專(zhuān)利名稱(chēng)：土木香總倍半萜內(nèi)酯在制備治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物，具體涉及從中藥旋覆花屬土木香中制備得到的土木香總倍半萜內(nèi)酯在制備治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、對(duì)稱(chēng)性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，屬于自身免疫炎性疾病。該病好發(fā)于手、腕、足等小關(guān)節(jié)，易反復(fù)發(fā)作，并呈對(duì)稱(chēng)性分布?；疾≡缙谟嘘P(guān)節(jié)紅腫熱痛和功能障礙表現(xiàn)，到達(dá)晚期時(shí)，關(guān)節(jié)可出現(xiàn)不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎縮，極易致殘。從病理改變的角度來(lái)看，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種主要累及關(guān)節(jié)滑膜 (以后可波及到關(guān)節(jié)軟骨、骨組織、關(guān)節(jié)韌帶和肌鍵)，其次為漿膜、心、肺及眼等結(jié)締組織的廣泛性炎癥性疾病。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的全身性表現(xiàn)除關(guān)節(jié)病變外，還有發(fā)熱、疲乏無(wú)力、心包炎、皮下結(jié)節(jié)、胸膜炎、動(dòng)脈炎、周?chē)窠?jīng)病變等。但是，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎至今尚無(wú)特效療法，仍處于對(duì)炎癥及后遺癥的治療階段。
旋覆花屬(Inula L.)植物是菊科(Compositae)中的一屬,全世界約有100種,分別產(chǎn)于亞洲、歐洲和非洲，以地中海地區(qū)為主。中國(guó)有20余種，本屬的多種植物常供藥用， 如土木香(I. helenium)可作為健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲(chóng)藥；大花旋覆花(I. britannica)具有消痰、下氣、軟堅(jiān)、行水等功效。倍半萜類(lèi)化合物是本屬植物的特征性成分，以桉烷型、吉馬烷型和愈創(chuàng)木烷型為主，還包括偽愈創(chuàng)木烷型、裂環(huán)桉烷型、欖烷型、蒼耳烷型和少量的無(wú)環(huán)倍半萜及倍半萜二聚體。研究表明，該屬植物中的倍半萜類(lèi)化合物具有驅(qū)蟲(chóng)殺蟲(chóng)、抗菌抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制的功效。土木香(Inula Radix)藥材是菊科旋覆花屬植物土木香 Inula helenium L.的干燥根，辛、苦、溫，具有健脾和胃、行氣止痛的功效，為2010版《中國(guó)藥典》收載。土木香藥材中含有較多的倍半萜內(nèi)酯類(lèi)成分，該類(lèi)成分具有較好的抗腫瘤活性以及抗炎活性而日漸被關(guān)注。從土木香中分離得到的倍半萜內(nèi)酯類(lèi)成分包括土木香內(nèi)酯、 異土木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、二氫木香烴內(nèi)酯、鳳毛菊內(nèi)酯等，其中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的含量較高。有文獻(xiàn)報(bào)道(李雪蓮，樸惠善，土木香的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展，中國(guó)現(xiàn)代中藥，2007，9 (6) :28-29) 土木香中的倍半萜 類(lèi)化合物具有抑制腫瘤細(xì)胞、驅(qū)蟲(chóng)、抗菌、抑制平滑肌、降血糖和利膽等作用。
有研究報(bào)道，TNF-α與IFN-Y在體外共同刺激纖維原細(xì)胞和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞可協(xié)同誘導(dǎo)趨化因子CXCLlO的產(chǎn)生，RA病人滑液中大量CXCLlO的表達(dá)導(dǎo)致活化Thl細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的浸潤(rùn)，對(duì)組織造成損傷。(I、Ueno A, Yamamura M, Iwahashi M, Okamoto A, Aita Tj Ogawa N，Makino H. The production of CXCR3_agonistic chemokines by synovial fibroblasts from patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol Int.2005 Jun;25(5):361_70 2、Bedard PA，Golds EE:Cytokine-induced expression of mRNAsfor chemotactic factors in human synovial cells and fibroblasts. J CellPhysioll993, 154:433-441)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的模型中升高的IL-15可通過(guò)誘導(dǎo)IL-17而發(fā)揮其促炎癥細(xì)胞因子的特性，IL-15可能通過(guò)環(huán)孢菌素A和類(lèi)固醇敏感的途徑，導(dǎo)致關(guān)節(jié)中的IL-17過(guò)度分泌。IL-17除了可刺激滑膜細(xì)胞釋放各種炎癥介質(zhì)外，還可通過(guò)刺激RANKL 與RANK結(jié)合，刺激骨吸收，是目前認(rèn)識(shí)到的在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨破壞病理中最重要的細(xì)胞因子之一。本發(fā)明人對(duì)土木香進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，制備了土木香總倍半萜內(nèi)酯，發(fā)現(xiàn)土木香總倍半萜內(nèi)酯及其內(nèi)酯類(lèi)成分具有較好的抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，因此，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療藥物。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究設(shè)計(jì)土木香總倍半萜內(nèi)酯及其內(nèi)酯類(lèi)化合物在制備治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了土木香總倍半萜內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述土木香總倍半萜內(nèi)酯含有土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯。土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯含量之和為60-90%
本發(fā)明所述土木香總倍半萜內(nèi)酯是通過(guò)下列方法制備得到的
土木香藥材粉碎后，在常壓提取裝置中用60 90%乙醇回流提取2-3次，每次I 3小時(shí)，合并提取液過(guò)濾濃縮得濃縮液；濃縮液加2 5倍體積的水稀釋后，加入到大孔吸附樹(shù)脂柱上，依次以10-20倍體積的去離子水洗脫大極性雜質(zhì)，再以10-20倍體積的40-65%乙醇進(jìn)行洗脫，繼以10-20倍體積的70 90%的乙醇溶液洗脫得到洗脫液， 80°C -100°C常壓干燥12-24小時(shí)，即得土木香總倍半萜內(nèi)酯原料，其中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的含量之和為60 90%。木香總倍半萜內(nèi)酯原料經(jīng)硅膠色譜分離，可制備得到土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯。本發(fā)明中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)式如下
抑 2卿
土木香內(nèi)酯異土木香內(nèi)酯
本發(fā)明采用土木香總倍半萜內(nèi)酯及其中的土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯進(jìn)行動(dòng)物藥效試驗(yàn)，結(jié)果顯示土木香總倍半萜內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯均可抑制CIA (Collagen-Induced Arthritis,膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎)的臨床發(fā)病，明顯抑制了 CIA的發(fā)病嚴(yán)重程度和發(fā)病率，說(shuō)明土木香總倍半萜內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯對(duì)CIA具有明顯的保護(hù)作用。并能下調(diào)脾細(xì)胞上清液中TNF-α (腫瘤壞死因子a)、IL_17(白介素17)、 IFN- Y (干擾素Y )，抑制促炎細(xì)胞因子TNF- a、IFN- Y和IL-17的分泌，從而對(duì)CIA疾病 具有保護(hù)作用。TNF-α和IFN-Y在RA發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。TNF-a可直接誘導(dǎo)蛋白水解酶的合成，造成基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，土木香總倍半職內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯可較大程度降低脾臟細(xì)胞分泌TNF-a。用抗TNF-a療法在治療RA上取得了良好的效果，不但阻止了骨組織破壞而且也抑制了 IL-17的產(chǎn)生。土木香總倍半萜內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯對(duì)炎癥的控制及對(duì)關(guān)節(jié)組織的保護(hù)可能與其降低TNF-a 含量有關(guān)。
另外，IFN-Y主要由浸潤(rùn)在病灶局部的⑶4+T細(xì)胞分泌，它可以激活巨噬細(xì)胞， 活化的巨噬細(xì)胞隨后表達(dá)多種炎癥因子，參與并加重炎癥反應(yīng)；IFN_Y還可誘導(dǎo)MIP-I a、 MIP-I β和IP-IO的表達(dá)，這些趨化因子參與淋巴細(xì)胞向病灶遷移的過(guò)程。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，土木香總倍半萜內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯在體內(nèi)明顯降低了 IFN-Y的水平， 有可能與阻斷了淋巴細(xì)胞的后繼遷移有關(guān)。本發(fā)明中，土木香總倍半萜內(nèi)酯及其中的土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯均可顯著抑制IL-17的生成，它們對(duì)CIA有明顯的療效，可明顯抑制 CIA臨床發(fā)病，降低炎性細(xì)胞因子TNF- a及IFN- Y的分泌，這也是其治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。因此，本發(fā)明土木香總倍半萜內(nèi)酯可用于制備治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。
其中所述的土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯也可用于制備治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。
本發(fā)明所述治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物是由土木香總倍半萜內(nèi)酯作為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。
本發(fā)明所述治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物是由土木香內(nèi)酯作為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。
本發(fā)明所述治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物是由異土木香內(nèi)酯作為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。
本發(fā)明所述藥物組合物為片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑等。
本發(fā)明提供了一種新的治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物，而且是從中藥提取物中制備的藥物，克服了現(xiàn)有治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的不足之處，療效顯著，副反應(yīng)少，原料來(lái)源方便， 制備方法簡(jiǎn)單，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。


圖I 土木香倍半萜內(nèi)酯臨床評(píng)分圖
圖中一 -模型組對(duì)照組土木香總倍半萜內(nèi)酯10mg/kg 土木香總倍半職內(nèi)酷30mg/kg -土木香內(nèi)酷5mg/kg 土木香內(nèi)酉旨15mg/kg 異土木香內(nèi)酷 5mg/kg 異土木香內(nèi)酯 15mg/kg
圖2脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子結(jié)果圖
圖中(l)TNF-a檢測(cè)結(jié)果(2) IL-17檢測(cè)結(jié)果(3) IFN-Y檢測(cè)結(jié)果；O空白組· 模型組_甲氨喋呤組H 土木香總倍半職內(nèi)酯10mg/kg Θ土木香總倍半職內(nèi)酯30mg/kg EI 土木香內(nèi)酯5mg/kg ；國(guó)土木香內(nèi)酯15mg/kg H異土木香內(nèi)酯5mg/kg 0異土木香內(nèi)酯 15mg/kg具體實(shí)施方式
實(shí)施例I 土木香總倍半萜 內(nèi)酯及土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的制備
(I) 土木香藥材(市售得到，產(chǎn)地河北安國(guó))IOkg粉碎后，在加熱回流提取罐中用 80L60%乙醇回流提取二次(每次80L)，每次I小時(shí)，合并提取液，85°C _90°C減壓濃縮到8L，相當(dāng)于每ML含O. 8g藥材，加入16L水稀釋后加入到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，以100L的去離子水洗脫糖類(lèi)，再以100L40%乙醇進(jìn)行洗脫，再以100L70%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集該部分， 85°C常壓干燥20小時(shí)，得到土木香總倍半萜內(nèi)酯265g，經(jīng)HPLC法，以Agilent Zorbax C18 柱(4. 6*250mm,5y)進(jìn)行分析，流動(dòng)相為乙腈-O. 05%甲酸溶液(55:45)，檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm 測(cè)定其中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的含量之和為75. 3%。
取(I)所得土木香總倍半萜內(nèi)酯原料20g，應(yīng)用硅膠柱色譜，以體積比為100 0 2 1的二氯甲烷/甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，薄層色譜檢測(cè)，分別收集含有土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的流分，經(jīng)液相色譜制備(流動(dòng)相甲醇水(70 :30),檢測(cè)波長(zhǎng)203nm, Agilent Zorbax C18制備色譜柱(9. 6*150mm, 5 μ )),流速為2ml/min,分別得土木香內(nèi)酯4. 5g和異土木香內(nèi)酯 6. 3g。
實(shí)施例2動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)
一、實(shí)驗(yàn)材料
藥物與試劑
雞II 型膠原(C II ) =Chondrex, Redmond, WA98052, USA ;不完全弗氏完全佐劑 (IFA) Difco Laboratories, Detroit,MI ;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配制:在 800ml 蒸懼水中溶解8gNaCl，0. 2g KCl，1.44g Na2HPOjP O. 24g KH2PO4。用鹽酸調(diào) PH至 7. 4，加水定容至 1L， 過(guò)濾除菌后使用；DMS0 二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMS0):為sigma公司產(chǎn)品；1640 培養(yǎng)基吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；小牛血清民海生物有限公司；96孔平底板，CORNING 公司;70 μ m細(xì)胞研磨濾網(wǎng),BD Falcon公司；15ml、50ml離心管,BDFalcon公司；0. 22ym濾器，Millipore公司；lml旋口注射器，BD公司；貝朗三通，德國(guó)貝朗公司；甲氨喋呤片上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠(080605)；
土木香總倍半萜內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯由實(shí)施例I制備得到。
動(dòng)物
DBI/I型小鼠，雄性，6-8周，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)SCXK (滬)2007-0005，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境中。
儀器與設(shè)備
高速臺(tái)式離心機(jī)，Eppendorf ;高速臺(tái)式低溫離心機(jī)，HITACHI公司；倒置顯微鏡， Nikon公司；超凈臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司制造；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥 箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；濕度CO2培養(yǎng)箱，Heraus公司；恒溫水浴鍋，上海國(guó)華電器有限公司。
二、實(shí)驗(yàn)方法
模型的建立
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
完全弗氏佐劑(CFA)的制備在不完全弗氏佐劑中加入熱滅活的結(jié)核分支桿菌至終濃度4mg/ml，使用之前充分混勻。
0. OlM冰乙酸制備11. 43 μ I冰乙酸溶于20ml去離子水中，過(guò)濾，4°C備用。
C II制備將C II溶解于0. OlM冰乙酸至終濃度4mg/ml，4°C保存。
抗原的乳化用三通管連接兩支玻璃針管，將PBS、完全弗氏佐劑和抗原C II分別加入一支針管中(每100 μ I乳化液含200 μ g C II和50 μ I完全弗氏佐劑)，排除針管內(nèi)氣泡后，來(lái)回推動(dòng)針管約500次，將針管內(nèi)各成分充分混勻成乳化狀態(tài)。
CIA模型的誘導(dǎo)
第O天，小鼠尾根部2-3厘米處給予100 μ I/只乳化好的C II抗原皮下注射免疫； 第21天，加強(qiáng)免疫50μ I C II和150 μ I PBS充分混勻，150ul/只腹腔注射；正常組用生理鹽水同法注射。
三、實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案
大鼠隨機(jī)分為9組，每組12只，分別為正常組、CIA模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(甲氨喋呤 2mg/kg)、土木香總倍半職內(nèi)酯組分為低、高劑量組(給藥劑量分別為10mg/kg、30mg/kg)、土木香內(nèi)酯分、高劑量組(給藥劑量分別為5mg/kg、15mg/kg)、異土木香內(nèi)酯分低、高劑量組 (給藥劑量分別為5mg/kg、15mg/kg),共計(jì)9組。于二次免疫前一天(第20天)至第34天土木香總倍半萜內(nèi)酯組、土木香內(nèi)酯組、異土木香內(nèi)酯組分別按照上述劑量連續(xù)灌胃給藥，甲氨喋呤組每?jī)商彀?mg/kg給藥,正常組和模型組按10ml/kg給予飲用水。
I、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, Al)評(píng)分
二次免疫后，定期記錄小鼠全身關(guān)節(jié)病變情況，按3級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，計(jì)算發(fā)病率及平均發(fā)病指數(shù)。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0分-關(guān)節(jié)正常；1分-關(guān)節(jié)輕微紅腫；2分-關(guān)節(jié)紅腫嚴(yán)重，累及整個(gè)關(guān)節(jié)，活動(dòng)受限；3分-爪子或關(guān)節(jié)功能障礙，關(guān)節(jié)僵硬。四肢的總和為小鼠的評(píng)分，最高為12分。
2、淋巴及脾臟單個(gè)核細(xì)胞(MNC)懸液的制備
小鼠處死，固定，剪開(kāi)腹部皮膚，取兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)；后打開(kāi)腹腔，取出脾臟，立即放入裝有1640的15ml離心管中，置于冰上；將脾臟倒入70 μ m的細(xì)胞研磨濾網(wǎng)中,用Iml 注射器針芯充分研磨，使之成細(xì)胞懸液；收集細(xì)胞懸液，4°C，lOOOrpm，離心8min，離心后棄去上清；打散細(xì)胞，加入O. 83%氯化銨水(約I. Oml/脾臟)，裂解5min ;加入3倍體積的PBS 終止裂解反應(yīng)，并用玻璃吸管去除細(xì)胞懸液中的絮狀物；4°C，1000rpm，離心8min，離心后棄去上清；打散細(xì)胞，加入lmll640(含小牛血清)，混勻后計(jì)數(shù)，以1640完全培養(yǎng)基(含小牛血清)在96孔板中培養(yǎng)，5 X 106/ml每孔lOOul，貼壁2小時(shí)。
3、脾細(xì)胞NO測(cè)定
在96孔平圓底板中每孔加入5 X 106/ml脾臟MNClOOul，每組4復(fù)孔；貼壁2小時(shí)后，換液DMEM培養(yǎng)基，每孔加LPS (終濃度lug/ml )，將細(xì)胞置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)后取出上清液檢測(cè)NO。
4、脾、淋巴細(xì)胞增值測(cè)定
在96孔平圓底板中分別加入5X 107ml脾臟及淋巴MNClOOul，每組4復(fù)孔；貼壁 2小時(shí)后，加C II (100ug/ml)，將細(xì)胞置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72小時(shí)后取出加MTS測(cè)增值。
5、脾細(xì)胞細(xì)胞因子測(cè)定
在96孔平圓底板中加入5 X 106/ml脾臟MNClOOul，每組4復(fù)孔；貼壁2小時(shí)后，力口 C II (100ug/ml)，將細(xì)胞置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后取上清液檢測(cè)細(xì)胞因子。
四、結(jié)果
I、土木香倍半職內(nèi)酯可抑制CIA的臨床發(fā)病
在此CIA的實(shí)驗(yàn)中，用C II誘導(dǎo)CIA模型，初次免疫為第O天，第21天加強(qiáng)免疫后小鼠隨機(jī)分為9組。于第20天開(kāi)始給，陽(yáng)性對(duì)照組每?jī)商旖o予甲氨喋呤藥2mg/kg，土木香總倍半職內(nèi)酯低劑量組給予10mg/kg,高劑量組30mg/kg ;土木香內(nèi)酯低劑量組給予5mg/kg,高劑量組15mg/kg,異土木香內(nèi)酯低劑量組給予5mg/kg,高劑量組15mg/kg,連續(xù)給藥14天，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每天觀察小鼠并依據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)給每只小鼠評(píng)分。C II誘導(dǎo)CIA，加強(qiáng)免疫后小鼠陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病，對(duì)照組與用藥組在發(fā)病時(shí)間上沒(méi)有明顯差異。發(fā)病后，模型組小鼠疾病嚴(yán)重程度加重較快，在免疫后第37天達(dá)到高峰，而給藥組小鼠發(fā)病后疾病發(fā)展較對(duì)照組小鼠緩和(圖1)。從發(fā)病率來(lái)看，模型組為90%，對(duì)照組為71%，土木香總倍半萜內(nèi)酯低、高劑量分別為59%、74% ;土木香內(nèi)酯低、高劑量組分別為51%、65% ;異土木香內(nèi)酯低、高劑量組分別為48%、61%。由此可見(jiàn)，土木香倍半萜內(nèi)酯對(duì)CIA發(fā)病時(shí)間沒(méi)有明顯影響，但明顯抑制了 CIA的發(fā)病嚴(yán)重程度和發(fā)病率，說(shuō)明土木香倍半萜內(nèi)酯對(duì)CIA具有明顯的保護(hù)作用。2、土木香倍半萜內(nèi)酯能下調(diào)脾細(xì)胞上清液中TNF-a、IL_17、IFN-Y在體內(nèi)給予藥物治療CIA的實(shí)驗(yàn)中，疾病達(dá)到平臺(tái)期后處死小鼠，取出脾臟細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，每孔1.5 X IO6個(gè)細(xì)胞鋪板，在體外用20 μ g/ml的抗原C II刺激，培養(yǎng)48小時(shí)后收集上清，用ELISA方法測(cè)量細(xì)胞因子TNF-a、IFN-Y的濃度。如圖2所示，C II刺激后，模型組細(xì)胞上清中TNF-α ,IFN-Y及IL-17均高于各個(gè)藥物處理組，與陽(yáng)性對(duì)照組及土木香倍半萜內(nèi)酯各給藥組相比，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0.05)。說(shuō)明體內(nèi)給予藥物治療后，能夠抑制促炎細(xì)胞因子TNF- a ,IFN- Y和IL-17的分泌，并能從而對(duì)CIA疾病具有保護(hù)作用。實(shí)施例3片劑:土木香總倍半職內(nèi)酯 30g乳糖190g玉米淀粉75g硬脂酸鎂5g制備方法:將土木香總倍半萜內(nèi)酯、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤(rùn)，把濕潤(rùn)后的混合物過(guò)篩并干燥，再過(guò)篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重300mg，含土木香總倍半職內(nèi)酯原料為30mg。實(shí)施例4:軟膠囊:囊心處方
土
權(quán)利要求
1.土木香總倍半萜內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述土木香總倍半萜內(nèi)酯含有土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯；所述土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯含量之和為60-90% ;所述土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)式如下
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述土木香總倍半萜內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述土木香總倍半萜內(nèi)酯通過(guò)下列方法制得土木香藥材粉碎后，在常壓提取裝置中用60 90%乙醇回流提取2-3次，每次I 3 小時(shí)，合并提取液過(guò)濾濃縮得濃縮液；濃縮液加2 5倍體積的水稀釋后，加入到大孔吸附樹(shù)脂柱上，依次以10-20倍體積的去離子水洗脫大極性雜質(zhì)，再以10-20倍體積的.40 65% 乙醇進(jìn)行洗脫，繼以10-20倍體積的70 90%的乙醇溶液洗脫得到洗脫液，80°C _100°C常壓干燥12-24小時(shí)，即得土木香總倍半萜內(nèi)酯；所述土木香總倍半萜內(nèi)酯再經(jīng)硅膠色譜分離，可制備得到土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述土木香總倍半萜內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物是由土木香總倍半萜內(nèi)酯作為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。
4.土木香內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述土木香內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物是由土木香內(nèi)酯作為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。
6.異土木香內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述異土木香內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物是由異土木香內(nèi)酯作為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3、5或7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物為片劑、分散片、含片、口崩片、緩釋片、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了土木香總倍半萜內(nèi)酯在制備防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，所述土木香總倍半萜內(nèi)酯含有土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯，兩酯的含量之和為60-90%。本發(fā)明進(jìn)行動(dòng)物藥效試驗(yàn)，結(jié)果顯示均可抑制CIA(膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎)的臨床發(fā)病，明顯抑制了CIA的發(fā)病率，明顯降低IFN-γ的水平，顯著抑制IL-17的生成。因此，土木香總倍半萜內(nèi)酯及其中的土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯均可用于制備治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。本發(fā)明所述藥物是由土木香總倍半萜內(nèi)酯作為活性成分與藥用輔料組成的片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑等。本發(fā)明提供了新的治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物，療效顯著，副反應(yīng)少，原料來(lái)源方便，制備方法簡(jiǎn)單，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P29/00GK103251667SQ201310164839
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月7日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 蘇娟, 單磊, 李慧梁, 沈云享, 葉霽, 林珊, 曹邦靜, 張淑琴 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)