一種烏賊墨抗前列腺癌多肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種烏賊墨抗前列腺癌多肽及其制備方法，所述烏賊墨抗前列腺癌多肽的氨基酸序列為序列表中的SEQIDNo.1。本發(fā)明安全性好，反應條件溫和，過程控制容易，所得烏賊墨抗前列腺癌多肽純度高，對前列腺癌PC-3細胞有明顯的增殖抑制作用，且隨著作用的時間和用藥濃度的增加，抗前列腺癌細胞增殖的抑制率也明顯增加，具有較好的醫(yī)學應用價值。
【專利說明】一種烏賊墨抗前列腺癌多肽及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術領域】，特別涉及一種烏賊墨抗前列腺癌多肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]烏賊屬于軟體動物門頭足綱烏賊目烏賊科。像其他的頭足類一樣，通過噴射黑色的墨汁防御外敵，烏賊的營養(yǎng)豐富，除可食用外，還具有很好的藥用價值。尤其是烏賊的墨汁，早在《本草拾遺》中就有“腹中墨，主治血刺心痛”的記載。烏賊墨囊一般是作為廢棄物。上世紀90年代，日本學者(Sasaki J, Ishita K, Takaya Y, et al.Ant1-tumor activity ofsquid ink[J].Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 1997，43 (4):455)從烏賊墨中分離出一種具有很好抗腫瘤作用的提取物。然后，烏賊墨逐漸成為研究者的關注熱點，近年來，烏賊墨中的提取物所具有的功能活性被研究者們廣泛開發(fā)，研究。比如，抗氧化、降血壓、抗菌性、抗?jié)兊鹊??？茖W家們對其抗腫瘤活性進行研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種抗腫廇機制，比如烏賊墨有提高免疫功能，誘生細胞因子，誘導癌細胞凋亡，抑制癌細胞生長的作用等等。在國內(nèi)研究烏賊墨抗腫瘤作用的學者有很多，我們可以參考《中國藥師》2003年第6卷第10期，李孝東和袁建華所著的“烏賊墨抗腫瘤機制研究進展”，《中國海洋藥物雜志》2012年第31卷第5期，張倩和張建民所著的“烏賊墨抗腫瘤活性研究進展”。這些充分顯示了烏賊墨在抗腫瘤藥物開發(fā)具有十分顯著的潛在價值，因此挖掘其潛在的藥用價值對充分利用海洋資源、擴大藥源也有深遠意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的之一在于提供一種烏賊墨抗前列腺癌多肽，對前列腺癌PC-3細胞有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫(yī)學應用價值。
[0004]本發(fā)明的目的之二在于提供一種烏賊墨抗前列腺癌多肽的制備方法，安全性好，反應條件溫和，過程控制容易，所得烏賊墨抗前列腺癌多肽純度高，對前列腺癌PC-3細胞有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫(yī)學應用價值。
[0005]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
一種烏賊墨抗前列腺癌多肽，所述烏賊墨抗前列腺癌多肽的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID N0.1。
[0006]SEQ ID N0.1:LKYYDDESTQHGAKRMVPYKIFLNRAATRG。
[0007]一種烏賊墨抗前列腺癌多肽的制備方法，所述的制備方法步驟如下:
(1)將鮮烏賊墨原料勻漿得烏賊墨漿料；
(2)按照每克烏賊墨漿料加0-3ml超純水的配比，將烏賊墨漿料與超純水混勻，調(diào)節(jié)pH2.0-3.5，按照每克烏賊墨漿料加300-1200U的加酶量加入胃蛋白酶，30_45°C酶解2_8小時得酶解液；
(3)酶解液滅活，離心，取上清液，經(jīng)超濾獲得分子量大于3kd小于等于5kd的活性組分；
(4)將分子量大于3kd小于等于5kd的活性組分經(jīng)SephadexG-25層析分離，于280nm波長下檢測，收集所得吸收峰，冷凍干燥；
(5)對得到的吸收峰進行體外抗腫瘤實驗篩選，獲得抗前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制率最高的吸收峰即為烏賊墨抗前列腺癌多肽。
[0008]步驟(4)、(5)具體操作為:將分子量大于3kd小于等于5kd的活性組分用蒸餾水進行溶解，離心，取上清液，過0.22μπι微孔濾膜，取濾液過Sephadex G_25柱，用蒸餾水為洗脫液，平衡和洗脫，于280nm波長下檢測，得到三個峰，收集所得吸收峰，冷凍干燥，經(jīng)體外抗腫瘤實驗篩選，得到抗前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制率最高的第二吸收峰，收集第二吸收峰。
[0009]作為優(yōu)選，步驟(2)中按照每克烏賊墨漿料加l_3ml超純水的配比。
[0010]作為優(yōu)選，步驟(2)中40_45°C酶解4-8小時得酶解液。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:安全性好，反應條件溫和，過程控制容易，所得烏賊墨抗前列腺癌多肽純度高，對前列腺癌PC-3細胞有明顯的增殖抑制作用，且隨著作用的時間和用藥濃度的增加，抗前列腺癌細胞增殖的抑制率也明顯增加，具有較好的醫(yī)學應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是分子量大于3kd小于等于5kd的活性組分的G-25凝膠層析色譜圖；
圖2是本發(fā)明烏賊墨抗前列腺癌多肽的高效液相圖。
【具體實施方式】
[0013]下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。
[0014]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。
[0015]1、材料
1.1材料:烏賊購于舟山南珍菜市場。
[0016]1.2細胞株:人前列腺癌細胞株PC-3株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。
[0017]1.3主要試劑:HamF12培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；CCK-8，(WST)日本同仁化學研究所；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，胰蛋白酶，北京亞太恒信科技公司；福林酚，上海如吉生物發(fā)展有限公司。
[0018]1.4主要儀器:
SSW-420-2S恒溫水浴鍋，上海民儀電子有限公司；
BSff-1OO-ZCD自動部分收集器，上海琪特分析儀器有限公司；
BT1-100恒流泵，上海琪特分析儀器有限公司；
PHS-250PH計，上海理達儀器廠；
CF16RXII日立低溫離心機，日本日立公司；
DS-1組織搗碎機，上海標本模型廠；
UV-1600PC 上海美譜達有限公司；
LGJ-18冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；高效液相色譜儀(1260安捷倫)，agilent ；
G-25分子篩凝膠，上海如吉生物發(fā)展有限公司；
超濾杯、超濾膜，上海摩速科學器材有限公司；
超凈臺Forma3111,上海智城分析儀器制造有限公司；
細胞培養(yǎng)箱ZHJM-C12090，杭州寶城生物科技有限公司；
酶標儀(美國BIO-RAD);杭州寶城生物科技有限公司；
微量震蕩器，上海精密儀器有限公司。
[0019]2、方法
2.1細胞培養(yǎng):人前列腺癌PC-3細胞接種于含10% (體積分數(shù))FBS、雙抗溶液(青霉素G100IU/ml、鏈霉素100IU/ml)的HamF12培養(yǎng)基中，置于37°C、5%C02、95%飽和濕度條件下的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，細胞貼壁生長，每2-3天換液I次，當細胞生長匯合時，按1:3傳代，每周傳代1-2次。用0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA混合消化液消化，收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。
[0020]2.2細胞增殖抑制試 驗(CCK-8法):將PC_3細胞以每孔5 X IO3個細胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液200 μ L。貼壁生長后，每組細胞分別加入一定濃度烏賊墨提取物溶液(可以是酶解產(chǎn)物、超濾得到的五種組分、烏賊墨抗前列腺癌多肽)，對照組加入等體積培養(yǎng)液(培養(yǎng)液即2.1節(jié)中含10% (體積分數(shù))FBS、雙抗溶液(青霉素G100IU/ml、鏈霉素100IU/ml)的HamF12培養(yǎng)基)，每個濃度設6個復孔。置于37 °C, 5% C02條件下分別孵育24h。每孔加入CCK-8溶液IOyL,置37°C，5% C02條件下繼續(xù)孵育4h終止培養(yǎng)。選擇450nm波長，在酶標儀上測定各孔光密度值D450，重復實驗3次。按下列公式計算細胞抑制率:腫瘤細胞抑制率(％)=(對照組D450-用藥組D450)/對照組D450X 100%。
[0021]2.3酶活力的測定
酶活力按Folin-酚法作測酶活力，酶活力分別為:胃蛋白酶73400U/g，堿性蛋白酶169000 U /g，木瓜蛋白酶48000 U /g，胰蛋白酶69000 U /g。
[0022]2.4樣品提取方法:
2.4.1酶解樣品的制備:將新鮮烏賊墨原料勻漿，稱取IOg烏賊墨漿料。用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH值，加入蛋白酶，在水浴箱中酶解，90°C滅活15min，低溫離心機10000 r/min離心10min，取上清液，超濾，冷凍干燥得樣品粉末。
[0023]2.4.2 4種蛋白酶水解條件的確定:酶解工藝中有許多影響因素，除底物濃度、加酶量外，反應溫度、反應時間、PH等對抗前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制率具有不同程度的影響。以抗前列腺癌細胞PC-3增殖的抑制率為指標，以料液比(即烏賊墨漿料:超純水，w/v)、pH、時間、加酶量、溫度為五因素，采用L16(45)正交實驗確定酶解的最佳反應條件。各酶的因素與水平如下四個表格:
表1堿性蛋白酶的因素與水平
【權利要求】
1.一種烏賊墨抗前列腺癌多肽，其特征在于:所述烏賊墨抗前列腺癌多肽的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID N0.1。
2.一種烏賊墨抗前列腺癌多肽的制備方法，其特征在于:所述的制備方法步驟如下: (1)將鮮烏賊墨原料勻漿得烏賊墨漿料； (2)按照每克烏賊墨漿料加0-3ml超純水的配比，將烏賊墨漿料與超純水混勻，調(diào)節(jié)pH2.0-3.5，按照每克烏賊墨漿料加300-1200U的加酶量加入胃蛋白酶，30-45°C酶解2-8小時得酶解液； (3)酶解液滅活，離心，取上清液，經(jīng)超濾獲得分子量大于3kd小于等于5kd的活性組分； (4)將分子量大于3kd小于等于5kd的活性組分經(jīng)SephadexG-25層析分離，于280nm波長下檢測，收集所得吸收峰，冷凍干燥； (5)對得到的吸收峰進行體外抗腫瘤實驗篩選，獲得抗前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制率最高的吸收峰即為烏賊墨抗前列腺癌多肽。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中按照每克烏賊墨漿料加1-3ml超純水的配比。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中40-45°C酶解4_8小時得酶解液。
【文檔編號】A61P35/00GK103897050SQ201310176983
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年5月14日 優(yōu)先權日:2013年5月14日
【發(fā)明者】丁國芳, 景奕文, 楊最素, 黃芳芳, 曾麗, 張國梅, 李連軍, 滕芳芳, 郁迪 申請人:浙江海洋學院