0 技術(shù)擴(kuò)增466 1，(1 FHA-AGGFI,FHA核苷酸序列。材料:pcDNA3.1-AGGFl 質(zhì)粒(獲取方法參見 Tian XL, Kadaba R, You SA, LiuMj Timur AAj Yang Lj Chen Qj Szafranski P，Rao Sj Wu L，Housman DE，DiCorletoPEj Driscoll DJj Borrow Jj Wang Q.1dentification of an angiogenic factor that whenmutated causes susceptibility to Klippel-Trenaunay syndrome.Nature.2004Febl2;427 (6975): 640-645.)，常規(guī)PCR試劑，正向引物和反向引物(由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒(由博邁德公司提供)。步驟:1、PCR反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))I)引物包括:
AGGFl-subclone-F:如 SEQ ID NO:4 所示；AGGFl-subclone - R:如 SEQ ID NO:5 所示；dFHA-AGGFl-clone - F:如 SEQ ID NO:6 所示；dFHA-AGGFl-clone - R:如 SEQ ID NO:7 所示；FHA-clone - F:如 SEQ ID NO:8 所不；FHA-clone - R:如 SEQ ID N0:9 所不。2) PCR 反應(yīng)體系(25 μ L)
CldH2O19μΙ,
IOxPCR Buffer2.5‘uL
dNTP ( 2.5mM )IpL
引物 PF./PR ( 10μΜ)0.5[iL
模板 DN A ( 10ng/p.L)I μι
TaqDNA聚合酶IpL3) PCR反應(yīng)條件
1)96 C3 min
2)95 "C20 s
3)退火溫度(55-60°C)30 s
4)72 0C45 s
5)72 °C5 min
6)4 °CI min2) -4)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。2,PCR產(chǎn)物的純化:使用博邁德公司提供的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，包括如下步驟:(I)通過PCR反應(yīng)得到25 μ L PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入75 μ L ddH20與其混合，加入500 μ L結(jié)合液,混合均勻后轉(zhuǎn)入離心純化柱內(nèi)結(jié)合數(shù)分鐘。室溫，13000rpm,離心2min,倒
掉廢液。(2)加入500 μ L漂洗液，室溫，13000rpm,離心30s，倒掉廢液。重復(fù)此步操作一次。(3)不加入液體，室溫，I3OOOrpm,離心2min。(4)將純化柱套入干凈的1.5mL EP管內(nèi)，加入40 μ L ddH20 (55°C預(yù)熱)于DNA吸附膜上，不能沾附在管壁。放置2min后，室溫，13000rpm，離心lmin，得到的即為純化后PCR產(chǎn)物。(5)取純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行 0.8%瓊脂糖凝膠電泳，使用NanoDrop.紫外可見分光光度計(jì)(由Thermo Fisher公司提供)測(cè)濃度。3、PCR產(chǎn)物測(cè)序
1) PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)體系(10 ü L)
dc!H204.5μL
5><Seq Buffer1.5 μL引物(2nM )2μL
DMA ( 3-10ng/μL)lμL
BigDye ( v3.1 ,)1 μL2 ) PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)條件
1)96 °Clmin
2)96 V10s
3)50 V5 s
4)60 °C4m.in
5)4 V2m in2)-4)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。3 )純化PCR測(cè)序產(chǎn)物(1)對(duì)每管測(cè)序產(chǎn)物加入1 u L125mM EDTA和1 u L3M NaAc,瞬離；(2)加入25 ii L無水乙醇，吹吸混勻，室溫放置15min ；(3) 4°C, 4000rpm,離心 30min,馬上倒置，離心到 300rpm 即停；(4)加入 35 u L70% 乙醇，4°C, 4000rpm,離心 15min,馬上倒置，300rpm,離心 30s ；(5)等殘余的こ醇揮發(fā)后，加入IOüL Hi-Di甲酰胺，95°C變性4min，馬上冰置 5min，樣品上ABI3130XL基因分析儀電泳。4、PCR產(chǎn)物分析將步驟3測(cè)序得到的核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中記錄的AGGF1序列進(jìn)行對(duì)比分 析。所用核苷酸參考序列如SEQ ID N0:3所示。結(jié)果經(jīng)過將測(cè)序后得到的序列與NCBI中的序列相對(duì)比，證實(shí)成功獲得AGGF1，d FHA-AGGF1 (去掉FHA的AGGF1 )，F(xiàn)HA的核苷酸序列。實(shí)施例ニ 制備含有實(shí)施例一所得的核苷酸序列的質(zhì)粒載體方法將實(shí)施例一所得的AGGF1，d FHA-AGGF1，F(xiàn)HA的核苷酸序列分別插入 p-shuttle-IRES-GFP質(zhì)粒載體，獲取含有AGGF1核苷酸序列的質(zhì)粒載體，含有d FHA-AGGF1 核苷酸序列的質(zhì)粒載體，含有FHA核苷酸序列的質(zhì)粒載體。材料p-shuttle-IRES_GFP質(zhì)粒(由stratagene公司提供)，限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶(由NEB公司提供)，DH5a感受態(tài)細(xì)胞(由天根生化(北京)科技有限公司提供)，質(zhì)粒 提取試劑盒(由博邁德公司提供)。步驟
1.將實(shí)施例一獲得的3種PCR產(chǎn)物與p-shuttle-1RES-GFP質(zhì)粒酶切6小時(shí)，使用博邁德公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒分別回收PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物和p-shuttle-1RES-GFP質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，方法同實(shí)施例一中的PCR產(chǎn)物純化的過程；2.將PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物分別與p-shuttle-1RES-GFP質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物在IOul反應(yīng)體系中進(jìn)行連接反應(yīng)，加入T4DNA連接酶，16°C連接12個(gè)小時(shí)，獲得連接產(chǎn)物；3.將150ng連接產(chǎn)物加入到DH5a感受態(tài)細(xì)胞(2X107個(gè))溶液中，于42度熱激90s，得到含有連接產(chǎn)物的DH5a感受態(tài)細(xì)胞；4.將上述步驟3得到的細(xì)胞溶液加入到無抗性LB培養(yǎng)基中，常溫下?lián)u床培養(yǎng)40分鐘；5.將上述步驟4得到的菌液加入到卡那霉素抗性的細(xì)菌培養(yǎng)皿上，于37°C培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)；6.挑取菌落，接種到無抗性LB培養(yǎng)基中，常溫下?lián)u床培養(yǎng)18小時(shí)，采用質(zhì)粒提取試劑盒從菌液中提取質(zhì)粒 p-shutt le-AGGFl, p-shutt I e_d FHA-AGGF I, p-shuttle-FHA ；7將步驟6所得質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，方法同實(shí)施例一中步驟3PCR產(chǎn)物測(cè)序方法；8將測(cè)序得到的核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中記錄的AGGFl序列進(jìn)行對(duì)比分析，所用核苷酸參考序列如SEQ ID N0:3所示。結(jié)果:經(jīng)過將測(cè)序后得到的序列與NCBI中的序列相對(duì)比，證實(shí)成功獲得含有含有AGGFl核苷酸序列的質(zhì)粒載體p-shuttle-AGGFl，含有d FHA-AGGF1核苷酸序列的質(zhì)粒載體p-shuttle-d FHA-AGGF1，含有 FHA 核苷酸序列的質(zhì)粒載體 p-shutt I e_FHA。實(shí)施例三:腺病毒載體的構(gòu)建與純化目的:構(gòu)建含有實(shí)施例二所`得質(zhì)粒載體的腺病毒載體，并進(jìn)行擴(kuò)增與純化。材料:p-shuttle-AGGFl,p-shuttle_dFHA-AGGFl,p-shuttle-FHA,HEK293A (購買于 ATCC)、HUVEC 細(xì)胞(購買于 ATCC)，CsCl (1.4g/ml 與 1.2g/ml )，PmeI 內(nèi)切酶(由 NEB 公司提供)，PacI內(nèi)切酶(由NEB公司提供)，BJ5183感受態(tài)細(xì)菌(由addgene公司提供)，病毒純化柱(GE healthcare Capto DeVirS.Capto DeVirS)。步驟:1.將 p-shuttle-AGGFl、p-shuttle_d FHA-AGGFl、p-shuttle_FHA 進(jìn)行 PmeI 線性化酶切，回收酶切片段；2.shuttle 質(zhì)粒和 pAdeasy-lVector (由 Stratagene 公司提供)共電轉(zhuǎn) B.T5183 感受態(tài)細(xì)菌；3.提取卡那霉素陽性質(zhì)粒，PacI酶切后轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞；轉(zhuǎn)染方法(I)將HEK293A細(xì)胞傳代至6孔板中，24小時(shí)后(細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；(2)吸取培養(yǎng)液，加入新鮮DMEM (10%FBS) 2mL, 37°C，5%C02條件下培養(yǎng)；(3)配制轉(zhuǎn)染試劑:取2 μ L VigoFect轉(zhuǎn)染試劑加入到98 μ L生理鹽水中，柔和混勻，放置5min ;取待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒5ng，加入生理鹽水將其稀釋到100 μ L ;將稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑緩慢加入到質(zhì)粒稀釋液中，混合均勻，放置20min ；(4)將反應(yīng)好的200 μ L轉(zhuǎn)染溶液加入到6孔板中的I孔細(xì)胞中。
4.7天后收取細(xì)胞，并繼續(xù)感染HEK293A細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；5.最后將20盤150mm培養(yǎng)皿中所有的細(xì)胞離心收集到3ml病毒保存液(IOmmtris-Hcl)；6.將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，離心取上清，即為所獲得的病毒。7.CsCl密度梯度離心病毒；8.純化病毒,最終病毒溶解于IOmm Tris-Hcl中；9.分裝病毒，-80度冰箱保存；10.用逐級(jí)稀釋法感染HEK293A細(xì)胞，估測(cè)病毒滴度。結(jié)果:獲得純化的含有目的基因的腺病毒載體:Adv-AGGFl、Advd FHA-AGGFKAdv-FHA0 實(shí)施例四:實(shí)施例三獲得的腺病毒載體在HUVEC細(xì)胞中表達(dá)蛋白AGGFl和FHA多肽目的:檢測(cè)實(shí)施例三獲得的腺病毒是否可以在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。材料:PBS，蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑，BCA試劑盒，丙烯酰胺，聚丙烯酰胺，過硫酸銨，TEMED，蛋白電泳系統(tǒng)，NC模，flag與GAPDH抗體(上述試劑均由santacruz公司提供)。方法:I使用時(shí)，將上述病毒在冰上融化，按病毒滴度為50M0I感染HUVEC細(xì)胞，并將感染HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含有5%血清(ScienCell)的ECM培養(yǎng)基上，于37度，5% 二氧化碳濃度下進(jìn)行培養(yǎng)；2感染HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，提取細(xì)胞蛋白，western blot檢測(cè)AGGFl和FHA的表達(dá)。western blot檢測(cè)方法如下:I)蛋白質(zhì)提取細(xì)胞用PBS洗兩次，置冰上，加Iml PBS (含1%PI )，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下—40C 13000rpm離心5min —沉淀加入200 μ I PBS (含1%ΡΙ)及50 μ 15Χ蛋白裂解液，冰浴 IOmin — 60% 功率超聲破碎 30s( (5s+5s) X 6)—冰浴過夜一4°C 13000rpm 離心 IOmin —上清用BCA試劑盒測(cè)定濃度一保存于_20°C。2) SDS-PAGE膠蛋白質(zhì)電泳依次配置濃縮膠與分離膠一40ug蛋白樣品與5 X上樣緩沖液按4: I體積比混合，IOO0C 3min —冰浴一上樣，于IX電泳緩沖液中150V恒壓電泳70min。不同濃度濃縮膠與4%分離膠配方如下:
權(quán)利要求
1.一種多妝，其氣基酸序列含有或由如序列表中SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所不序列組成。
2.一種與權(quán)利要求I所述多肽的氨基酸序列有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源性的多肽。
3.如權(quán)利要求I所述的多肽在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
4.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求I一 2中任一項(xiàng)所述的多肽。
5.含有權(quán)利要求4的多核苷酸的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的載體，其為質(zhì)粒載體。
7.一種含有權(quán)利要求5或6所述的載體的宿主細(xì)胞或腺病毒載體。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞或腺病毒載體，其中所述的宿主細(xì)胞為微生物。
9.一種攜帶權(quán)利要求7所述的腺病毒載體的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
10.藥物組合物，其含有權(quán)利要求I一 2中任一項(xiàng)的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的具有強(qiáng)烈抗炎蛋白質(zhì)AGGF1及其FHA多肽，包括在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明通過克隆、表達(dá)如序列表中SEQ ID NO:1所示的FHA多肽和如序列表中SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)AGGF1，并檢驗(yàn)所述FHA多肽、蛋白質(zhì)AGGF1在內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC與單核細(xì)胞U937細(xì)胞粘附過程中的作用、對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中炎癥因子E-Selectin、ICAM、IL-8的表達(dá)作用以及對(duì)NF-κB啟動(dòng)子活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)所述FHA多肽、所述蛋白質(zhì)AGGF1能夠抑制血管內(nèi)皮的激活，進(jìn)而抑制血管炎癥的發(fā)生。因此，本發(fā)明提供的氨基酸序列含有或由如序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO2所示序列組成的多肽可有效用于制備抗炎藥物，為制備廣譜抗炎藥物、為預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K38/16GK103254296SQ20131015702
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者田小利, 胡方園, 張勇 申請(qǐng)人:田小利