專(zhuān)利名稱(chēng)：米格列奈在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬米格列奈的應(yīng)用，特別涉及米格列奈在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦卒中(stroke)是一組突然起病、以局灶性神經(jīng)功能缺失為特征的腦血液循環(huán)障礙性疾病。其病因主要是各種因素引起腦內(nèi)動(dòng)脈狹窄、閉塞或破裂，從而導(dǎo)致急性腦血液循環(huán)障礙，臨床上表現(xiàn)為一過(guò)性或永久性神經(jīng)功能障礙的癥狀和體征，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，存活患者中多遺留有偏癱、失語(yǔ)等功能障礙。在歐美國(guó)家，腦卒中是繼腫瘤、心臟疾病之后的的第三大死亡原因，而在我國(guó)位居死亡原因第二位。給患者本人、家庭乃至社會(huì)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和不良影響。腦卒中患者中80%屬于缺血性腦卒中，目前臨床除了早期溶栓措施，急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)的臨床治療依然缺乏有效手段，而溶栓治療的時(shí)間窗極短且不能打斷AIS所致的繼發(fā)性損害及其引起的惡性循環(huán)。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型的研究發(fā)現(xiàn)，由缺血誘導(dǎo)的一系列瀑布樣延遲性生化反應(yīng)是導(dǎo)致腦卒中組織損傷及長(zhǎng)期行為學(xué)障礙的關(guān)鍵原因，其病理機(jī)制包括興奮性毒性、離子失衡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和再生障礙等等，深入研究腦卒中神經(jīng)損傷及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，開(kāi)拓有效治療腦卒中的藥物已成為不容忽視的社會(huì)性問(wèn)題，故研發(fā)理想的缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)劑和治療策略顯得十分緊迫和必要。米格列奈屬苯丙氨酸衍生物，非磺酰脲類(lèi)促胰島素分泌劑，特異性作用于Kir6.2 / SURl亞型抑制K-ATP通道，通過(guò)關(guān)閉胰島β細(xì)胞上的K+-ATP通道使β細(xì)胞膜去極化，鈣通道開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加而促使含胰島素的囊泡脫顆粒，從而刺激胰島素分泌，近年來(lái)作為早期及輕、中度2型糖尿病患者一線治療的降糖藥。與磺脲類(lèi)藥物相比，米格列奈具有速效、強(qiáng)效、短效降糖的特點(diǎn)，以及受體特異性高、給藥?kù)`活方便、安全性高、耐受性好、在體·內(nèi)無(wú)蓄積等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是未來(lái)的一種理想的餐時(shí)血糖調(diào)節(jié)劑。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，米格列奈降低餐后血糖的同時(shí)，還具有降低餐后氧化應(yīng)激和炎癥因子的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)米格列奈能維持并延長(zhǎng)缺血預(yù)處理對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用，但其對(duì)腦缺血神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病等神經(jīng)損傷性疾病的保護(hù)作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道，將其發(fā)展為缺血性腦卒中治療藥物具有極高的潛在價(jià)值與社會(huì)意義。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是通過(guò)米格列奈藥理作用的研究，設(shè)計(jì)其在米格列奈在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案米格列奈在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。所述缺血性腦卒中為急性期或修復(fù)期的缺血性腦卒中。
米格列奈的用量在不引起血糖降低的范圍內(nèi)，可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療疾病的嚴(yán)重程度等有所變化，每日一次或多次使用。所述米格列奈的單次應(yīng)用量為單次應(yīng)用量為小鼠0.0lmg/kg 1.0mg/kg，大鼠0.0035mg/kg 0.35mg/kg,人 0.00056mg/kg 0.056mg/kg ;標(biāo)準(zhǔn)體重人(70kg)單次使用量 0.04mg 4mg。有益效果:1、迄今為止，尋找和發(fā)現(xiàn)新的腦卒中神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)于臨床醫(yī)生和科研工作者來(lái)說(shuō)都是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。本發(fā)明將米格列奈應(yīng)用暫時(shí)性缺血性腦卒中小鼠模型、永久性缺血性腦卒中大鼠，以及離體氧糖剝奪(OGD)細(xì)胞損傷性模型研究發(fā)現(xiàn):(I)米格列奈在不降低血糖的劑量下顯著改善短暫性大腦中 動(dòng)脈栓塞模型(tMCAo)小鼠神經(jīng)功能障礙，減小腦梗死面積；隨米格列奈劑量增加，降糖作用增強(qiáng)，腦缺血損傷保護(hù)作用卻減弱或無(wú)；(2)米格列奈降低永久性大腦中動(dòng)脈栓塞模型(PMCAo)大鼠腦梗死體積；(3)米格列奈顯著改善OGD所致SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞株活性與細(xì)胞活力的降低，抑制LDH的釋放，減少細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果表明米格列奈具有治療缺血性腦卒中、減少OGD所致神經(jīng)元損傷的作用，可用于制備缺血性腦卒中的治療藥物。2、本發(fā)明中米格列奈的單次劑量是對(duì)治療效果有重要意義，具體為低于或高于劑量都沒(méi)有效果或效果很差。3、本發(fā)明首次證實(shí)米格列奈在不降低血糖劑量時(shí)對(duì)缺血性腦卒中具有治療作用，將其作為制備治療缺血性腦卒中用藥將具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值和社會(huì)效益。


:附圖1:MCA0模型的制備與監(jiān)測(cè)，A:大腦中動(dòng)脈閉塞模型圖解；B:激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)的局部腦血流；附圖2:米格列奈對(duì) tMCAo 小鼠血糖的影響(*P〈0.05, #P〈0.01, vs.tMCAOO; #P<0.05，##P<0.01，###P<0.0Olvs.BeforeI/R;mean±S.E.M, n=6)；附圖3:米格列奈對(duì)tMCAo小鼠神經(jīng)功能障礙的影響(*P〈0.05，**P〈0.01，vs.Sham; #P<0.05，##P<0.01 VS.tMCAOO; Mean ± S.E.M, n=6 )；附圖4:米格列奈對(duì)tMCAo小鼠腦梗死體積的影響(*P〈0.05, ***P〈0.001, tMCAOO;mean +S.E.Μ, n=6)；附圖5:米格列奈對(duì)pMCAo大鼠腦梗死體積的影響(A:pMCAo大鼠腦切片TTC染色；B:pMCAo 小鼠腦梗死體積統(tǒng)計(jì)，*Ρ〈0.05, vs.pMCAo; mean土 S.Ε.Μ, η=6)；附圖6.米格列奈對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞OGD后細(xì)胞活力的影響(*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01, ***Ρ〈0.0Olvs.Control; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.0Olvs.0GD; mean + S.E.M, n=4.)；附圖7:米格列奈對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞OGD后LDH釋放的影響(*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01, ***Ρ〈0.0Olvs.Control; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.0Olvs.0GD; mean + S.E.M, n=4.)；附圖8.米格列奈對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞OGD所致凋亡的影響具體實(shí)施方式
:實(shí)施例1米格列奈對(duì)短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞模型(tMCAo)小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.12-3月齡，雄性C57BL/6J小鼠，24-28g。購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)=SCXK (蘇)2008-0004。喂養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)飼料，自來(lái)水，室溫保持在(24±2) °C，濕度50-60%，每日光照與黑暗時(shí)間各12h。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3天。1.1.2米格列奈鈣(連云港潤(rùn)眾制藥有限公司，批號(hào)1612001)，以生理鹽水配制，母液濃度 1.2mg/ml, -20°C|C存。2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(2，3, 5-triphenyItetrazoliumchloride, TTC,購(gòu)自sigma公司),余均為市售商品。1.2 方法1.2.1tMCAo小鼠模型:小鼠術(shù)前禁食8_10h，自由飲水。腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉小鼠,參照Longa法,用6-0娃膠包被的尼龍單絲線(Doccol Corp)制備單絲管腔內(nèi)右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCA0)模型。在缺血60分鐘后，輕取出尼龍線，并恢復(fù)頸總動(dòng)脈血供。缺血和再灌注過(guò)程都由激光多普勒血流儀(LDF) (Moor Instruments, Devon, UK)監(jiān)測(cè)證實(shí)(圖1),體溫維持在 36°C _37°C。偽手術(shù)組動(dòng)物，接受相同的麻醉和手術(shù)過(guò)程，除了不進(jìn)行tMCAO。1.2.2給藥與取樣檢測(cè) :C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注模型組(tMCAo)，米格列奈不同劑量組。小鼠在大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注后60min灌胃給予不同劑量的米格列奈，0.2ml/10g體重，模型組同法給予等量的生理鹽水。在小鼠缺血前、缺血后2、24h尾靜脈取血測(cè)定血糖值，術(shù)后24h進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分、腦梗死體積等藥效學(xué)評(píng)價(jià)。1.2.3神經(jīng)功能障礙評(píng)分:根據(jù)五分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙評(píng)分:0分，正常，無(wú)神經(jīng)學(xué)征象；1分，不能完全伸展左前肢；2分，行走時(shí)左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)左側(cè)傾倒；4分，無(wú)自主行走并伴有意識(shí)水平降低；5分，死亡。1.2.4腦梗死體積測(cè)定:小鼠斷頭處死，迅速取出腦組織，去除嗅球、小腦及低位腦干，-2(TC冰凍lOmin。自前極(anterior pole)連續(xù)切取Imm厚度腦冠狀切片，置2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2，3, 5-triphenyltetrazoliumchloride, TTC,購(gòu)自 sigma 公司)生理鹽水溶液中37°C避光孵育lOmin，10%甲醛中性緩沖液(pH7.4)固定過(guò)夜。微距相機(jī)拍攝，Image pro plus5.1圖像分析軟件計(jì)算并統(tǒng)計(jì)腦梗死體積。1.3 結(jié)果1.3.1血糖監(jiān)測(cè):tM0AC小鼠單次灌胃0.05,0.1,0.33mg/kg米格列奈血糖波動(dòng)與給藥前比較無(wú)顯著性差異(P > 0.05)，灌胃給予l、3、6mg/kg米格列奈小鼠血糖顯著低于給藥前(P < 0.05或P < 0.01或？ < 0.001);給藥2h時(shí)，3、6mg/kg米格列奈組小鼠血糖較對(duì)照顯著降低(與tMCAOO比較P < 0.05或卩< 0.01)，如圖2所示。提示，lmg/kg米格列奈以上劑量具有降低tMCAO小鼠血糖的作用。1.3.2神經(jīng)功能評(píng)價(jià):tMCAo模型組小鼠手術(shù)后出現(xiàn)損傷對(duì)側(cè)的左前肢不能伸展，行走時(shí)左側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒，甚至無(wú)法自主行走、意識(shí)水平降低或死亡等顯著的缺血性腦卒中神經(jīng)功能障礙癥狀。單次灌服米格列奈對(duì)小鼠tMCAo所致神經(jīng)功能活動(dòng)障礙呈雙向反應(yīng)，當(dāng)劑量增加作用增強(qiáng)，至0.33mg/kg時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)(與tMCAO對(duì)照比較P < 0.05或P <
0.001)，大于此劑量后隨劑量的增加保護(hù)作用減弱或幾無(wú)(圖3)。對(duì)照血糖測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨劑量的增加小鼠血糖降低，神經(jīng)功能活動(dòng)障礙增加。提示米格列奈具有減輕小鼠tMCAo所致神經(jīng)功能障礙的作用，對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)損傷的保護(hù)作用呈劑量相關(guān)性。1.3.3腦梗死體積:圖4結(jié)果顯示與圖3相似，單次灌服米格列奈對(duì)小鼠tMCAo所致腦梗死體積的增加呈雙向反應(yīng)，隨劑量增加腦梗死體積降低，至0.33mg/kg時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)(與tMCAO對(duì)照比較P < 0.05或卩< 0.001)，此后隨劑量的增加保護(hù)作用減弱或幾無(wú)，該作用與米格列奈降糖程度呈反比。提示米格列奈具有降低tMCAo小鼠腦梗死體積的作用。本實(shí)施例提示米格列奈對(duì)缺血性腦卒中的治療作用具有雙向性，在不降低血糖的劑量下可減輕缺血性腦卒中神經(jīng)功能障礙，減少腦梗死體積；隨米格列奈劑量增加，降糖作用增強(qiáng)，腦缺血損傷保護(hù)作用減弱或無(wú)。表明米格列奈具有治療缺血性腦卒中的可能。實(shí)施例2米格列奈對(duì)永久性大腦中動(dòng)脈栓塞模型(pMCAo)大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1動(dòng)物:2-3月齡，雄性SD大鼠，230_270g。購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)=SCXK (蘇)2008-0004。喂養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)飼料，自來(lái)水，室溫保持在(24±2) °C，濕度50-60%，每日光照與黑暗時(shí)間各12h。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3天。2.1.2 同 1.1.2。2.2 方法pMCAo大鼠模型:大鼠術(shù)前禁食12h，腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉大鼠，使大鼠停止自主活動(dòng)，肌肉松弛。參照tMCAo小鼠模型，制備單絲管腔內(nèi)右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAo)模型。結(jié)扎ICA止血,剪除導(dǎo)線并固定血管內(nèi)栓線，逐層縫合肌肉、腺體和皮膚，傷口消毒后局部使用抗生素防止感染，仰臥置于溫箱中待麻醉清醒。手術(shù)過(guò)程由激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)證實(shí)，體溫維持在36°C_37°C。偽手術(shù)組動(dòng)物，接受相同的麻醉和手術(shù)過(guò)程，除了不向血管內(nèi)插入栓線與結(jié)扎ICA。分組與給藥:SD大鼠隨機(jī)分為永久性大腦中動(dòng)脈栓塞模型組(pMCAo)，0.16mg/kg米格列奈治療組。大鼠在大腦中動(dòng)脈栓塞3h灌胃給予米格列奈，0.2ml/100g體重，對(duì)照組同法給予等量的生理鹽水，每日I次，連續(xù)給藥3天后進(jìn)行腦梗死體積評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)指標(biāo):腦梗死體積評(píng)價(jià)方法同實(shí)施例1中1.2.
2.3.結(jié)果pMCAo大鼠連續(xù)3d灌胃給予0.16mg/kg米格列奈,與模型對(duì)照比較腦梗死體積顯著降低(圖5，p〈0.05)，提示米格列奈具有治療永久性缺血性腦卒中的作用。實(shí)施實(shí)例3米格列奈對(duì)氧糖剝奪SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用3.1實(shí)驗(yàn)材料SH-SY5Y細(xì)胞株:神經(jīng)元細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞所。甲氮甲唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司。LDH測(cè)定試劑盒:南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。
3.2 方法3.2.1SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪模型:SH_SY5Y細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中(37°C，5%C02),實(shí)驗(yàn)前接種于96孔板上培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)日，預(yù)先給藥孵育30min后換含藥無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，至三氣培養(yǎng)箱中(37°C，1%02，94%N2, 5%C02)氧糖剝奪培養(yǎng)60min后恢復(fù)氧糖正常培養(yǎng)24h，取樣檢測(cè)。Mitiglinide藥物孵育濃度分別為10_1(1、10_9、10_8、10'10_6和10_5mol。3.2.2LDH與細(xì)胞活力:給予不同藥物處理的SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪恢復(fù)氧糖正常培養(yǎng)24h后，收集上清用于測(cè)定LDH ;再加入5mg/ml的MTT溶液20 μ 1，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄上清液，每孔加入150 μ 1DMS0混勻，選擇570nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。細(xì)胞活力(％)=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值X 100%。3.2.3.細(xì)胞凋亡:給予不同藥物處理的SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪后，D-Hanks溶液漂洗兩遍，消化離心細(xì)胞。重懸清洗兩遍，加入500 μ ΙΡΙ/AnnexinV混合液重懸混勻。室溫避光作用10分鐘后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡。3.3 結(jié)果離體研究發(fā)現(xiàn)，氧糖剝奪Ih導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞存活率降低，促進(jìn)LDH釋放，增加細(xì)胞凋亡，較control組均有顯著性差異。l(rlclmol/L l(T7mol/L米格列奈顯著改善OGD所致的細(xì)胞存活率降低、減少LDH釋放、抑制O⑶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖6 圖8)，以10_8mol/L米格列奈作用較強(qiáng)。本實(shí)施例表明，米格列奈顯著改善OGD所致的神經(jīng)元活性與增殖能力的降低，抑制LDH的釋放，減少細(xì)胞凋亡， 具有保護(hù)OGD所致神經(jīng)元損傷的作用。
權(quán)利要求
1.米格列奈在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述的米格列奈在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述缺血性卒中為急性期或修復(fù)期的缺血性腦卒中。
3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)2所述的米格列奈在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述米格列奈的單次應(yīng)用量?jī)H限于不引起血糖降低的劑量。
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)2所述的米格列奈在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述米格列奈的單次應(yīng)用量為小鼠0.0lmg/kg 1.0mg/kg,大鼠0.0035 mg/kg ·0.35mg/kg,人 0.00056mg/kg 0.056mg/kg ;標(biāo)準(zhǔn)體重人 70kg 單次使用量 0.04mg 4mg。
全文摘要
本發(fā)明提供了米格列奈((Mitiglinide,MGN))在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)米格列奈在不降低血糖劑量時(shí)顯著改善缺血性腦卒中模型小/大鼠的神經(jīng)功能障礙，降低腦梗死體積；米格列奈抑制氧糖剝奪(OGD)所致神經(jīng)元細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞存活率的降低，減少乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，改善OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。結(jié)果表明米格列奈具有治療缺血性腦卒中、減少OGD所致神經(jīng)元損傷的藥理作用，該治療作用具有雙向性。本發(fā)明的作用是將米格列奈作為活性成份用于制備缺血性腦卒中的治療藥物。
文檔編號(hào)A61P9/10GK103239440SQ20131017270
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者胡剛, 王林曉, 丁建花, 董銀鳳, 曹文靜 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)