多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)于一種多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原，其中所述抗原來(lái)自滅活的多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物的上清液，所述上清液含有多糖和蛋白。本發(fā)明還提供一種利用所述抗原建立的多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗(yàn)方法，該方法具有良好的特異性和敏感性；本發(fā)明還提供一種含有所述抗原的疫苗。本發(fā)明的多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原疫苗具有與全菌疫苗同等的免疫效力，且具有不影響動(dòng)物生長(zhǎng)、疫苗注射部位局部副反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原、制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域，特別涉及一種多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原。

【背景技術(shù)】
[0002]多殺性巴氏桿菌(Pasteurell multoeida, Pm)能引起多種動(dòng)物的巴氏桿菌病，如禽類的禽霍亂、豬肺疫、牛、兔等動(dòng)物的出血性敗血癥。該類疾病分為急性、亞急性和慢性三類，前兩種發(fā)病快、死亡率高，第三類容易導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率降低及繼發(fā)感染其它細(xì)菌或病毒，繼而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有效的疫苗接種是預(yù)防和控制該類疾病的有效途徑，各種動(dòng)物的巴氏桿菌滅活疫苗及弱毒疫苗為該病的防控做出了巨大的貢獻(xiàn)。但目前所使用的疫苗多為全菌疫苗，雖然臨床效果不錯(cuò)，但由于該菌屬于革蘭氏陰性菌，高濃度的菌液中不僅含有高濃度的抗原物質(zhì)，而且含有高濃度的內(nèi)毒素，因而使得該類疫苗在臨床應(yīng)用中的副反應(yīng)較大，在注射部位容易形成硬結(jié)，而且其交叉保護(hù)性差，免疫持續(xù)期不長(zhǎng)。弱毒活疫苗的交叉免疫效果較好，但接種后應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng)，并不能完全預(yù)防該病的發(fā)生。
[0003]因此，人們想到了去除菌體，保留有效抗原成分制備成成分較為單一的疫苗。莢膜多糖是多殺性巴氏桿菌重要的組成部分，研究表明，莢膜多糖不僅與菌株的毒力有關(guān)，而且還是多殺性巴氏桿菌重要的保護(hù)性抗原。于是人們采用不同的方法提取多殺性巴氏桿菌的莢膜多糖制備成亞單位疫苗，早在上世紀(jì)80年代，Neylan A等在專利US005225194A中就對(duì)多殺性巴氏桿菌多糖疫苗的制備進(jìn)行了詳細(xì)描述，但多糖抗原多為非胸腺依賴性抗原，誘導(dǎo)體液免疫主要產(chǎn)生I gM免疫球蛋白，記憶反應(yīng)微弱甚至缺失，同時(shí)，年齡幼小的動(dòng)物常表現(xiàn)出年齡相關(guān)的多糖抗原無(wú)應(yīng)答性。因此，后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，莢膜多糖(或多糖)疫苗的免疫效果往往差強(qiáng)人意，其免疫效果比常規(guī)的全菌疫苗差。孫德君等人在“兔巴氏桿菌莢膜抗原疫苗與常規(guī)疫苗安全性和免疫效力的對(duì)比試驗(yàn)研究”[中國(guó)畜牧雜志，2011，47 (12):70-72] —文中公開(kāi)了一種對(duì)兔巴氏桿菌株接種于0.1%裂解全血改良馬丁肉湯中，然后米用物理方法進(jìn)行粗提，制備莢膜疫苗的方法，并分別進(jìn)行了莢膜疫苗和常規(guī)疫苗的安全性免疫效力及免疫期試驗(yàn)，免疫效力檢驗(yàn)結(jié)果顯示:莢膜疫苗的攻毒保護(hù)率為60%，較常規(guī)疫苗免疫效力偏低，但安全性好于常規(guī)疫苗。
[0004]外膜蛋白作為多殺性巴氏桿菌另一種主要的保護(hù)性抗原，諸多學(xué)者對(duì)其免疫原性進(jìn)行了大量的研究。上世紀(jì)，YUE-SH0UNG LU等先后證明了多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白在兔體能產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，并能對(duì)同源菌株的攻毒提供100%的保護(hù)。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著對(duì)巴氏桿菌外膜蛋白的成分、結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，研究者們對(duì)單個(gè)的外膜蛋白進(jìn)行了免疫原性的研究，結(jié)果顯示多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H (OmpH)、脂蛋白E (PlpE)和脂蛋白B (PlpB)等單一外膜蛋白具有良好的免疫原性，其中PlpB還具有不同血清型多殺性巴氏桿菌交叉保護(hù)的效果。多殺性巴氏桿菌外膜蛋白疫苗可以通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)物的直接提取進(jìn)行實(shí)現(xiàn)，如Louisa B.Tabatabai等2004年對(duì)多殺性巴氏桿菌五種外膜蛋白的鑒定中所描述的一樣，先后將菌體進(jìn)行溶菌酶、EDTA、Triton X-100等進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)離心和萃取等環(huán)節(jié)獲得外膜蛋白，這樣得到的多為外膜蛋白混合物；多殺性巴氏桿菌外膜蛋白疫苗也可以通過(guò)特定外膜蛋白的基因克隆表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，如Jeongmin Lee等2007年在對(duì)OmpH免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)中所描述的那樣，最后將工程菌體破碎后提取多殺性巴氏桿菌外膜蛋白的方法，這樣獲得的外膜蛋白為成分相對(duì)單一的外膜蛋白。兩者均能獲得免疫原性好的外膜蛋白，但操作步驟繁瑣，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
[0005]因此，實(shí)有必要開(kāi)發(fā)一種適合于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的，具備與常規(guī)全菌疫苗相同免疫效力，同時(shí)又安全無(wú)副作用的多殺性巴氏桿菌疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原，該抗原制備方法簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，且具有良好的免疫原性；將本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞抗原致敏綿羊紅細(xì)胞后，可用于檢測(cè)多殺性巴氏桿菌特異性抗體，該檢測(cè)方法特異性和穩(wěn)定性均較好。此外，將本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞抗原添加佐劑和防腐劑后制備成疫苗，具有全菌疫苗同等的免疫效力，且不影響動(dòng)物生長(zhǎng)、疫苗注射部位局部副反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原，其中所述抗原來(lái)自滅活的多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物的上清液，所述上清液含有多糖和蛋白。所述多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物的上清液是通過(guò)將多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物離心或沉淀后取液體組分。
[0008]在一【具體實(shí)施方式】中，所述多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物由液體培養(yǎng)基，在適宜溫度，例如37°C下培養(yǎng)一定時(shí)間，例如12_16h后獲得；也可以是由固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后由無(wú)菌緩沖液或液體培養(yǎng)基洗下菌落(或菌苔)獲得。
[0009]在另一【具體實(shí)施方式】中，所述培養(yǎng)基中除了常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有一定量的血清。血清的濃度為2-20% (V/V)，優(yōu)選為5-15% (V/V)，再優(yōu)選8-10% (V/V)，最優(yōu)選為10%(V/V)0
[0010]在一【具體實(shí)施方式】中，所述培養(yǎng)物的滅活所使用的滅活劑為甲醛溶液、或β-丙內(nèi)酯，也可以通過(guò)物理方式進(jìn)行滅活，如加熱等。
[0011]優(yōu)選地，所述多殺性巴氏桿菌為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的強(qiáng)毒株，包括兔多殺性巴氏桿菌C51-2株、C57-17株和雞多殺性巴氏桿菌C48-2株和1502株，也包括通過(guò)公用平臺(tái)和臨床病例分離鑒定獲得的豬源性、兔源性及其它動(dòng)物源性，例如?；蜓虻亩鄽⑿园褪蠗U菌強(qiáng)毒株。
[0012]優(yōu)選地，所述抗原中多糖含量為0.5-0.7mg/ml,所述抗原中蛋白含量為
8.8-10.6mg/ml。
[0013]優(yōu)選地，所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原為動(dòng)物多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原。所述動(dòng)物為豬、兔、雞、?；蜓?。
[0014]本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原的方法，該方法包括:將多殺性巴氏桿菌接種于含血清的培養(yǎng)基中，在30-40°C，優(yōu)選為37°C下培養(yǎng)8-24h，得多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物，該多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物經(jīng)滅活后離心或直接沉淀，棄菌體，取上清液即可獲得同時(shí)含有多糖和蛋白的多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原。
[0015] 優(yōu)選地，所述血清的濃度基于所述培養(yǎng)基為2-20% (V/V)，優(yōu)選為5-15% (V/V)，再優(yōu)選 5-10% (V/V)，最優(yōu)選為 10% (V/V)o
[0016]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基可以為腦心浸液肉湯、胰蛋白大豆培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基等商品化培養(yǎng)基，或含蛋白胨、酵母提取物、蛋白水解物等營(yíng)養(yǎng)成分的配方培養(yǎng)基，在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，優(yōu)選為改良馬丁培養(yǎng)基。
[0017]本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于提供所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原在多殺性巴氏桿菌血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。所述血清學(xué)檢測(cè)包括間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或ELISA等方法。
[0018]在一【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明使用間接血凝試驗(yàn)方法，利用多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原檢測(cè)血清中多殺性巴氏桿菌的特異性抗體。例如，采集新鮮抗凝綿羊血，洗滌后配制成紅細(xì)胞懸液，然后用戊二醛醛化，再用鞣酸鞣酸化，得鞣酸化綿羊紅細(xì)胞液。將該鞣酸化綿羊紅細(xì)胞液與本發(fā)明所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原液混合，致敏，配成致敏紅細(xì)胞懸液，可用于檢測(cè)多殺性巴氏桿菌特異性抗體。
[0019]本發(fā)明的目的還在于提供一種多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞疫苗，其含有所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原、佐劑和防腐劑。
[0020]優(yōu)選地，所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原在疫苗中的終濃度為70-95% (V/V)0
[0021]所述無(wú)細(xì)胞疫苗中的佐劑的例子包括但不限于氫氧化鋁膠、礦物油、蜂膠、GelOl(法國(guó)SCIPPIC)、ISA206 (法國(guó)SCIPPIC)。優(yōu)選為氫氧化鋁膠、蜂膠和/或白油，更優(yōu)選為氫氧化鋁膠。
[0022]所述佐劑在疫苗中的終濃度為4-29% (V/V)0
[0023]所述防腐劑為硫柳汞，其在疫苗中的終濃度為0.001-0.01% (V/V)0
[0024]本發(fā)明還提供了一種制備多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞疫苗的方法，其包括如下步驟:將多殺性巴氏桿菌接種于含血清的培養(yǎng)基中，在30-40°C下培養(yǎng)8-24h，得多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物，該多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物經(jīng)滅活后離心或直接沉淀，棄菌體，取上清液即可獲得同時(shí)含有多糖和蛋白的多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原，該抗原經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，加入佐劑和硫柳汞，混勻后即為多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞疫苗。
[0025]本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞疫苗與全菌疫苗具有同等的免疫效力，且對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)及毛皮質(zhì)量的影響顯著低于全菌疫苗的影響。
[0026]本發(fā)明所提供的多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原的提取方法簡(jiǎn)單易行，易于規(guī)模化生產(chǎn)；將多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原致敏綿羊紅細(xì)胞后，可用于檢測(cè)多殺性巴氏桿菌特異性抗體，且具有良好的特異性和敏感性；利用本發(fā)明所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原所制備的無(wú)細(xì)胞疫苗免疫效果可以達(dá)到全菌疫苗的免疫效果，同時(shí)意外發(fā)現(xiàn)全菌疫苗免疫動(dòng)物后應(yīng)激反應(yīng)較大，不僅注射部位的炎癥反應(yīng)較嚴(yán)重，且動(dòng)物的增重顯著低于無(wú)細(xì)胞疫苗免疫組以及對(duì)照組，而無(wú)細(xì)胞疫苗免疫組和對(duì)照組在動(dòng)物增重方面無(wú)顯著差異。因此，本發(fā)明所提供的多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞疫苗完全能夠替代當(dāng)前的全菌疫苗，同時(shí)降低了疫苗注射所引起的副反應(yīng)。本疫苗得到推廣應(yīng)用后，不僅適用于肉用動(dòng)物，也適用于皮毛動(dòng)物，在預(yù)防疾病的同時(shí)，不降低動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1無(wú)細(xì)胞疫苗免疫組試驗(yàn)免疫苗注射部位的組織圖。
[0028]圖2全菌疫苗免疫組試驗(yàn)免疫苗注射部位的組織圖。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下列提供的實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例的范圍。
[0030]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0031]本發(fā)明所使用的菌株，例如兔多殺性巴氏桿菌C51-2株、C51-17株；雞多殺性巴氏桿菌C48-2株、1502株；支氣管敗血波氏桿菌BS039株和大腸埃希氏桿菌CMCC44149株，均是公眾能從國(guó)內(nèi)外商業(yè)渠道買到的生物材料，例如可從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購(gòu)買。
[0032]本發(fā)明所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原來(lái)自滅活的多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物棄去菌體后的上清液，其不含菌體。本發(fā)明所述抗原所含有的多糖和蛋白分別為多殺性巴氏桿菌的組成部分，多殺性巴氏桿菌經(jīng)接種、培養(yǎng)后部分多糖和蛋白成分釋放至培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)液滅活、離心或自然沉淀后棄菌體即獲得了含有多糖和蛋白的無(wú)細(xì)胞抗原，且該抗原具有良好的免疫原性，可用于制備血清學(xué)診斷用抗原和疫苗。
[0033]實(shí)施例一:多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原的制備
[0034]取兔多殺性巴氏桿菌C51-2株、C51-17株(均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，菌株保藏編號(hào)分別為CVCC499、CVCC1753)和雞多殺性巴氏桿菌C48-2株、1502株(均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，菌株保藏編號(hào)分別為CVCC44802、CVCC2082)凍干菌種，分別用l_2ml滅菌生理鹽水溶解后接種于2-20% (V/V)血清改良馬丁瓊脂平板復(fù)蘇后，取菌落接種于2-20% (V/V)血清改良馬丁肉湯，置37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)12h，菌液加入0.15%的甲醛溶液，37°C滅活24小時(shí)后，1000rpm離心20min，上清液即為多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原。
[0035]其中:含2-20% (V/V)血清的改良馬丁平板按如下步驟制備:稱取改良馬丁瓊脂(購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)42g，加入800-980ml蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，115°C高壓蒸汽滅菌30min，溫度降至60°C左右，分別加入20_200ml新生牛血清(四季青，購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司)，充分搖勻后倒平皿。
[0036]含2-20% (V/V)血清改良馬丁肉湯按如下步驟制備:稱取改良馬丁培養(yǎng)基(購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)40g，加入800-980ml蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，115°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后加入20_200ml新生牛血清，混勻后即成。
[0037]實(shí)施例二:多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原主要成分的檢測(cè)
[0038]I無(wú)細(xì)胞抗原蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
[0039]使用核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf, B1Photometer plus)直接測(cè)定各無(wú)細(xì)胞抗原的蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0040]表1:多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原中蛋白含量的測(cè)定結(jié)果
[0041]

【權(quán)利要求】
1.一種多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原，其特征在于，所述抗原來(lái)自滅活的多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物的上清液，所述上清液含有多糖和蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗原，其特征在于，所述抗原中多糖含量為0.5-0.7mg/ml，所述抗原中蛋白含量為8.8-10.6mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗原，其特征在于，所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原為動(dòng)物多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原；所述動(dòng)物優(yōu)選為豬、兔、雞、?；蜓颉?br> 4.一種制備如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原的方法，其特征在于，該方法包括:將多殺性巴氏桿菌接種于含血清的培養(yǎng)基中，在30-40°C下培養(yǎng)8-24h，得多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物，該多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物經(jīng)滅活后離心或直接沉淀，棄菌體，取上清液即可獲得同時(shí)含有多糖和蛋白的多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述血清的濃度基于所述培養(yǎng)基為2-20%(V/V)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗原在多殺性巴氏桿菌血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。
8.一種多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞疫苗，其特征在于，含有如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)中所述的多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原、佐劑和防腐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原在疫苗中的終濃度為70-95% (V/V);所述佐劑在疫苗中的終濃度為4-29% (V/V);所述防腐劑為硫柳汞，其在疫苗中的終濃度為0.001-0.01% (V/V)0
10.一種制備多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于，該方法包括:將多殺性巴氏桿菌接種于含血清的培養(yǎng)基中，在30-40°C下培養(yǎng)8-24h，得多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物，該多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物經(jīng)滅活后離心或直接沉淀，棄菌體，取上清液即可獲得同時(shí)含有多糖和蛋白的多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞抗原，該抗原經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，加入佐劑和硫柳汞，混勻后即為多殺性巴氏桿菌無(wú)細(xì)胞疫苗。
【文檔編號(hào)】A61K39/102GK104163858SQ201310181740
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月16日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司