專利名稱：一種長效型成纖維細(xì)胞生長因子-23拮抗劑的開發(fā)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及長效型成纖維細(xì)胞生長因子23 (FGF-23)變體肽的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞生長因子23 (fibroblast growth factor 23 , FGF-23)是最近發(fā)現(xiàn)的一種極為重要的調(diào)節(jié)血液中磷代謝的細(xì)胞因子，它最初是作為常染色體顯性遺傳性低磷血癥(autosomal dominant hypophosphatemic rickets, ADHR)和腫瘤誘發(fā)性骨軟化癥(tumor -1nduced osteomalacia, TIO)等低磷血癥的共同致病因子被定義的。FGF_23在其靶器官腎中對磷代謝的調(diào)節(jié)主要是通過抑制近曲小管上皮細(xì)胞的刷狀膜上的鈉-磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白NPT2a和NPT2c表達(dá)，減少腎小管對磷重吸收而降低血磷；通過抑制1，25 (OH) 2D3而抑制NPT2b表達(dá)，減少腸道磷的重吸收；FGF-23還通過抑制近端腎小管上皮細(xì)胞1_ a羥化酶活性而抑制1，25 (OH) 2D3的合成；同時增加25-羥基維生素D-24-羥化酶的活性，誘導(dǎo)1，25(0H)2D3的破壞，加速其降解。由于1，25 (OH) 2D3具有促進(jìn)腸道磷吸收的作用，因此1，25(0H)2D3合成減少后血磷下降。重組FGF-23蛋白注射小鼠后，可致小鼠發(fā)生嚴(yán)重的低磷血癥、骨骼脫鈣化及較低的1，25(0H)2D3水平。研究人員同時發(fā)現(xiàn)小鼠注射重組FGF-23 10分鐘后，MAPK信號通路被快速激活，引起PTH分泌減少。但與對腎小管作用不同的是，F(xiàn)GF-23可劑量依賴性地促進(jìn)牛甲狀旁腺細(xì)胞l-α羥化酶表達(dá)，減少PTH合成。阻斷小鼠FGF-23合成可致高磷、高1，25 (OH) 2D3、高鈣血癥、軟組織鈣化、衰老加速和肺氣腫。因此，F(xiàn)GF-23在許多疾病中表現(xiàn)出的生物學(xué)功能使得它成為一個非常有前景的治療靶標(biāo)。由于耐抗利尿激素性糖尿病(antidiuretichormone resistant diabetes,ADHR)、由腫瘤所導(dǎo)致的低 磷軟骨病(Tumor-1nduced Osteomalacia, TIO)、X-連鎖低血磷性拘僂病(X-Linked Hypophosphatemic Rickets, XLH)都是以腎小管磷重吸收障礙為基礎(chǔ)和以低磷血癥為特征的疾病，同樣，腎移植和腸外離子治療引起的低磷血癥也與血液中增加的FGF-23水平相關(guān)。這就決定了 FGF-23拮抗劑具有非常廣泛的治療群體，而不僅限于由于遺傳性或腫瘤介導(dǎo)的磷重吸收減少的代謝紊亂患者。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一系列FGF-23變體肽能夠起到FGF-23拮抗劑的作用。但大量研究表明FGF-23變體肽存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短等缺陷，需要頻繁給藥方能發(fā)揮其顯著的調(diào)磷作用，而且頻繁的給藥還會引起較強(qiáng)的體內(nèi)免疫原性，這都給該蛋白的功能研究及向臨床轉(zhuǎn)化帶來了嚴(yán)重的障礙。因此如何提高FGF-23變體肽的穩(wěn)定性、延長其體內(nèi)半衰期并降低其體內(nèi)免疫原性顯得非常迫切而重要，而關(guān)于這方面的研究目前尚未見任何報道。為了改善蛋白藥物的穩(wěn)定性差、半衰期短以及體內(nèi)較強(qiáng)的免疫原性等問題，幾種較為常見的策略是:
I)通過基因工程手段對天然蛋白的氨基酸進(jìn)行突變改造以減少其免疫原性并增加其抗蛋白酶降解的能力；
2)通過化學(xué)或基因工程手段將其與免疫球蛋白或血清蛋白偶聯(lián)或者融合；
3)通過藥物釋放載體實現(xiàn)藥物蛋白質(zhì)的保護(hù)和緩釋；
4)通過化學(xué)手段將藥物蛋白質(zhì)與天然或者合成的高分子想偶聯(lián)。用高分子增加蛋白質(zhì)的表觀分子量，遮蔽蛋白質(zhì)表面以達(dá)到減少其免疫原性和抗原以及增加其抗蛋白酶降解的能力。歸因于第4)種方法的操作方便、成功率高等優(yōu)勢，是目前最為常用的方法， 該方法又被成為化學(xué)修飾法，而化學(xué)修飾法中所采用的化學(xué)修飾制劑又以聚乙二醇
(Polyethylene glycol, PEG)應(yīng)用得最為普遍和成熟，當(dāng)然，近年來,一種人體適應(yīng)性更強(qiáng)得多糖修飾制劑也開始成為新的研究熱點。然而，由于PEG化使得蛋白質(zhì)在連接處形成空間位阻或者導(dǎo)致結(jié)構(gòu)翻轉(zhuǎn)，從而使得蛋白質(zhì)本身活性降低，乃至失活(參見Harris等.Clinical Pharmocokinetics, 2001，40(7):539-551 等文獻(xiàn))，因此對于 PEG 化得到的產(chǎn)物的活性，是難以預(yù)料的。本發(fā)明人經(jīng)過長期努力，篩選并建立了穩(wěn)定的FGF-23變體肽修飾工藝，這些工藝獲得了活性保持良好，體外穩(wěn)定性顯著提高、體內(nèi)半衰期顯著延長、體內(nèi)免疫原性顯著降低的FGF-23變體肽修飾產(chǎn)物，而且我們獲得的修飾產(chǎn)物具備均一性好、分離純化工藝簡單的特點，細(xì)胞和動物實驗表明，修飾產(chǎn)物在低磷血癥方面顯示出良好的治療效果
發(fā)明內(nèi)容
·本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的綴合物，其能用于拮抗FGF-23。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了成纖維細(xì)胞生長因子-23變體的聚乙二醇或葡聚糖的綴合物，其特征在于，所述綴合物的活性是等摩爾量的未綴合的FGF-23變體肽的活性的40%以上，優(yōu)選60%以上，更優(yōu)選70%以上，如80%以上。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的綴合物中，成纖維細(xì)胞生長因子-23變體的氨基酸序列如SEQ ID No:2、4 或 6 所示，優(yōu)選為 SEQ ID No:2。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的綴合物中，mPEG或葡聚糖的分子量介于2kDa_22kDa，優(yōu)選為 5kDa、lOkDa、15kDa、或 20kDa。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的綴合物是由包括以下步驟的制備方法制備而得的:
(1)FGF-23變體肽與馬來酰亞胺或丁醛官能團(tuán)化的PEG或葡聚糖混合，避光反應(yīng)后，終止反應(yīng)；
(2)將步驟(I)中的反應(yīng)產(chǎn)物過SephedaxG_25柱除鹽,然后上樣于Resource S陽離子交換柱并用0-1.0 M NaCl的哌嗪-N，N’ - 二(2-乙磺酸)緩沖液梯度洗脫，收集洗脫峰。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的綴合物中，F(xiàn)GF-23變體肽與馬來酰亞胺或丁醛官能團(tuán)化的PEG或葡聚糖的摩爾比介于1:2-1:50，優(yōu)選為1:5、1:10、1:20、1:30。在第二方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明第一方面的綴合物的方法，其包括:
(1)FGF-23變體肽與馬來酰亞胺或丁醛官能團(tuán)化的PEG或葡聚糖混合，避光反應(yīng)后，終止反應(yīng)；
(2)將步驟(I)中的反應(yīng)產(chǎn)物過SephedaxG_25柱除鹽,然后上樣于Resource S陽離子交換柱并用0-1.0 M NaCl的哌嗪-N，N’ - 二(2-乙磺酸)緩沖液梯度洗脫，收集洗脫峰。
優(yōu)選本發(fā)明第二方面的方法中，F(xiàn)GF-23變體肽與馬來酰亞胺或丁醛官能團(tuán)化的PEG或葡聚糖的摩爾比介于1:2-1:50，優(yōu)選為1:5、1:10、1:20、1:30。在第三方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括本發(fā)明第一方面的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。本文中使用的藥學(xué)上可接受的載體指無毒的填充劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、佐劑或其他制劑輔料。例如，稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性齊U、吸附載體、潤滑劑等。根據(jù)本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可以根據(jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，優(yōu)選該組合物為單位給藥劑量形式，如凍干劑、片劑、膠囊、粉劑、乳液劑、水針劑或噴霧劑，更優(yōu)選該藥物組合物為注射劑型(如，凍干粉針劑)，用于注射給藥。在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的綴合物在制備用于拮抗FGF-23的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選本發(fā)明第四方面的應(yīng)用中，藥物是預(yù)防或治療低磷血癥的藥物。本發(fā)明取得的有益效果在于:綴合物的活性保持良好，體外穩(wěn)定性顯著提高、體內(nèi)半衰期顯著延長、體內(nèi)免疫原性顯著降低；制備工藝簡單，綴合物均一性好；能用于治療包括低磷血癥在內(nèi)的疾病。為了便于理解，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，其全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考。以下將通過具體的實施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了。


圖1為20kD PEG(連接丁醛 反應(yīng)基團(tuán)的PEG修飾制劑，mPEG- 丁醛)修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖，其中A為實施例三的修飾的FGF-23變體肽的分離純化產(chǎn)物，B為實施例三的修飾的FGF-23變體肽和回收的未修飾的FGF-23變體肽的混合樣品，C為實施例四的修飾的FGF-23變體肽和回收的未修飾的FGF-23變體肽的混合樣品，D為實施例五的修飾的FGF-23變體肽和回收的未修飾的FGF-23變體肽的混合樣品。圖2為20kD葡聚糖(連接丁醛反應(yīng)基團(tuán)的葡聚糖修飾制劑，葡聚糖-丁醛)修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖，其中A為未修飾的FGF-23變體肽，B為實施例六的修飾的FGF-23變體肽和回收的未修飾的FGF-23變體肽的混合樣品，C為實施例七的修飾的FGF-23變體肽和回收的未修飾的FGF-23變體肽的混合樣品，D為實施例八的修飾的FGF-23變體肽和回收的未修飾的FGF-23變體肽的混合樣品，E為實施例九的修飾的FGF-23變體肽和回收的未修飾的FGF-23變體肽的混合樣品。圖3顯示了 20kD mPEG- 丁醛修飾對FGF-23變體肽抗胰蛋白酶解能力的影響，空心圓圈表示PEG修飾的FGF-23變體肽隨保溫時間的延長而在胰蛋白酶溶液中保留的活性百分比，實心方框表示未經(jīng)葡聚糖修飾的FGF-23變體肽隨保溫時間的延長而在胰蛋白酶溶液中保留的活性百分比，結(jié)果表明表明FGF-23變體肽經(jīng)PEG修飾后抗胰蛋白酶穩(wěn)定性顯著提高。圖4顯示了 20kD葡聚糖-馬來酸酰亞胺修飾對FGF-23變體肽抗酸水解能力的影響，黑色柱表示葡聚糖修飾的FGF-23變體肽在相應(yīng)pH緩沖溶液中于室溫孵育12小時后的活性百分比(以pH 7.0為基準(zhǔn))，灰色柱表示未經(jīng)葡聚糖修飾的FGF-23變體肽在相應(yīng)pH緩沖溶液中于室溫孵育12小時后的活性百分比，結(jié)果表明表明FGF-23變體肽經(jīng)葡聚糖修飾后抗酸水解能力顯著提高。圖5和圖6顯示了 20kD PEG- 丁醛和20kD葡聚糖-丁醛修飾后的FGF-23變體肽對X連鎖拘僂病小鼠(X-linked hypophosphatemic rickets mice, XLH)的低磷血癥的血磷水平的調(diào)節(jié)情況。其中圖5表示給予相關(guān)藥物4小時后小鼠尿液和血液鐘含磷量的變化情況，其中圖5a黑色柱表示給藥前尿液中磷元素的含量，灰色柱表示給藥4小時后尿液中磷元素的含量，圖5b黑色柱表示給藥前血液中磷元素的含量,灰色柱表示給藥4小時后血液中磷元素的含量；圖6a黑色柱表示給藥前尿液中磷元素的含量,灰色柱表示給藥16小時后尿液中磷元素的含量，圖6b黑色柱表示給藥前血液中磷元素的含量,灰色柱表示給藥16小時后血液中磷元素的含量。上述結(jié)果充分顯示FGF-23變體肽在經(jīng)過PEG或者葡聚糖修飾后，保持了很好的調(diào)節(jié)體內(nèi)磷含量的功能，更重要的是，由于FGF-23變體肽經(jīng)過修飾后其穩(wěn)定性顯著提高，因此其在體內(nèi)保持調(diào)磷的功能顯著延長，在給藥16個小時其調(diào)磷作用要顯著優(yōu)于未修飾的FGF-23變體肽。
具體實施例方式 本發(fā)明實施例所用的FGF-23變體肽為如SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，委托浙江格魯斯特生物科技有限公司合成；其中所用的試劑均為可以購買的商品化試劑，如帶有活性接頭分子的PEG可購自美國Shearwater公司，帶有活性接頭的葡聚糖可購自浙江格魯斯特生物科技有限公司。實施例一聚乙二醇-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.5)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與mPEG-馬來酰亞 胺(PEG分子量:5000Da)以摩爾比1:5混合，放置于4°C，避光反應(yīng)12小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S^hedax G_25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.5)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集第一個洗脫峰。將第一個洗脫峰對應(yīng)樣品上ResourceS陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為5mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)Goetz等人(Isolated C-terminaltail of FGF-23 alleviates hypophosphatemia by inhibiting FGF-23-FGFR-Klothocomplex formation.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America, 2010 Jan; 107 (I): 407-412)報道的方法測定 FGF-23 變體肽以及上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物學(xué)活性，將修飾產(chǎn)物活性與修飾前變體肽相除得到生物活性保存率，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為82.1 %。實施例二聚乙二醇-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.5)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量:IOOOODa)以摩爾比1: 10混合，放置于4°C，避光反應(yīng)12小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S^hedax G_25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.5)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為5mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為71.3 %。實施三聚乙二醇-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.0)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與mPEG-丁醛(PEG分子量:20000Da)以摩爾比1: 10混合，放置于室溫，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S^hedax G_25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為62.2%。實施四聚乙二醇-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.0)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與mPEG- 丁醛(PE G分子量:20000Da)以摩爾比1:5混合，放置于室溫，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S^hedax G_25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.5)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為5mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為64.6%。實施五聚乙二醇-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.0)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與mPEG- 丁醛(PEG分子量:20000Da)以摩爾比1:5混合，放置于4°C，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過Sephedax G-25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為72.8%。實施六葡聚糖-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.5)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與葡聚糖-丁醛(葡聚糖分子量:20000Da)以摩爾比1:5混合，放置于4°C，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S印hedax G-25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為68.3%。實施七葡聚糖-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于1OmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.5)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與葡聚糖-丁醛(葡聚糖分子量:20000Da)以摩爾比1:10混合，放置于4°C，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過Sephedax G-25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為66.1%。實施八葡聚糖-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.0)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與葡聚糖-丁醛(葡聚糖分子量:20000Da)以摩爾比1:5混合，放置于室溫，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過Sephedax G-25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為59.1%。實施九葡聚糖-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.0)中的IOmg人源化FGF-23變體肽與葡聚糖-丁醛(葡聚糖分子量:20000Da)以摩爾比1: 10混合，放置于室溫，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過Sephedax G_25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為57.8%。實施例十聚乙二醇-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.5)中的IOmg鼠源化FGF-23變體肽與mPEG- 丁醛(PEG分子量:20000Da)以摩爾比1:5混合，放置于4°C，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過Sephadex G_25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl 的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為52.3%。實施例1^一聚乙二醇-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.0)中的IOmg鼠源化FGF-23變體肽與mPEG-丁醛(PEG分子量:20000Da)以摩爾比1: 10混合，放置于室溫，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過Sephedax G_25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為50.1%。實施例十二葡聚糖-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.5)中的IOmg鼠源化FGF-23變體肽與葡聚糖-丁醛(PEG分子量:20000Da)以摩爾比1:5混合，放置于4°C，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S印hedax G-25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為55.7%。實施例十三葡聚糖-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.0)中的IOmg鼠源化FGF-23變體肽與葡聚糖-丁醛(PEG分子量:20000Da)以摩爾比1: 10混合，放置于室溫，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S印hadex G-25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為45.9%。

實施例十四聚乙二醇-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.5)中的IOmg猴源化FGF-23變體肽與mPEG-丁醛(PEG分子量:20000Da)以摩爾比1:5混合，放置于放置于4°C，避光反應(yīng)48小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S印hadex G-25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為64.5%。實施例十五葡聚糖-FGF-23變體肽的制備
1、修飾反應(yīng):將溶解于IOmLPipes緩沖液(25mM，PH=6.0)中的IOmg猴源化FGF-23變體肽與mPEG- 丁醛(PEG分子量:20000Da)以摩爾比1:10混合，放置于放置于室溫，避光反應(yīng)24小時。加入IM甘氨酸ImL終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化:將步驟I中的反應(yīng)液，過S印hadex G-25柱(20cmX 1.5cm)除鹽:采用25mM Pipes緩沖液(pH=6.0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lmL/min流速上樣，25mM Pipes緩沖液洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰對應(yīng)樣品上Resource S陽離子交換柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes緩沖液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集各洗脫峰，并采用12%的SDS-PAGE電泳分析洗脫峰，結(jié)果表明第一個洗脫峰對應(yīng)的為FGF-23變體肽PEG修飾產(chǎn)物。3、聚乙二醇-FGF-23變體肽的活性鑒定:根據(jù)實施例一所述的方法，測得上述聚乙二醇-FGF-23變體肽的生物活性保存率為47.7%。實施例十六聚乙二醇-FGF-23變體肽的SDS-PAGE分析
將上述實施例一、二、三、四、五、十、i^一和十四收集到的修飾純品，采用SDS-PAGE電泳法檢測，分離膠12%，濃縮膠5%。電泳結(jié)束后，將膠體放入裝有50ml固定液的培養(yǎng)皿中(甲醇16ml，甲醛20μ1,重蒸水24ml )，在搖動下固定10-30分鐘；取出膠體，水洗兩次，每次5分鐘；再放入0.02%的硫代硫酸鈉溶液中，I分鐘；水洗兩次，每次20秒；放入裝有30ml左右的0.1%的硝酸銀溶液中，在搖動下染色10-30分鐘；取出膠體，水洗一次，加入小體積的硫代顯影液(無水碳酸鈉1.5g, 2%硫代硫酸鈉200μ1，甲醛25μ1 )，再轉(zhuǎn)入30_50ml的硫代顯影液中，緩慢搖動至足夠的顯影強(qiáng)度。結(jié)果如圖1所示。實施例十七葡聚糖-FGF-23變體肽的SDS-PAGE分析
將上述實施例六、七、八、九、 十二、十三和十五收集到的修飾純品，采用SDS-PAGE電泳法檢測，分離膠12%，濃縮膠5%。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色并采用由甲醛和乙酸配置的脫色液進(jìn)行脫色，結(jié)果如圖2所示。實施例十八聚乙二醇-FGF-23變體肽的抗酶解能力檢測
分別取含等物質(zhì)量的人源FGF-23變體肽和實施例三制備的PEG-FGF-23變體肽各0.5 mL，與lmmol/L胰蛋白酶溶液混勻，最終蛋白與胰蛋白酶的物質(zhì)量比為10: 1，37°C保溫，于0、2、5、10、20、30、60和120 min取混合樣0.05 ml，立即與無血清RPMI 1640培養(yǎng)基混勻(樣品體積:培養(yǎng)基體積=I: 10)，以終止胰蛋白酶的作用。將處理后的各樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，并將獲得的凝膠采用凝膠掃描分析，觀察蛋白質(zhì)被胰蛋白酶的降解情況。結(jié)果如圖3所示，表明保溫30min后，修飾產(chǎn)物PEG- FGF-23變體肽的含量與酶解前相比仍然存留31.3%，而未修飾產(chǎn)物基本被降解，僅剩余6.3%，由此可見，修飾后的FGF-23變體肽抗胰蛋白酶水解能力明顯增加。實施例十九葡聚糖-FGF-23變體肽的抗酸水解能力檢測
分別取含等物質(zhì)量的人源FGF-23變體肽和實施例九制備的PEG-FGF-23變體肽各0.5 mL，分別調(diào)節(jié)修飾前后的蛋白溶液的pH值從6降低為5，4，3，2。于37°C保溫24h后收集樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，將獲得的凝膠采用凝膠掃描分析，以pH為6時的FGF-23變體肽的含量為基礎(chǔ)，計算變體肽被酸水解的情況。結(jié)果如圖4所示，表明在pH
3.0條件下，葡聚糖修飾產(chǎn)物FGF-23變體肽的含量與pH 6.0相比仍然存留42 %，而未修飾產(chǎn)物僅剩余9.1%，由此可見，經(jīng)過葡聚糖修飾后的FGF-23變體肽抗酸水解能力明顯增加。實施例二十聚乙二醇-FGF-23變體肽及葡聚糖_FGF_23變體肽對XLH小鼠血磷調(diào)節(jié)的作用分析
為了觀察修飾前后人源FGF-23變體肽對體內(nèi)腎臟部位磷含量的影響，我們選擇X連鎖佝僂病(XLH)小鼠作為動物模型，該小鼠模型是研究低磷血癥的經(jīng)典動物模型，由于FGF-23的異常升高造成了該動物模型的腎部磷代謝升高，進(jìn)而引起低磷血癥，抑制FGF-23的異?；钚允墙鉀Q這一疾病的關(guān)鍵手段，F(xiàn)GF-23變體肽能競爭性的與FGF-23相應(yīng)的FGF受體結(jié)合，從而抑制FGF-23的異常活性。本發(fā)明人比較研究修飾前后FGF-23變體肽對XLH小鼠的體內(nèi)含磷量影響，具體方法是，將24只XLH小鼠分為四組:空白對照組(給予生理鹽水)，F(xiàn)GF-23變體肽給藥組，實施例三制備的聚乙二醇-FGF-23變體肽治療組，實施例九制備的葡聚糖-FGF-23變體肽治療組，每組含6只小鼠，給藥前測定各小鼠尿液及血液含磷水平，給藥4小時后測定各小鼠尿液和血液含磷水平，給藥16小時后再測定各小鼠尿液及血液中含磷水平。結(jié)果表明，給藥4小時后，修飾前后FGF-23變體肽對尿液中含磷水平有顯著降低(圖5a);而對血液中含磷水平則有顯著提高(圖5b)，這說明FGF-23變體肽能顯著降低磷的代謝，提高體內(nèi)含磷水平，從而有效抑制FGF-23引起的體內(nèi)低磷癥狀，更重要的是，研究還發(fā)現(xiàn)，在給藥時間達(dá)16小時后，修飾的FGF-23變體肽仍然較好的保留了上述調(diào)磷效應(yīng)(圖6a)，而未修飾的FGF-23變體肽效果卻顯著下降(圖6b)，這很好的說明了 FGF-23變體肽經(jīng)過本發(fā)明提出的聚乙二醇PEG或葡聚糖修飾，穩(wěn)定性及體內(nèi)持續(xù)作用效果顯著改善，這為相關(guān)藥物的研究與開發(fā) 提供了重要的新思路和途徑。
權(quán)利要求
1.成纖維細(xì)胞生長因子-23(FGF-23)變體肽的聚乙二醇或葡聚糖的綴合物，其特征在于，所述綴合物的活性是等摩爾量的未綴合的FGF-23變體肽的活性的40%以上，優(yōu)選60%以上，更優(yōu)選70%以上，如80%以上。
2.權(quán)利要求1所述的綴合物，其中FGF-23變體肽的氨基酸序列如SEQID No:2、4或6所示，優(yōu)選為SEQ ID No:2。
3.權(quán)利要求1或2所述的綴合物，其中mPEG或葡聚糖的分子量介于2kDa_22kDa，優(yōu)選為 5kDa、lOkDa、15kDa、或 20kDa。
4.權(quán)利要求3所述的綴合物，其是由包括以下步驟的制備方法制備而得的: (1)FGF-23變體肽與馬來酰亞胺或丁醛官能團(tuán)化的PEG或葡聚糖混合，避光反應(yīng)后，終止反應(yīng)； (2)將步驟(I)中的反應(yīng)產(chǎn)物過SephedaxG_25柱除鹽,然后上樣于Resource S陽離子交換柱并用0-1.0 M NaCl的哌嗪-N，N’ - 二(2-乙磺酸)緩沖液梯度洗脫，收集洗脫峰。
5.權(quán)利要求4所述的綴合物，其中FGF-23變體肽與馬來酰亞胺或丁醛官能團(tuán)化的PEG或葡聚糖的摩爾比介于1:2-1:50，優(yōu)選為1:5、1:10,1:20、1:30。
6.制備權(quán)利要求1-5之任一所述的綴合物的方法，其包括: (1)FGF-23變體肽與馬來酰亞胺或丁醛官能團(tuán)化的PEG或葡聚糖混合，避光反應(yīng)后，終止反應(yīng)； (2)將步驟(I)中的反應(yīng)產(chǎn)物過SephedaxG_25柱除鹽,然后上樣于Resource S陽離子交換柱并用0-1.0 M NaCl的哌嗪-N，N’ - 二(2-乙磺酸)緩沖液梯度洗脫，收集洗脫峰。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中FGF-23變體肽與馬來酰亞胺或丁醛官能團(tuán)化的PEG或葡聚糖的摩爾比介于1:2-1:50，優(yōu)選為1:5、1:10,1:20、1:30。
8.藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-5之任一所述的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。
9.權(quán)利要求1-5之任一所述的綴合物在制備用于拮抗FGF-23的疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中藥物是預(yù)防或治療低磷血癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長效型成纖維細(xì)胞生長因子-23(FGF-23)變體肽的綴合物，其制備及應(yīng)用。該綴合物的活性是等摩爾量的未綴合的FGF-23變體肽的活性的40%以上，優(yōu)選60%以上，更優(yōu)選70%以上，如80%以上。
文檔編號A61K47/48GK103224557SQ20131015979
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者黃志鋒, 李校堃, 粱廣, 劉孝菊, 王會巖, 宋林濤 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院, 黃志鋒