專利名稱：落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)產(chǎn)品輻射加工方法，也涉及一種農(nóng)副產(chǎn)物加工方法，具體的，涉及一種落花生莖葉中生物堿的提取、分離和純化的方法。
背景技術(shù)：
落花生莖葉為豆科植物落花生屬落花生(ArachishypogaeaL.)的莖葉,落花生莖葉莖高30 70厘米，匍匐或直立；雙數(shù)羽狀復(fù)葉互生，長(zhǎng)圓形至倒卵圓形，長(zhǎng)2.5 5.5厘米，寬1.4 3厘米。一直以來，花生莖葉被丟棄或曬干焚燒，較少深加工和利用，造成相當(dāng)嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境負(fù)擔(dān)。2011年中國(guó)花生播種面積為470萬公頃，總產(chǎn)量約為1620萬噸。大面積的花生種植為我們提供優(yōu)質(zhì)花生產(chǎn)品的同時(shí)，也亟需我們?yōu)榛ㄉo葉等秸桿農(nóng)副產(chǎn)物找到高值轉(zhuǎn)化的出口。多項(xiàng)研究表明落花生莖葉具有寧神降壓、促進(jìn)睡眠的功效，是具有高值轉(zhuǎn)化潛力的農(nóng)副產(chǎn)品。在落花生莖葉有效物質(zhì)提取技術(shù)方面，我們傳統(tǒng)用的浸潰法、滲漉法、煎煮法、熱回流提取法等，對(duì)植物的天然活性成分破壞很大。超聲波提取法似乎是目前較常用的有效提取方法，但本發(fā)明的研究結(jié)果顯示，運(yùn)用6tlCo-Y輻照源低劑量常溫輻照與溶劑萃取相結(jié)合的方法，更容易促進(jìn)有效物質(zhì)溶出，提高有效物質(zhì)得率。輻照技術(shù)在產(chǎn)品保鮮加工、滅菌，高分子材料降解等多個(gè)領(lǐng)域得到研究和發(fā)展，其原理是高能射線作用于物質(zhì)時(shí)，能夠打斷分子間的連接鍵，從而使物質(zhì)發(fā)生降解。本發(fā)明使用低劑量6tlCo-Y輻照源常溫輻射，可促進(jìn)花生莖葉溶液中功能物質(zhì)的溶出，但不進(jìn)行分子間連接鍵的打斷，其總生物堿得率均高于超聲波提取法，為我們的分離純化提供了基礎(chǔ)和保障。本發(fā)明以落花生莖葉為研究對(duì)象，通過用6tlCo-Y輻照源低劑量常溫輻照與溶劑萃取相結(jié)合的方法促進(jìn)花生莖葉功能成分的溶出，選擇性地提取目標(biāo)化合物，并通過層析系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，最終獲得花生莖葉生物堿。本發(fā)明研究了 6tlCo-Y輻照源低劑量常溫輻照技術(shù)和溶劑提取 的方法相結(jié)合提取功能物質(zhì)的可行性，為落花生莖葉中總生物堿的提取、分離和純化提供了新穎高效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種落花生莖葉中總生物堿的提取、分離和純化的方法。與其它的方法相比，本方法最主要的特點(diǎn)是采用6tlCo-Y輻照源低劑量常溫輻照與溶劑萃取相結(jié)合的方法進(jìn)行提取，操作簡(jiǎn)單、不破壞功能成分、生物堿損失小。本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，采用6tlCo-Y輻照源常溫輻照提取并且采用大孔樹脂純化。具體的，包括以下步驟:(I)原料預(yù)處理:新鮮落花生莖葉采摘后，陰干、粉碎、過篩(優(yōu)選40目)，得落花生莖葉粉末，備用；
(2)輻照提取:落花生莖葉粉末和氯仿混合，裝袋封口，6tlCo-Y輻照源常溫輻照；(3)酸堿分離:輻照后的溶液用0.5mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值，萃取，分離氯仿層；水相用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH為10.5，氯仿再次萃取，合并兩次萃取氯仿層，蒸干氯仿后，用60%-80% (v/v)甲醇或60%-95% (v/v)的乙醇溶解并定容，得到含生物堿的醇溶液；(4)大孔樹脂純化:將含生物堿的醇溶液定量取出并減壓蒸干后，殘留物用0.5mol/L的HCl溶解后，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，將溶液移入裝有大孔樹脂的層析柱，分別采用IOOmL不同pH、不同濃度的醇溶液梯度洗脫，洗脫液進(jìn)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，合并目標(biāo)生物堿；(5)干燥:采用冷凍干燥；(6)粉碎后真空包裝。優(yōu)選的，所述的步驟(I)中，控制陰干的落花生莖葉含水8-25%;陰干的落花生莖葉中，碳水化合物10-30%，蛋白質(zhì)8-20%。優(yōu)選的，所述的步驟(2)中，落花生莖葉粉末和氯仿按1:20-60 (w/v)混合；輻照吸收劑量為l_20kGy (優(yōu)選5kGy)。優(yōu)選的，所述的步驟(3 )中，優(yōu)選使用60%甲醇(v/v )或者70%乙醇(v/v )溶解并
定容。 優(yōu)選的，所述的步驟(4)中，大孔樹脂選自HPD100、D-10U AB-8、HPD722、NKA-9、HPD600 ;進(jìn)一步優(yōu)選為AB-8。優(yōu)選的，所述的步驟(4)中，分別采用100mlpH2.7_pH7.0不同pH、20%_60%不同濃度(v/v)的醇溶液梯度洗脫。優(yōu)選的，所述的步驟(5)中，冷凍干燥22h。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的落花生莖葉生物堿的制備方法，將6tlCo-Y輻照源低劑量輻照與溶劑萃取相結(jié)合，常溫提取、操作簡(jiǎn)單、生物堿損失小。采用本發(fā)明所述的方法制備的落花生莖葉生物堿，純度高、生產(chǎn)時(shí)間短、成本低、易于推廣。


圖1輻照劑量對(duì)生物堿提取效果的影響圖2不同濃度甲醇分離液對(duì)生物堿紫外吸收峰的影響圖3不同濃度乙醇分離液對(duì)生物堿紫外吸收峰的影響圖4大孔樹脂的種類對(duì)生物堿靜態(tài)吸附率的影響圖5落花生莖葉生物堿的洗脫峰值圖
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容和效果。實(shí)施例1輻照劑量對(duì)生物堿提取效果的影響供試溶液的制備:稱取2.0Og落花生莖葉粉末置于包裝袋中，加入三氯甲烷80ml，封口，60Co- Y常溫輻照劑量l_18kGy (對(duì)照組超聲波法是25。C超聲提取2小時(shí))，然后抽濾，上清液用三氯甲烷定容至100ml，取Iml于25ml容量瓶中，用三氯甲烷定容，備用。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的測(cè)定:精密稱取20mg鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，加少量水超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加水定容至刻度，取Iml置于IOml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得0.04mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5,2.0,2.5ml，加三氯甲燒至5ml,加入溴甲酹綠緩沖液和0.2mol/LNa0H溶液各Iml,振搖Imin,靜置30min,取澄清的三氯甲烷液在415nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=17.834x+0.0006, R2=0.9999。取待測(cè)液1.0ml，加三氯甲烷至5ml，加溴甲酹綠緩沖液和0.2mol/mlNa0H溶液各Iml,振搖Imin,靜置30min,取澄清的三氯甲燒液，以空白做參比，415nm處測(cè)其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度?？偵飰A含量可以由公式:總生物堿(％)=(cXbXv) X 100%/m(公式 I)計(jì)算。C-根據(jù)標(biāo)曲得到的生物堿濃度(mg/ml) ;b_稀釋倍數(shù)；v_待測(cè)液總體積；m-樣品質(zhì)量。結(jié)果見表I。表I不同提取方式及輻照劑量下獲得的總生物堿含量
權(quán)利要求
1.一種落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，其特征在于，采用6tlCo-Y輻照源常溫輻照提取并且采用大孔樹脂純化。
2.如權(quán)利要求1所述的落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)原料預(yù)處理:新鮮落花生莖葉采摘后，陰干、粉碎、過篩(優(yōu)選40目)，得落花生莖葉粉末，備用； (2)輻照提取:落花生莖葉粉末和氯仿混合，裝袋封口，6tlCo-Y輻照源常溫輻照； (3)酸堿分離:輻照后的溶液用0.5mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值，萃取，分離氯仿層；水相用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH為10.5,氯仿再次萃取,合并兩次萃取氯仿層,蒸干氯仿后,用60%_80%(v/v)甲醇或60%-95% (v/v)的乙醇溶解并定容，得到含生物堿的醇溶液； (4)大孔樹脂純 化:將含生物堿的醇溶液定量取出并減壓蒸干后，殘留物用0.5mol/L的HCl溶解后，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，將溶液移入裝有大孔樹脂的層析柱，分別采用IOOmL不同pH、不同濃度的醇溶液梯度洗脫，洗脫液進(jìn)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，合并目標(biāo)生物堿； (5)干燥:采用冷凍干燥； (6)粉碎后真空包裝。
3.如權(quán)利要求2所述的落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，其特征在于，所述的步驟(I)中，控制陰干的落花生莖葉含水8-25%;陰干的落花生莖葉中，碳水化合物10-30%，蛋白質(zhì) 8-20%。
4.如權(quán)利要求2所述的落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，落花生莖葉粉末和氯仿按l:20-60(w/v)混合；輻照吸收劑量為l_20kGy(優(yōu)選 5kGy)0
5.如權(quán)利要求2所述的落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中,優(yōu)選使用60%甲醇(v/v)或者70%乙醇(v/v)溶解并定容。
6.如權(quán)利要求2所述的落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，大孔樹脂選自 HPD100、D-101、AB-8、HPD722、NKA-9、HPD600 (優(yōu)選 AB-8)。
7.如權(quán)利要求2所述的落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，分別采用100mlpH2.7_pH7.0不同pH、20%_60%不同濃度(v/v)的醇溶液梯度洗脫。
8.如權(quán)利要求2所述的落花生莖葉中生物堿的提取分離和純化的方法，其特征在于，所述的步驟(5)中，冷凍干燥22h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種落花生莖葉生物堿的提取分離純化工藝，其工藝包括，落花生莖葉的收割、陰干、粉碎；落花生莖葉粉末與氯仿按1:20-60混合；然后進(jìn)行60Co-γ輻照源常溫輻照，劑量為1-20kGy；調(diào)酸堿進(jìn)行萃取后，用甲醇溶解；不同極性大孔樹脂吸附、用20%-60%甲醇(pH2.7-7.0)進(jìn)行梯度洗脫，所得目標(biāo)生物堿合并；產(chǎn)品冷凍干燥后真空包裝。與其他提取純化方法相比，本發(fā)明的制備工藝，主要采用60Co-γ輻照與溶劑萃取相結(jié)合的方法進(jìn)行提取，操作簡(jiǎn)單、生物堿損失小。采用本發(fā)明所述的方法制備落花生莖葉生物堿，得率高、成本低、易于推廣。
文檔編號(hào)A61K36/48GK103211857SQ20131016745
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者鉏曉艷, 程薇, 熊光權(quán), 李新, 廖濤, 耿勝榮, 夏和舟 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所