專(zhuān)利名稱(chēng)：一種體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，特別涉及一種采用三維微重力生物反應(yīng)器體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法。
背景技術(shù)：
世界上每年由于車(chē)禍、銳器、槍彈等外傷而造成周?chē)窠?jīng)擠壓、牽拉、挫裂損傷的病例很多，對(duì)于短距離的周?chē)窠?jīng)缺損，可以利用神經(jīng)自身的彈性和曲度，進(jìn)行無(wú)張力的斷端一期縫合來(lái)修補(bǔ)缺損。當(dāng)缺損超過(guò)一定距離，無(wú)法進(jìn)行無(wú)張力縫合時(shí)，必須進(jìn)行神經(jīng)移植。目前臨床上最常用的是自體神經(jīng)移植，并且作為周?chē)窠?jīng)修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是自體神經(jīng)來(lái)源有限，移植的神經(jīng)與原有神經(jīng)在形態(tài)及功能上有所差別，而且勢(shì)必會(huì)造成供區(qū)的失神經(jīng)支配。同種異體神經(jīng)或異種神經(jīng)移植更是受到免疫排斥反應(yīng)的限制，難以在臨床上廣泛開(kāi)展應(yīng)用。八十年代末，組織工程概念的提出及飛速發(fā)展給神經(jīng)替代物的構(gòu)建開(kāi)辟了新的方向。組織工程的核心就是建立細(xì)胞與生物材料的三維空間復(fù)合體，即具有生命力的活體組織，用以對(duì)病損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代。運(yùn)用帶有種子細(xì)胞的組織工程化神經(jīng)來(lái)修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。過(guò)去的方法均是將各類(lèi)神經(jīng)支架材料先移植入動(dòng)物體內(nèi)，再向其內(nèi)注入種子細(xì)胞，但是直接注射法存在種子細(xì)胞流失、細(xì)胞狀態(tài)未知等諸多不穩(wěn)定因素，很難標(biāo)準(zhǔn)化。因此，如何獲取促再生能力強(qiáng)，構(gòu)建條件標(biāo)準(zhǔn)化的組織工程神經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。通過(guò)組織工程技術(shù)在體外制備生物活性良好的組織工程神經(jīng)并廣泛應(yīng)用于臨床需要解決一系列技術(shù)和工藝問(wèn)題，包括:種子細(xì)胞如何高效均勻接種于支架材料上、大體積組織工程神經(jīng)中心供養(yǎng)、組織工程神經(jīng)的最佳體外培養(yǎng)時(shí)間和方式等。因此，生物反應(yīng)器的合理應(yīng)用有望解決上述產(chǎn)業(yè)化問(wèn)題，其中三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)具有剪切力小、傳質(zhì)作用好等優(yōu)點(diǎn)，繞水平軸旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器在一定轉(zhuǎn)速下具備模擬微重力環(huán)境的特性。由于模擬微重力環(huán)境可使細(xì)胞、組織培養(yǎng)擺脫重力的影響，實(shí)現(xiàn)更接近體內(nèi)生存環(huán)境的三維培養(yǎng)，可能更有利于種子細(xì)胞體外增殖，細(xì)胞間的物質(zhì)交換、提高種子細(xì)胞密度、促進(jìn)種子細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)。研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞與去細(xì)胞基質(zhì)在模擬微重力環(huán)境下實(shí)驗(yàn)表皮樣組織重建。胎鼠肝細(xì)胞通過(guò)應(yīng)用生物反應(yīng)器促進(jìn)肝組織以及血管的發(fā)育。同時(shí)采用該方法培養(yǎng)的組織工程骨具有較傳統(tǒng)靜置培養(yǎng)法和即刻構(gòu)建法獲得的組織工程骨具有更好的成骨活性?？萍嘉墨I(xiàn)《運(yùn)用組織工程學(xué)原理構(gòu)建間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系》(付文玉，路艷蒙，喬?hào)|訪等，濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003年第25卷第3期，169-172)將人間充質(zhì)干細(xì)胞與和人發(fā)角蛋白模擬微重力條件下培養(yǎng)，結(jié)果表明模擬微重力條件有利于人間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系的構(gòu)建。科技文獻(xiàn)《運(yùn)用組織工程學(xué)原理構(gòu)建許旺細(xì)胞三維培養(yǎng)體系》(黎志明，朱家愷，程鋼等，中華顯微外科雜志2001年2月第24卷第I期，33-35)對(duì)聚羥基乙酸細(xì)絲支架進(jìn)行化學(xué)改性處理后再以層粘連蛋白進(jìn)行生物學(xué)修 飾，模擬微重力條件下把原代許旺細(xì)胞懸液接種在支架材料上，觀察許旺細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明模擬微重力環(huán)境有利于構(gòu)建許旺細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系。
目前微重力的作用機(jī)制尚未闡明，不同種類(lèi)細(xì)胞對(duì)微重力的反應(yīng)可能截然不同，且目前也沒(méi)有文獻(xiàn)對(duì)不同種類(lèi)細(xì)胞在微重力下對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的支架貼附情況進(jìn)行研究，因而開(kāi)展不同種類(lèi)細(xì)胞以及復(fù)雜結(jié)構(gòu)支架的微重力三維培養(yǎng)的研究制備組織工程化神經(jīng)，對(duì)臨床神經(jīng)缺損的修復(fù)具有指導(dǎo)性的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種體外構(gòu)建組織工程神經(jīng)的方法。特別是利用三維微重力生物反應(yīng)器將種子細(xì)胞培養(yǎng)于支架材料上。本發(fā)明具體技術(shù)方案為:
一種體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，采用三維微重力生物反應(yīng)器，將種子細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管在三維微重力環(huán)境下的培養(yǎng)，其特征在于培養(yǎng)條件為:將種子細(xì)胞懸液與神經(jīng)導(dǎo)管放入注滿完全培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器，細(xì)胞最終密度為IX 106/ml，旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器放入370C CO2培養(yǎng)箱中，前24小時(shí)轉(zhuǎn)速為lOrpm，使細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管充分接觸，貼附；24小時(shí)后逐步提高三維微重力生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)速度，使神經(jīng)導(dǎo)管懸浮于培養(yǎng)液中；培養(yǎng)7-14天后終止培養(yǎng)，即得到組織工程化神經(jīng)。由于神經(jīng)導(dǎo)管的規(guī)格(材質(zhì)、長(zhǎng)度、內(nèi)徑等)不同，使其懸浮于培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)速也有所不同，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，貼附與神經(jīng)導(dǎo)管上的細(xì)胞的數(shù)量也在不斷增加，因此需要靈活調(diào)整三維微重力生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)速度，逐步提高轉(zhuǎn)速使得神經(jīng)導(dǎo)管懸浮于培養(yǎng)液中。一般而言，轉(zhuǎn)速范圍為18-25rpm。本發(fā)明所述種子細(xì)胞優(yōu)選皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的雪旺氏細(xì)胞。本發(fā)明所述神經(jīng)導(dǎo)管由絲素蛋白、殼聚糖、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、膠原、聚乳酸、明膠中的一種或幾種制成。神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部還可以含有纖維，所述纖維由絲素蛋白、殼聚糖、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、 膠原、聚乳酸、明膠中的一種或幾種制成。優(yōu)選神經(jīng)導(dǎo)管是表面多孔的殼聚糖導(dǎo)管，導(dǎo)管內(nèi)部含有聚乳酸-羥基乙酸共聚物纖維或蠶絲絲素纖維。本發(fā)明所述所述神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)外表面還可以包被有層粘連蛋白和/或多聚賴(lài)氨酸。本發(fā)明所述的方法具體包括如下步驟:
(1)種子細(xì)胞的制備
方法參照文獻(xiàn) NATURE PROTOCOLS, 2006(1):2803-2812,簡(jiǎn)述如下:取新生 SpragueDawley大鼠皮膚組織，得到皮膚前體細(xì)胞球，傳代純化培養(yǎng)，將獲得的皮膚前體細(xì)胞球機(jī)械分離，貼壁并誘導(dǎo)分化為雪旺氏細(xì)胞，將雪旺氏細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)，凍存?zhèn)溆谩?br> (2)神經(jīng)導(dǎo)管的制備
神經(jīng)導(dǎo)管可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的組織工程神經(jīng)移植物，優(yōu)選表面多孔的殼聚糖導(dǎo)管，如50-90%、孔徑50-300 μ m的具有多孔結(jié)構(gòu)、抗拉強(qiáng)度高的神經(jīng)導(dǎo)管，管狀本體內(nèi)徑為0.5-8mm，壁厚0.l_3mm。具體可參照專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮镃N201110324474.8，名為“組織工程神經(jīng)移植物及其用途”中所述的方法制得?；蛘邇?yōu)選納米纖維蠶絲絲素蛋白導(dǎo)管，具體可參照專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910034583.9，公開(kāi)號(hào)為CN101664346，名為“靜電紡絲制備的人工神經(jīng)移植物及其制備方法和專(zhuān)用裝置”中所述的方法制得?；蛘邇?yōu)選使用表面多孔的殼聚糖導(dǎo)管外殼或納米纖維蠶絲絲素蛋白導(dǎo)管外殼，導(dǎo)管內(nèi)部充填入絲素蛋白纖維的復(fù)合型神經(jīng)導(dǎo)管，絲素蛋白纖維的制備可參照專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910034583.9，公開(kāi)號(hào)為CN101664346，名為“靜電紡絲制備的人工神經(jīng)移植物及其制備方法和專(zhuān)用裝置”中所述的方法制得，或者可使用市售聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)纖維(南通華利康醫(yī)療器械有限公司，N405)。纖維的數(shù)量根據(jù)導(dǎo)管的內(nèi)徑不同而有所不同，通常按照每毫米內(nèi)徑200根的比例放置。
上述神經(jīng)導(dǎo)管用層粘連蛋白(0.02mg/ml)及多聚賴(lài)氨酸(0.2mg/ml)混合液包被過(guò)夜備用。(3)種子細(xì)胞與支架材料在三維微重力環(huán)境下的培養(yǎng)
將步驟(I)制備的種子細(xì)胞懸液與步驟(2)制備的神經(jīng)導(dǎo)管放入注滿完全培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器，細(xì)胞最終密度為lX106/ml，三維微重力生物反應(yīng)器放入37°C CO2培養(yǎng)箱中，前24小時(shí)轉(zhuǎn)速為10轉(zhuǎn)/分鐘，使細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管充分接觸，貼附。24小時(shí)后逐步提高三維微重力生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)速度，使神經(jīng)導(dǎo)管能懸浮到培養(yǎng)液中。培養(yǎng)期間每三天換液，更換500ml儲(chǔ)液瓶。培養(yǎng)7-14天后終止培養(yǎng)，即得到組織工程化神經(jīng)。所述的實(shí)驗(yàn)操作均在無(wú)菌條件下完成。所述種子細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外擴(kuò)增均采用相應(yīng)領(lǐng)域公認(rèn)的方法。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明采用復(fù)雜結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)采用的聚羥基乙酸(PGA)細(xì)絲或人發(fā)角蛋白而言，導(dǎo)管結(jié)構(gòu)更有利于周?chē)窠?jīng)的再生，且表面積更大，可以貼附更多的種子細(xì)胞；
2.現(xiàn)有技術(shù)中多采用雪旺氏細(xì) 胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，由于雪旺氏細(xì)胞體外培養(yǎng)很難達(dá)到實(shí)際移植所需的數(shù)量，且雪旺氏細(xì)胞傳代后形態(tài)和功能也逐漸改變，科技文獻(xiàn)《運(yùn)用組織工程學(xué)原理構(gòu)建許旺細(xì)胞三維培養(yǎng)體系》(黎志明，朱家愷，程鋼等，中華顯微外科雜志2001年2月第24卷第I期，33-35)中公開(kāi)的103/ml的細(xì)胞密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足真正意義上神經(jīng)組織工程的需要。而通過(guò)基因修飾所得到的雪旺氏細(xì)胞永生株，其分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的能力顯著下降。此外，雪旺氏細(xì)胞自體移植常面臨二次損傷，異體移植面臨免疫排斥反應(yīng)，其臨床前景堪憂。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從發(fā)育生物學(xué)的角度講是來(lái)自于中胚層的細(xì)胞，而雪旺氏細(xì)胞是來(lái)自外胚層的細(xì)胞分化而來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為雪旺氏細(xì)胞屬于跨胚層分化，目前仍存爭(zhēng)議。本發(fā)明所采用的皮膚源性前體細(xì)胞(SKPs)為近年發(fā)現(xiàn)的存在于皮膚基底層和毛囊隆突部的一種與神經(jīng)同起源于外胚層的多潛能細(xì)胞。皮膚源性前體細(xì)胞具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所有優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)它是外胚層來(lái)源的細(xì)胞，避免了跨胚層分化的問(wèn)題，皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的雪旺氏細(xì)胞更接近真正的雪旺氏細(xì)胞，更適合作為神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞。由于不同種類(lèi)細(xì)胞對(duì)微重力的反應(yīng)不經(jīng)相同，在培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)若采用現(xiàn)有技術(shù)中的轉(zhuǎn)速，會(huì)導(dǎo)致貼附在神經(jīng)導(dǎo)管上的細(xì)胞大量凋亡并脫落，本發(fā)明首次創(chuàng)立了利用皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的雪旺氏細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，采用先低速培養(yǎng)再逐步高速培養(yǎng)的方式，使細(xì)胞先在低速下貼附在神經(jīng)導(dǎo)管上，再進(jìn)行快速生長(zhǎng)。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。圖1是皮膚來(lái)源前體細(xì)胞在相差顯微鏡下的形態(tài)和鑒定結(jié)果(A.相差顯微鏡下形態(tài)；B.皮膚來(lái)源前體細(xì)胞Fibronectin和Nestin免疫熒光陽(yáng)性，C.皮膚來(lái)源前體細(xì)胞Vimentin和Versican免疫突光陽(yáng)性)。圖2是皮膚來(lái)源前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的雪旺氏細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。圖3是用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞在三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)及傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞活力及增殖狀況。圖4是構(gòu)建完成的組織工程化神經(jīng)結(jié)晶紫染色后的組織學(xué)觀察結(jié)果(A為三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，B為傳統(tǒng)靜止培養(yǎng))。圖5是構(gòu)建完成的組織工程化神經(jīng)掃描電鏡的觀察結(jié)果(A、B是殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)壁，C、D是PLGA纖維表面；A、C為三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，B、D為傳統(tǒng)靜止培養(yǎng))。圖6是構(gòu)建完成的組織工程化神經(jīng)抗SlOO抗體免疫熒光的觀察結(jié)果(A、B是PLGA纖維表面，C、D是殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)壁'K、C為三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，B、D為傳統(tǒng)靜止培養(yǎng))。
具體實(shí)施方式
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在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非另有說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明 ，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的三維微重力生物反應(yīng)器由美國(guó)航空航天局(NASA)設(shè)計(jì)，型號(hào)是RWVB,由美國(guó)Synthecon公司制造。實(shí)施例1、大鼠皮膚來(lái)源前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)、純化及鑒定
取出生后l-3d的SPF級(jí)SD大鼠，75%酒精消毒后，無(wú)菌條件下斷頭處死，剪取背部皮膚組織，機(jī)械剝離除去皮下組織至皮片較透明，PBS沖洗3次，將皮膚組織剪成Imm2的小組織塊，濃度lmg/ml的XI型膠原酶37°C消化，每15min吸管反復(fù)吹打一次，消化30_60min，加入20ml DMEM/F12 (3:1)培養(yǎng)基清洗組織，1200rpm離心IOmin棄上清，再加入Iml新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)基，用Iml槍頭反復(fù)吹打組織使得細(xì)胞與組織脫離，此過(guò)程反復(fù)3_4次，每次可以再加入Iml培養(yǎng)基。最后，1200rpm離心lOmin，棄上清，用含F(xiàn)GF2 (40ng/ml)、EGF(20ng/ml)、及B27 (2%)的DMEM/F12 (3:1)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，以約2.5 X IO4/ml的密度將細(xì)胞種植在75cm2的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。細(xì)胞每三天加液l_2ml含F(xiàn)GF2、EGF、及B27的新鮮培養(yǎng)基，每8-10天傳代一次，傳代時(shí)將懸浮的細(xì)胞收集、離心棄上清、重懸，Img/ml的XI型膠原酶37°C消化10-20min，反復(fù)輕柔吹打，機(jī)械分離細(xì)胞球，鏡下觀察至大部分細(xì)胞呈單細(xì)胞懸浮狀態(tài)后，加入20ml含10%FBS的DMEM/F12 (3:1)培養(yǎng)基清洗，1200rpm,離心lOmin，棄上清，完全培養(yǎng)基重懸，按1:2的比例傳至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。皮膚來(lái)源前體細(xì)胞在相差顯微鏡下的觀察結(jié)果見(jiàn)圖1A，免疫熒光檢測(cè)鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1 (B，C)。實(shí)施例2、大鼠皮膚來(lái)源前體細(xì)胞向雪旺氏細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、擴(kuò)增及鑒定。將獲得的P2-P4代的大鼠皮膚來(lái)源前體細(xì)胞用lmg/ml的XI型膠原酶37°C消化10-20min,反復(fù)輕柔吹打，機(jī)械分離細(xì)胞球，將單細(xì)胞懸液按照5X 104/ml的密度種植在預(yù)先用 Laminin (0.02mg/ml)和 Poly-D-1ysine (0.2mg/ml)包被的 75cm2 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，用含 FGF2 (40ng/ml)、EGF (20ng/ml)、B27 (2%)及 FBS(5%)的 DMEM/F12 (3:1)培養(yǎng)基培養(yǎng) 3天，3 天后將培養(yǎng)基更換為含 Forskolin(5 μ M),Heregulin-1 (50ng/ml)、N2(2%)及 FBS (2%)的DMEM/F12(3:1)培養(yǎng)基培養(yǎng)14-21天可以獲得雪旺氏細(xì)胞集落，將雪旺氏細(xì)胞集落挑取并擴(kuò)增、凍存?zhèn)溆?。皮膚來(lái)源前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的雪旺氏細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)施例3、神經(jīng)導(dǎo)管的制備。參照專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮镃N201110324474.8，名為“組織工程神經(jīng)移植物及其用途”中所述的方法制得殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管，將靜電紡絲制得的聚乳酸-羥基乙酸共聚物纖維穿入殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管中(每毫米內(nèi)徑200根),用層粘連蛋白(0.02mg/ml)及多聚賴(lài)氨酸(0.2mg/ml)混合液包被過(guò)夜備用。所述支架材料使用Co60輻照或環(huán)氧乙烷滅菌。實(shí)施例4、大鼠皮膚來(lái)源前體細(xì)胞分化的雪旺氏細(xì)胞與殼聚糖及聚乳酸乙醇酸共聚物神經(jīng)導(dǎo)管分別用三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)和用傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)法培養(yǎng)。以使用250ml培養(yǎng)容器為例，將200ml完全培養(yǎng)基通過(guò)蠕動(dòng)泵緩慢注入培養(yǎng)容器，再加入2.5X IO8個(gè)細(xì)胞及實(shí)施例3制得的神經(jīng)導(dǎo)管，再以蠕動(dòng)泵緩慢注滿整個(gè)容器，細(xì)胞最終密度為I X 106/ml，排盡系統(tǒng)內(nèi)空氣后，開(kāi)始旋轉(zhuǎn)微重力循環(huán)灌注培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器放入37°C CO2培養(yǎng)箱中，前24小時(shí)轉(zhuǎn)速為10轉(zhuǎn)/分鐘，使細(xì)胞與支架材料充分接觸，貼附。24小時(shí)后調(diào)整旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)速度，使支架材料能懸浮到培養(yǎng)液中。培養(yǎng)期間每三天換液，更換500ml儲(chǔ)液瓶，7-14天后終止培養(yǎng)，體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)完成。另外，將神經(jīng)導(dǎo)管放入裝有密度為IXlOfVml種子細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿中，并將其放入370C CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每三天換液，與旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)在相同時(shí)間點(diǎn)終止培養(yǎng)并一同做以下相關(guān)檢測(cè)。實(shí)施例5、體外構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)的活力檢測(cè)、組織學(xué)觀察及免疫熒光檢測(cè)。將實(shí)施例4構(gòu)建完成的組織工程化神經(jīng)PBS浸洗三次，10分鐘/次。加CCK-8溶液，370C CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，設(shè)單純神經(jīng)導(dǎo)管為空白對(duì)照，酶標(biāo)儀在450nm進(jìn)行吸光值測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3， 結(jié)果顯示三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組和傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)組均在培養(yǎng)7天時(shí)細(xì)胞數(shù)量及活力達(dá)到最佳，前者隨后基本維持一定的水平，而后者隨后細(xì)胞數(shù)量及活力先略有下降并維持在一定的水平。三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組天時(shí)細(xì)胞數(shù)量及活力在7天后優(yōu)于傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)組。將實(shí)施例4構(gòu)建完成的組織工程化神經(jīng)PBS浸洗10分鐘，加4%的甲醛溶液固定30分鐘，PBS浸洗三次，10分鐘/次。加結(jié)晶紫染液，室溫染色30分鐘，雙蒸水浸洗至浸洗液不再有顏色，將導(dǎo)管剖開(kāi)，甘油封片，顯微鏡下觀察拍照。構(gòu)建完成的組織工程化神經(jīng)結(jié)晶紫染色后的組織學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組細(xì)胞在神經(jīng)導(dǎo)管表面生長(zhǎng)良好，與傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)相比貼壁細(xì)胞數(shù)量顯著增多。將實(shí)施例4構(gòu)建完成的組織工程化神經(jīng)PBS浸洗10分鐘，加4%戊二醛固定24小時(shí)，PBS浸洗三次，10分鐘/次，再加1%的鋨固定2小時(shí)，PBS浸洗三次，10分鐘/次，梯度乙醇脫水，室溫晾干，鍍鉬膜，掃描電鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖5 (A、B是殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)壁，C、D是PLGA纖維表面；A、C為三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，B、D為傳統(tǒng)靜止培養(yǎng))結(jié)果顯示三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組細(xì)胞在神經(jīng)導(dǎo)管及纖維表面均勻生長(zhǎng)，與傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)相比貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，形態(tài)較立體。將實(shí)施例4構(gòu)建完成的組織工程化神經(jīng)PBS漂洗10分鐘，加封閉液37°C封閉I小時(shí)。傾去封閉液，加兔抗SlOO多克隆抗體(稀釋度1:400)，4°C孵育24 48小時(shí)。PBS洗3次，加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG (稀釋度1:200)，4°C孵育過(guò)夜。PBS洗3次，熒光封片液封片，在熒光顯微鏡下采圖，結(jié)果見(jiàn)圖6 (A、B是PLGA纖維表面，C、D是殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)壁；A、C為三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，B、D為傳統(tǒng)靜止培養(yǎng))。結(jié)果顯示三維微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組在神經(jīng)導(dǎo)管及纖維表面生長(zhǎng)皮膚來(lái)源前體細(xì)胞分化的雪旺氏細(xì)胞，經(jīng)過(guò)三維微重力刺激后其形態(tài)和蛋白標(biāo)志物均未發(fā)生變化 ，而且SlOO免疫熒光陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量較傳統(tǒng)靜止培養(yǎng)顯著增多。
權(quán)利要求
1.一種體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，采用三維微重力生物反應(yīng)器，將種子細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管在三維微重力環(huán)境下的培養(yǎng)，其特征在于培養(yǎng)條件為:將種子細(xì)胞懸液與神經(jīng)導(dǎo)管放入注滿完全培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器，細(xì)胞最終密度為I XlOfVml，旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器放入370C CO2培養(yǎng)箱中，前24小時(shí)轉(zhuǎn)速為lOrpm，使細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管充分接觸，貼附；24小時(shí)后逐步提高三維微重力生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)速度，使神經(jīng)導(dǎo)管懸浮于培養(yǎng)液中；培養(yǎng)7-14天后終止培養(yǎng)，即得到組織工程化神經(jīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，其特征在于所述種子細(xì)胞為皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的雪旺氏細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，其特征在于所述神經(jīng)導(dǎo)管由絲素蛋白、殼聚糖、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、膠原、聚乳酸、明膠中的一種或幾種制成。
4.如權(quán)利要求3所述的體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，其特征在于所述神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部還含有纖維，所述纖維由絲素蛋白、殼聚糖、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、膠原、聚乳酸、明膠中的一種或幾種制成。
5.如權(quán)利要求4所述的體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，其特征在于所述神經(jīng)導(dǎo)管是表面多孔的殼聚糖導(dǎo)管，導(dǎo)管內(nèi)部含有聚乳酸-羥基乙酸共聚物纖維和/或蠶絲絲素纖維。
6.如權(quán)利要求1-5之一所述的體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，其特征在于所述神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)外表面包被有層粘連蛋 白和/或多聚賴(lài)氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的方法，采用三維微重力生物反應(yīng)器，將種子細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管在三維微重力環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為將種子細(xì)胞懸液與神經(jīng)導(dǎo)管放入注滿完全培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器，細(xì)胞最終密度為1×106/ml，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，前24小時(shí)轉(zhuǎn)速為10rpm，使細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管充分接觸，貼附；24小時(shí)后調(diào)整三維微重力生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)速度，使神經(jīng)導(dǎo)管懸浮于培養(yǎng)液中；培養(yǎng)7-14天后終止培養(yǎng)，即得到組織工程化神經(jīng)。本發(fā)明方法可以使神經(jīng)導(dǎo)管貼附的種子細(xì)胞數(shù)量更多且更均勻，有利于周?chē)窠?jīng)再生，采用皮膚源性前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的雪旺氏細(xì)胞更接近真正的雪旺氏細(xì)胞，更適合作為神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61L27/22GK103230623SQ20131017248
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者顧曉松, 丁斐, 薛成斌, 楊宇民, 顧蕓, 湯欣, 朱慧 申請(qǐng)人:南通大學(xué)